배아 마우스에 Vasculature을 라벨링하는 방법

다음 실험의 전반적인 목표는 특정 유전적 돌연변이가 혈관 발달 및 구조에 미치는 영향을 결정하는 것입니다. 이는 배아와 여분의 배아 조직을 함께 해부하여 주입에 적합한 샘플을 제공함으로써 달성됩니다. 다음으로, 안면 정맥에 형광 염료를 주입하여 손상되지 않은 혈관 조직을 표시합니다.

그런 다음 배아를 분석할 준비를 합니다. 마지막으로, 구멍 마운트 또는 라벨링된 혈관 구조의 단면은 홀 마운트 또는 조직 섹션의 면역 형광 현미경 검사를 기반으로 정상 혈관 구조의 3차원 구조를 보여주는 이미지입니다. 제가 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올린 것은 말초 혈관 구조가 혈관 신생을 통해 흉선과 연결되는 발달 시점을 결정하는 데 관심이 있었을 때였습니다.

시작하려면 FXI 덱스트란 또는 GS L 하나를 준비하십시오 1.5 밀리리터 einor 튜브에서 PBS에서 B 4를 선택하고 100 마이크로 리터의 재고 1.25 밀리 몰 빠른 녹색 PBS를 FTSE 덱스트란에 추가하거나 180 마이크로 리터를 GS L 하나에 추가합니다. B 4를 선택하여 솔루션이 눈에 띄게 파란색이 되도록 합니다. 다음으로 튜브를 섭씨 37도까지 예열합니다.

E 14.5에서 E 18.5 배아와 난황 자루를 함께 해부하여 Allen Toic 줄기를 그대로 둡니다. 배아를 새 페트리 접시에 옮기고 실온에서 PBS에 담급니다. 다음으로 배아를 배치하여 얼굴의 시상면을 확인합니다.

그런 다음 마이크로 절개 겸자로 배아의 머리를 부드럽게 잡습니다. 30 게이지 바늘을 사용하여 50 마이크로 리터의 FXI 덱스트란 또는 GS L one one I 선택 B 4를 얼굴 정맥에 주입하고 바늘이 머리 뒤쪽을 향하도록 합니다. 염료가 제대 정맥에서 보이면 바늘을 제거하고 배아를 LAN에서 분리합니다.

토익 스토. 염료가 배아 전체를 순환할 수 있도록 배아를 실온에서 2-3분 동안 PBS에 그대로 둡니다. 염료가 배아 전체를 순환하도록 한 후 팔다리, 뒤쪽, 위 부위의 피부 샘플을 제거합니다.

차가운 PBS에서 피부 샘플을 씻고 4 % 파라 알데히드 PBS에 2 시간 동안 고정합니다. 그런 다음 2ml의 차가운 PBS와 함께 4ml의 투명한 바이알에 각각 10분씩 3번 씻습니다. 피부 샘플을 현미경 슬라이드에 놓고 각 슬라이드에 100마이크로리터의 장착 매체와 커버 슬립을 추가합니다.

BABB에서 이미징 클리어링하기 전에 슬라이드를 어둠 속에서 건조시키고 피부 혈관 구조의 고해상도 이미지를 위해 후속 컨포칼 이미징을 수행할 수 있습니다. 동결 절편을 위해 조직을 준비하려면 동결 절편을 위해 전체 배아를 액체 질소에 급속 동결합니다. 섹션 블록에 OCT를 펴고 배아를 장착합니다.

얼어붙은 조직을 10미크론 두께의 절편으로 자르고 슬라이드에 모읍니다. 아세톤으로 섹션을 5-10 분 동안 고정 한 다음 습도 챔버에서 TBS의 10 % 당나귀 세럼의 차가운 TBS 블록으로 세 번 씻습니다. 실온에서 각 섹션에 100마이크로리터의 1차 항체를 추가합니다.

이 예에서는 rat anti-US CD 31을 사용하여 내피를 라벨링하고 goat anti-US P-D-G-F-R beta를 사용하여 혈관 주위 세포를 라벨링하여 항체가 섹션 전체에 균일하게 퍼져 있는지 확인합니다. 개별적으로 절단된 파라 필름 스트립으로 슬라이드를 덮습니다. 슬라이드를 섭씨 4도의 습도 챔버에서 1시간에서 하룻밤 동안 배양합니다.

그런 다음 차가운 물로 섹션을 세 번 씻습니다. TBS는 100마이크로리터의 적절한 2차 항체로 최소 30분 동안 배양합니다. 마지막으로 차가운 TBS에서 세 번 세탁하고 각 슬라이드에 100마이크로리터의 장착 매체와 커버 유리를 추가합니다.

슬라이드를 어둠 속에서 말리십시오. 비브람 절편의 경우 배아에서 흉선엽을 절개하고 차가운 PBS로 헹굽니다. 2 시간 동안 실온에서 4 % paraldehyde PBS에 조직을 고정하십시오.

PBS Triton X에서 샘플을 세척 한 후 작은 플라스틱 카트리지에 4 % 낮은 용융물이 발생했습니다. PBS는 생성된 PBS에 샘플을 담그고 조직이 카트리지 바닥과 접촉하는지 확인합니다. 얼음 위에서 굳어지도록 하십시오.

그런 다음 면도날을 사용하여 과도한 아그로를 잘라냅니다. VIBRAM 블록에 접착제를 바르고 샘플을 블록에 부착합니다. 샘플과 블레이드가 잠길 때까지 차가운 PBS를 Vibram 수조에 붓습니다.

속도와 진폭을 설정합니다. 진폭을 줄여야 합니다. 과도한 교반으로 인해 절편이 끊어지면 조직의 50개 절편을 자릅니다.

그런 다음 집게를 사용합니다. 항 CD 31 및 항 P-D-G-F-R 베타와 같은 1 차 항체를 첨가 한 후 PBS Triton X의 10 % 당나귀 혈청 500 마이크로 리터의 절편을 30 분 동안 블록으로 차가운 PBS로 옮기고 섭씨 4도의 덮개가있는 마이크로 플레이트에서 8 시간에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로 PBS 트리톤 X에서 섭씨 4도에서 총 8시간 동안 3회 세척합니다.

절편을 다시 막고 2차 항체에서 배양한 후, PBS Triton X에서 섭씨 4도에서 총 8시간에 걸쳐 샘플을 3회 세척합니다. 그런 다음 얼음에서 30분 동안 4% 파알데히드 PBS에 샘플을 다시 고정하고 얼음에서 30분 이상 PBS Triton X로 3회 더 세척합니다. 등급이 매겨진 메탄올 PBS Triton X 시리즈를 통해 각 단계에서 10분 동안 샘플을 탈수합니다.

그런 다음 100% 메탄올을 새 메탄올로 교체하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 샘플을 유리 함몰 슬라이드에 넣고 샘플을 BABB와 메탄올의 일대일 용액으로 덮습니다. 샘플을 10-15분 동안 배양합니다.

다음으로, 용액을 100% BABB로 교체하고 실온에서 10-15분 동안 또는 깨끗해질 때까지 배양합니다. 커버 유리를 추가하고 매니큐어를 두세 번 바르십시오. 매니큐어가 실온의 어두운 곳에서 굳어지도록 하십시오.

샘플은 섭씨 4도에서 보관할 수 있지만 12시간에서 24시간 이내에 이미지를 촬영해야 합니다. 이미지: 컨포칼 현미경을 사용한 컨포칼 현미경으로 10미크론 동결 절편, 6, 33, 4, 88, 5, 5 43 나노미터 레이저 라인의 0.8 대물렌즈 생성, 채도당 플랜 A를 사용하여 50 미크론 아로 내장 절편 10 x 0.4, 4, 88, 5, 43 및 6, 33 나노미터 레이저 라인을 사용하여 연속 Z 절편을 획득, Zeiss AIA 비전 4.6 또는 이미지 분석을 사용하여 연속 Z 절편 재구성 배아 혈관 구조의 소프트웨어 효율적인 라벨링은 배아 마우스의 혈관 결함을 평가하는 데 중요합니다. 이 그림은 E 16.5 흉선 혈관의 특정 표지와 GS L I 선택의 공동 표지를 보여줍니다.

B 4는 CD 31을 주입한 배아와 좌심실의 염색을 가했습니다. 이 실험에는 극저온 절편을 위한 B 4 프로토콜에서 선택한 GSL이 사용되었습니다. E 16.5 마우스의 피부 혈관 네트워크의 홀 마운트 라벨링은 다음과 같습니다. 이 절차에 따릅니다.

기질 세포와 혈액 세포를 혈관 구조와 함께 공동 라벨링하는 것과 같은 다른 방법을 사용하여 다음과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다: 혈액 세포와 기질 세포는 정상 및 병리학적 조건 모두에서 마우스 배아의 혈관 구조와 어떻게 상호 작용합니까?