Imagem e quantificação da regeneração axonal em neurônios ganglionares retinianos de ratos axotomizados

Pegue uma co-cultura de glia de revestimento olfativo humano imortalizado, ou células OEG, e neurônios ganglionares da retina de ratos axotomizados, ou RGNs, em uma lamínula.

As células OEG exibem propriedades neuroregenerativas que facilitam a regeneração axonal em RGNs.

Os RGNs são imunomarcados para que seus somas, ou corpos celulares, fluoresçam em vermelho enquanto seus axônios fluorescem em verde.

Usando a mídia de montagem, monte a lamínula contendo as células.

Use um microscópio de epifluorescência para capturar várias imagens de RGNs.

Abra uma imagem no software de imagem.

Quantifique a porcentagem de neurônios com os axônios em relação ao número total de RGNs.

Em seguida, trace um axônio começando do soma até o final e comece o rastreamento do axônio para determinar os comprimentos de todos os axônios.

Quantifique o índice de regeneração axonal dividindo a soma de todos os comprimentos axonais pelo número total de RGNs.

Monte as lamínulas com meio de montagem e mantenha-as a 4 graus Celsius. Use uma objetiva de 40 vezes de um microscópio de epifluorescência para quantificar a regeneração axonal. Quantifique a porcentagem de neurônios com axônios em relação à população total de neurônios ganglionares da retina.

Use o plugin NeuronJ no ImageJ para quantificar o índice de regeneração axonal, ou comprimento axonal médio, que é a soma dos comprimentos de todos os axônios identificados dividido pelo número total de neurônios contados, independentemente de apresentarem um axônio ou não. Após abrir a imagem, clique em Analisar e defina a escala de acordo com as configurações do microscópio, trabalhando em pixels por micrômetro. Selecione Adicionar rastreamentos para iniciar o rastreamento de axônios e, em seguida, rastreie os axônios do soma até o final. Clique em Medir traçados, exibir medições de rastreamento e executar.