Imagem Microscópica Eletrônica de Transmissão da Endocitose da Vesícula Sináptica em Neurônios do Hipocampo de Camundongos
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 5:41 min • April 28th, 2025
Comece tratando os neurônios do hipocampo de camundongos com um tampão de alto potássio contendo peroxidase de rábano ou HRP.
O potássio alto despolariza os neurônios pré-sinápticos, desencadeando a exocitose da vesícula sináptica. Os neurônios então recuperam as membranas das vesículas sinápticas por meio de endocitose, incorporando HRP nas vesículas recém-formadas. Fixe os neurônios com glutaraldeído e lave para remover o excesso de glutaraldeído.
Adicione peróxido de hidrogênio e um substrato cromogênico, que é oxidado por HRP para formar precipitados densos em elétrons. Lave para remover qualquer substrato que não tenha reagido.
Trate com tetróxido de ósmio para aumentar o contraste da membrana e, em seguida, lave o excesso de reagente. Em seguida, adicione acetato de uranila para aumentar o contraste da organela.
Desidrate os neurônios usando concentrações crescentes de etanol e incorpore-os em resina.
Identifique microscopicamente regiões densas em células e excise-as. Em seguida, prepare seções ultrafinas.
Transfira uma seção para uma grade de cobre e contra-cora-a com agentes de contraste.
Usando microscopia eletrônica de transmissão, as vesículas contendo HRP aparecem como estruturas elétron-densas.
Estimule a cultura de neurônios do hipocampo adicionando 1,5 mililitros de solução de estimulação com alto teor de potássio a cada poço em temperatura ambiente por 90 segundos. Nesta etapa, prepare um tampão de cacodilato de sódio 0,1 molar em pH 7,4. Fixe as células com glutaraldeído a 4% em tampão cacodilato de sódio 0,1 molar por pelo menos uma hora em temperatura ambiente.
Em seguida, lave as células três vezes com tampão cacodilato de sódio 0,1 molar de cada vez por sete minutos. Em seguida, prepare a solução DAB e filtre-a com o filtro de 0.22 micrômetro. Em seguida, aplique 1,5 mililitros de solução DAB nas células por 30 minutos a 37 graus Celsius.
Em seguida, lave as células três vezes com tampão cacodilato de sódio 0,1 molar de cada vez por sete minutos. Como pós-fixação, incubar os neurônios com 1,5 mililitros de tetróxido de ósmio a 1% em tampão cacodilato de sódio 0,1 molar por uma hora a quatro graus Celsius.
Depois, lave os neurônios três vezes com 1,5 mililitros de tampão cacodilato de sódio 0,1 molar de cada vez por sete minutos. Em seguida, prepare tampão de acetato de sódio 0,1 molar com acetato de sódio e ácido acético glacial. Lave as células três vezes com 1,5 mililitros de tampão acetato 0,1 molar de cada vez por sete minutos.
Depois disso, incube as células com 1,5 mililitros de acetato de uranila a 1% em tampão de acetato molar 0,1 por 1 hora a quatro graus Celsius. Em seguida, lave as células três vezes com 1,5 mililitros de tampão acetato 0,1 molar por sete minutos de cada vez. Em uma capela de exaustão, desidrate a cultura neuronal com lavagens únicas de 1,5 mililitros de etanol a 50%, 70% e 90% por sete minutos a cada lavagem, seguidas de três lavagens com 1,5 mililitros de etanol a 100% por sete minutos de cada vez.
Em seguida, crie a resina epóxi e misture bem e armazene-a sob vácuo para remover as bolhas de ar. Infiltre a amostra substituindo o etanol por resina epóxi a 50% em etanol em um agitador por 30 minutos em temperatura ambiente, depois resina epóxi a 70% e etanol por 30 minutos em temperatura ambiente em um agitador.
Troque a solução de resina epóxi por resina epóxi 100% e incube por 10 minutos a 50 graus Celsius. Realize duas trocas de resina epóxi 100% fresca. Cada troca é incubada por uma hora a 50 graus Celsius. Em seguida, adicione resina epóxi 100% fresca e deixe endurecer a 50 graus Celsius durante a noite e depois a 60 graus Celsius por mais de 36 horas.
Depois, remova cada amostra da placa de vários poços com o serrote do joalheiro. Usando um microscópio de luz invertida, selecione as regiões de interesse que possuem concentrações densas de células. Em seguida, corte os blocos de 4 por 5 por 8 milímetros cúbicos para seccionamento. Em seguida, contra-core as seções por submersão com acetato de uranila a 1% por 15 minutos e, em seguida, citrato aquoso de chumbo a 3% por 5 minutos para melhorar o contraste das amostras.
Visão Geral
Este artigo detalha um protocolo para estudar a dinâmica das vesículas sinápticas em neurônios do hipocampo de camundongo utilizando peroxidase do rabanete (HRP) e microscopia eletrônica de transmissão. A metodologia inclui estimulação com alto potássio, fixação e técnicas de inclusão para visualizar a exocitose e a endocitose das vesículas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Microscopia Eletrônica
Antecedentes
- Compreender a dinâmica das vesículas sinápticas é essencial para obter informações sobre a neurotransmissão.
- Os neurônios do hipocampo são modelos fundamentais para estudar a função sináptica.
- A HRP é comumente utilizada como traçador na microscopia eletrônica.
- Soluções com alto teor de potássio induzem despolarização e liberação de vesículas.
Objetivo do Estudo
- Investigar os mecanismos de exocitose e endocitose das vesículas sinápticas.
- Visualizar a incorporação de HRP nas vesículas após estimulação.
- Aprimorar a compreensão da comunicação neuronal na sinapse.
Métodos Utilizados
- Tratamento de neurônios com tampão de alto potássio e HRP.
- Fixação com glutaraldeído e tetróxido de ósmio.
- Inclusão em resina epóxi para microscopia eletrônica.
- Contracoloração para melhorar o contraste na imagem.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida de vesículas marcadas com HRP como estruturas eletrodensas.
- Demonstração dos mecanismos de recuperação de vesículas em neurônios estimulados.
- Melhoria do contraste das estruturas celulares por meio de protocolos específicos de coloração.
- Identificação de regiões sinápticas com concentrações densas de células.
Conclusões
- O protocolo revela efetivamente a dinâmica do comportamento das vesículas sinápticas.
- A HRP atua como uma ferramenta valiosa para rastrear as vias das vesículas.
- Os achados contribuem para a compreensão mais ampla da transmissão sináptica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a visualização direta do tráfego de vesículas sinápticas, fornecendo subsídios mecanicistas sobre a liberação e reciclagem de neurotransmissores. Para a descoberta de fármacos com foco em neurociência, ele auxilia na validação de alvos ao associar perturbações moleculares à dinâmica funcional das vesículas. A abordagem de imagem quantitativa aumenta a confiança preditiva na triagem inicial de compostos que afetam a função sináptica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Interroga hipóteses terapêuticas ao visualizar a incorporação de HRP em vesículas após estimulação, esclarecendo o acoplamento entre exocitose e endocitose.
- Valor Operacional: Fornece um ensaio reprodutível para avaliar a função do terminal pré-sináptico em modelos neuronais relevantes para doenças.
- Valor Preditivo: Permite a eliminação mecanicista de riscos em alvos que modulam o ciclo de vesículas, apoiando a triagem de portfólios com base em leituras funcionais.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do ensaio: Gera vesículas marcadas com HRP de densidade eletrônica como saídas quantificáveis para triagem de compostos em neurônios estimulados.
- Reprodutibilidade: Protocolos padronizados de fixação e coloração garantem visualização consistente de vesículas entre experimentos.
- Escalabilidade: Compatível com formatos de placas de múltiplas poças, permitindo testes paralelos de agentes farmacológicos sobre a dinâmica de vesículas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Utiliza neurônios do hipocampo em cultura, um modelo validado para o estudo da disfunção sináptica em distúrbios neurodegenerativos e neuropsiquiátricos.
- Continuidade Translacional: Conecta o engajamento do alvo molecular à recuperação funcional de vesículas, apoiando a validação pré-clínica do mecanismo de ação.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Quantifica alterações nas taxas de endocitose de vesículas, fornecendo critérios de prosseguir/interromper para compostos que visam vias sinápticas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta, desde o engajamento do alvo até a validação funcional, informando especificamente a otimização de compostos ativos por meio da medição direta do reciclamento de vesículas pré-sinápticas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao associar manipulações genéticas ou farmacológicas a alterações na cinética da endocitose de vesículas.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas baseadas em imagens da eficiência de recuperação de vesículas após estimulação com alto potássio.
- Análises: Permite a comparação estatística da densidade e distribuição de vesículas positivas para HRP entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Relaciona intervenções moleculares à função pré-sináptica em um sistema neuronal relevante para doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada de imagem aplicável a múltiplos alvos sinápticos e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao visualizar diretamente o tráfego de vesículas, aumentando a confiança nas relações entre alvo e sintoma.
- Valor Operacional: O protocolo padronizado garante reprodutibilidade entre diferentes locais e equipes, facilitando programas pré-clínicos multicêntricos.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de riscos associados a alvos sinápticos antes de estudos in vivo onerosos.
- Impacto sobre o Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de compostos com base em seus efeitos funcionais no ciclo de vesículas, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultivo neuronal, estimulação compatível com eletrofisiologia e preparação de amostras para microscopia eletrônica.
- Depende do acesso à microscopia eletrônica de transmissão e aos reagentes para marcação com HRP, fixação e coloração.
- Necessita de padronização no tempo de estimulação e fixação para garantir a consistência da marcação de vesículas entre os experimentos.
- A adaptação a outros tipos neuronais pode exigir a otimização dos parâmetros de estimulação e das condições de incubação com HRP.
- O rendimento é limitado pelo tempo de preparação das amostras, tornando-o mais adequado para validação mecanicista do que para triagem primária de alto rendimento.
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Última atualização: 29 agosto 2026