Imagem Microscópica Eletrônica de Transmissão da Endocitose da Vesícula Sináptica em Neurônios do Hipocampo de Camundongos

Comece tratando os neurônios do hipocampo de camundongos com um tampão de alto potássio contendo peroxidase de rábano ou HRP.

O potássio alto despolariza os neurônios pré-sinápticos, desencadeando a exocitose da vesícula sináptica. Os neurônios então recuperam as membranas das vesículas sinápticas por meio de endocitose, incorporando HRP nas vesículas recém-formadas. Fixe os neurônios com glutaraldeído e lave para remover o excesso de glutaraldeído.

Adicione peróxido de hidrogênio e um substrato cromogênico, que é oxidado por HRP para formar precipitados densos em elétrons. Lave para remover qualquer substrato que não tenha reagido.

Trate com tetróxido de ósmio para aumentar o contraste da membrana e, em seguida, lave o excesso de reagente. Em seguida, adicione acetato de uranila para aumentar o contraste da organela.

Desidrate os neurônios usando concentrações crescentes de etanol e incorpore-os em resina.

Identifique microscopicamente regiões densas em células e excise-as. Em seguida, prepare seções ultrafinas.

Transfira uma seção para uma grade de cobre e contra-cora-a com agentes de contraste.

Usando microscopia eletrônica de transmissão, as vesículas contendo HRP aparecem como estruturas elétron-densas.

Estimule a cultura de neurônios do hipocampo adicionando 1,5 mililitros de solução de estimulação com alto teor de potássio a cada poço em temperatura ambiente por 90 segundos. Nesta etapa, prepare um tampão de cacodilato de sódio 0,1 molar em pH 7,4. Fixe as células com glutaraldeído a 4% em tampão cacodilato de sódio 0,1 molar por pelo menos uma hora em temperatura ambiente.

Em seguida, lave as células três vezes com tampão cacodilato de sódio 0,1 molar de cada vez por sete minutos. Em seguida, prepare a solução DAB e filtre-a com o filtro de 0.22 micrômetro. Em seguida, aplique 1,5 mililitros de solução DAB nas células por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, lave as células três vezes com tampão cacodilato de sódio 0,1 molar de cada vez por sete minutos. Como pós-fixação, incubar os neurônios com 1,5 mililitros de tetróxido de ósmio a 1% em tampão cacodilato de sódio 0,1 molar por uma hora a quatro graus Celsius.

Depois, lave os neurônios três vezes com 1,5 mililitros de tampão cacodilato de sódio 0,1 molar de cada vez por sete minutos. Em seguida, prepare tampão de acetato de sódio 0,1 molar com acetato de sódio e ácido acético glacial. Lave as células três vezes com 1,5 mililitros de tampão acetato 0,1 molar de cada vez por sete minutos.

Depois disso, incube as células com 1,5 mililitros de acetato de uranila a 1% em tampão de acetato molar 0,1 por 1 hora a quatro graus Celsius. Em seguida, lave as células três vezes com 1,5 mililitros de tampão acetato 0,1 molar por sete minutos de cada vez. Em uma capela de exaustão, desidrate a cultura neuronal com lavagens únicas de 1,5 mililitros de etanol a 50%, 70% e 90% por sete minutos a cada lavagem, seguidas de três lavagens com 1,5 mililitros de etanol a 100% por sete minutos de cada vez.

Em seguida, crie a resina epóxi e misture bem e armazene-a sob vácuo para remover as bolhas de ar. Infiltre a amostra substituindo o etanol por resina epóxi a 50% em etanol em um agitador por 30 minutos em temperatura ambiente, depois resina epóxi a 70% e etanol por 30 minutos em temperatura ambiente em um agitador.

Troque a solução de resina epóxi por resina epóxi 100% e incube por 10 minutos a 50 graus Celsius. Realize duas trocas de resina epóxi 100% fresca. Cada troca é incubada por uma hora a 50 graus Celsius. Em seguida, adicione resina epóxi 100% fresca e deixe endurecer a 50 graus Celsius durante a noite e depois a 60 graus Celsius por mais de 36 horas.

Depois, remova cada amostra da placa de vários poços com o serrote do joalheiro. Usando um microscópio de luz invertida, selecione as regiões de interesse que possuem concentrações densas de células. Em seguida, corte os blocos de 4 por 5 por 8 milímetros cúbicos para seccionamento. Em seguida, contra-core as seções por submersão com acetato de uranila a 1% por 15 minutos e, em seguida, citrato aquoso de chumbo a 3% por 5 minutos para melhorar o contraste das amostras.