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Pegue uma câmara de imagem contendo tecido do plexo mioentérico do cólon de camundongo imobilizado, que abriga plexos ganglionares compostos por redes de neurônios entéricos e células gliais.
Essas células são marcadas com um indicador de cálcio que fluoresce após a ligação do cálcio.
Em seguida, coloque a câmara em um microscópio de fluorescência platina. Perfunda a câmara com um tampão pré-aquecido contendo inibidores para suprimir as contrações musculares durante a imagem.
Usando um microscópio, identifique regiões ganglionares saudáveis que exibem fluorescência uniforme.
Adquira imagens fluorescentes para medir a atividade basal, fornecendo uma referência para os níveis de cálcio intracelular.
Perfundir o tecido com um agonista do receptor para ativar os receptores neuronais, o que desencadeia o influxo intracelular de cálcio e um aumento na intensidade da fluorescência.
A ativação neuronal estimula indiretamente as células gliais circundantes, levando ao influxo de cálcio e a um subsequente aumento da fluorescência.
Capture imagens fluorescentes de lapso de tempo para medir mudanças na intensidade da fluorescência, que indicam a dinâmica do cálcio e a atividade de sinalização nos neurônios e nas células gliais em relação aos níveis basais.
Durante a incubação, faça um tampão de Kreb modificado de acordo com as instruções na parte escrita do protocolo e adicione 3 nicardipinas micromolares e 1 escopolamina micromolar para inibir as contrações musculares durante as dissecções de cálcio 2 mais imagens em dissecções de montagem inteira. Posicione a câmara de registro sob o microscópio fluorescente e, usando um sistema de perfusão por fluxo por gravidade com vários reservatórios de seringa aquecidos, estabeleça uma taxa de perfusão contínua de 2 a 3 mililitros por minuto de tampão de Kreb de 37 graus Celsius. Certifique-se de evitar a formação de bolhas de ar em ambos e na linha de sucção conectada a um coletor de vácuo. Traga o plexo desejado em foco sob iluminação de campo claro. Evite superexpor o tecido, o que pode levar ao fotobranqueamento.
Examine a carga de fluoróforo dentro dos gânglios e selecione gânglios saudáveis para obter imagens. Os gânglios danificados insalubres exibirão autofluorescência ou morfologia pontilhada e não devem ser usados para exames de imagem. Depois que um gânglio for selecionado, desvie o caminho da luz para a câmera e obtenha uma imagem ao vivo com o software de aquisição de imagem. Certifique-se de que o gânglio esteja em foco e defina a taxa de aquisição de imagem e os tempos de exposição.
As taxas e os tempos de aquisição de imagens variam de acordo com os eventos que os investigadores desejam registrar. Para a maioria dos experimentos, as imagens são tradicionalmente adquiridas a 0,5 a 1 hertz para células gliais e até 2 a 10 Hertz para neurônios, porque os transientes de cálcio glial não são tão rápidos quanto os neurônios transitórios de cálcio.
Inicie o registro e estabeleça a atividade fisiológica basal do gânglio escolhido na ausência de estímulos experimentais por 30 segundos. Em seguida, aplique medicamentos pré-aquecidos de interesse, como agonistas e antagonistas de receptores, usando o sistema de perfusão por fluxo por gravidade a uma taxa de 2 a 3 mililitros por minuto de acordo com um protocolo otimizado para o seu medicamento. Pare a gravação e veja o filme de lapso de tempo do experimento.
Selecione cuidadosamente as regiões de interesse, ou ROIs, usando o software de análise de imagem apropriado.
Finalmente, use o software de imagem apropriado para normalizar e comparar a intensidade de fluorescência das regiões de interesse com seu valor inicial de linha de base. As alterações na fluorescência normalizada são diretamente proporcionais às alterações no cálcio.
