Name: FSL Constrói: Um método simples para modificar Cell / Virion superfícies com um intervalo de Marcadores Biológicos sem afectar a viabilidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprenda a modificar superfícies de células e virions com construtos FSL sem comprometer a viabilidade celular. Este método simples permite marcação rápida e estável para análises por microscopia e citometria de fluxo.

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Os autores agradecem Dan Bess da Sigma-Aldrich para apresentar o vídeo. Agradecemos também a Don Branch, Evgenii Cherny, Scott Chesla, Elizabeth Hadac, Amanda Harrison, Damien Heathcote, Annika Hult, Chuan-Ching Lan, Susannah McIntosh, Sarvani Komarraju, Elena Korchagina, Caroline Oliver, Martin Olsson, Stephen Parker, Igor Rodinov, Alexander Tuzikov, e Eleanor Williams para os seus resultados e contribuições para o projeto de síntese, de construções de FSL e determinar a atividade biológica.

O protocolo a seguir descreve o procedimento genérico para a inserção de construções FSL (Figura 1) em membranas biológicas. Para simplificar o protocolo só se referem às células (kodecytes), que estão em uma concentração de 100%. No entanto, as células termo é intercambiável com virions (kodevirions) ou organismos ou estruturas celulares e sua concentração em solvente não é importante, desde que seja sempre consistente entre os testes, controles e experimentos. Com os glóbulos vermelhos do volume globular é tipicamente 80%, mas com virions, embriões e outras células é normalmente menos de 1%. O método é muito robusto e irá produzir membranas modificado quando usado por qualquer de suas variações, mas refinamento será necessário para otimizar e padronizar o grau de modificação necessária para aplicações específicas. 1. Preparação de FSL Constrói <ol><li> Para preparar o FSL construir reconstituir solução estoque primeiro o produto FSL seca (Tabela 1) pela adição de 1,0 mL de diluente (ou conforme especificado na bula do produto) para o frasco do produto. Brevemente sonicate (30 segundos). Isso irá preparar uma solução de 1mg/mL, que pode ser aliquotado em 100 mL recipientes esterilizados e armazenados a 2-8 ° C por até uma semana, ou congelado por até 3 meses. </li><li> Para preparar a trabalhar FSL construir soluções para a inserção, pouco antes de usar brevemente sonicate (30 segundos) a solução estoque de homogeneizar qualquer micelas. Diluir a construir FSL em tampão (de preferência que não contenham lipídios ou material altamente hidrofóbicas) para a concentração necessária ou em uma faixa, se desejar. </li></ol> Notas: <ol><li> FSL constrói normalmente inserem em células em meios contendo lipídios, mas geralmente exigem tanto quanto um 50X concentrações mais altas de trabalho do que se FSL em PBS ou meio de lipídios outros livres. </li><li> As diluições faixa de trabalho vai depender da aplicação, a sensibilidade do método de detecção, o tipo de FSL construir, eo grau de modificação necessária. Tipicamente, a faixa de diluição será entre 10-500 mg de FSL por mL de diluente para construções de carboidratos FSL e 100-100 mg / mL para outras construções FSL, como fluoróforos e biotina. </li><li> Se preparando diluentes inserção contendo várias FSL construir, basta adicionar as construções juntos no mesmo diluente em sua concentração normal de trabalho. Se uma construção é a concentração muito mais elevada do que outro, algum ajuste (aumento) de concentração pode ser necessário para o menor construir. Alternativamente construções podem ser adicionados seqüencialmente, de preferência com a maior concentração construir primeiro lugar, seguido pelo menor. </li><li> Concentrações FSL construir acima de 1000 mcg / mL podem apresentar quantidades significativas de lipídios na membrana celular, e pode mudar a forma da célula ou torná-lo mais suscetível à lise. </li><li> FSL construir soluções de trabalho deve ser armazenado a 2-8 ° C e utilizada dentro de poucos dias. </li><li> Constrói FSL pode ser diluído em água, mas terá reduzido estabilidade e deve ser utilizado dentro de horas. Se a bula especifica água como diluente reconstituição, o produto no frasco também irá conter sais (conforme especificado na bula). </li></ol> 2. Inserção da FSL Construct (s) em Membranas <ol><li> Primeiro lave as células para FSL livre modificação de lipídios não ligado por centrifugação e usar PBS ou lipídios mídia celular livre como solução de lavagem. </li><li> Pacote de células ou suspender em 100 mL de diluente. </li><li> Simultaneamente preparar controles que, idealmente, deve ser ambas as células não modificadas (incubadas com PBS, em vez de solução FSL) e / ou células modificadas com um benigna, mas relacionadas FSL construir. </li><li> Adicionar 100 mL de uma diluição adequada de FSL solução (contendo um ou mais construções FSL) para as células e incubar por 1-2 horas a 37 ° C. Um resultado semelhante pode ser obtido por seis horas de incubação a 25 ° C ou durante a noite (18 horas) a 4 ° C - mistura é recomendada a cada poucas horas se suspensões de células pesados ​​são usados. </li><li> Wash (opcional) duas vezes com PBS ou mídia para remover quaisquer construções livres FSL e preparar uma suspensão apropriado. </li></ol> Notas: <ol><li> O diluente usado para suspender as células podem ser meios de cultura celular, PBS, soluções de armazenamento de células, etc, mas de preferência sem lipídios (por exemplo, soro fetal bovino) ou detergentes (por exemplo, TWEEN). </li><li> Volumes diferentes (de 100 mL) ratios (que 1:1 células / solução FSL) ou condições de incubação de tempo e temperatura podem ser utilizados desde a mesma proporção, concentração e volume são usados ​​para obter resultados reprodutíveis. </li></ol> 3. Manipulação e visualização <ol><li> Uma vez que o processo de modificação FSL foi concluída a kodecytes pode ser armazenado a 4-8 ° C em lipídios mídia livre ou usado. </li><li> Kodecytes e kodevirions geralmente se comportam da mesma como células sem modificações / virions e pode ser handled e visto sob sistemas de testes normal (microscopia, sorologia, citometria de fluxo, etc). Eles geralmente não têm requisitos especiais, exceto para evitar a solventes / detergentes / lipídios que podem eluir as construções de lipídios das membranas. </li></ol> Notas: <ol><li> Constrói permanecerá na membrana das células inativas, como glóbulos vermelhos, se armazenado em lipídios mídia livre para a vida da célula. Em células com membranas ativa as construções serão internalizadas e metabolizada, a uma taxa dependente da atividade da membrana celular. </li><li> Células mortas geralmente contêm altos níveis de construções FSL, o que pode ser usado para separar as células não viáveis ​​de células viáveis. </li><li> Se kodecytes são armazenadas (ou usado in vivo) em lipídios contendo media / ambientes, tais como soro / plasma construir o lentamente saem da membrana por um período de horas ou dias, dependendo da temperatura e concentrações de lipídios / composições. </li></ol> 4. Resultados representativos: <ol><li> Os resultados representante seguintes dependem da construção usados ​​(Tabela 1), a sua concentração e inserido a sensibilidade e especificidade relativa do sistema de detecção (s). Em geral todas as construções FSL irá inserir nas células após 1 hora, mas as condições ideais precisam ser estabelecidas para cada situação. </li><li> Constrói FSL pode ser usado para rotular o exterior de uma variedade de células vivas 3-9,11,14. Nos exemplos mostrados na Figura 2 embriões em estágios diferentes foram usados ​​(como são frágeis uma célula), mas outras células (Figura 3) ou virions envolvida (Figura 4) também podem ser rotulados. FSL-Fluoresceína permite a rotulagem direta de superfícies (Figuras 2-4), enquanto FSL-biotina e outras construções FSL pode exigir a utilização de um sistema de detecção secundário (normalmente avidina / anticorpos / lectinas) para mostrar a sua presença (Figuras 5) . </li><li> Marcadores de grupos sangüíneos, da especificidade humana ou animal pode ser anexado às células, incluindo células vermelhas 4-9 (Figura 6). Como a quantidade de FSL construir em um kodecyte é controlável e reprodutível 4-6, kodecytes para quantificação de anticorpos pode ser feita (Tabela 2 e Figura 6). A verdadeira fonte de células não é importante, eles podem ser qualquer espécie, ou mesmo da mesma origem como fonte de anticorpos, garantindo assim a antígeno apenas incompatível é o instituído pela FSL 7,8 (Figura 6). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3289/3289table2.jpg" alt="Tabela 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabela 2"> Tabela 2. Representante reações sorológicas de três diferentes FSL-A (tri) kodecytes células vermelhas testado contra diluições de anticorpo monoclonal anti-A. A solução 50 mM de FSL-A (tri), quando incubados com igual volume de células vermelhas produzidas grupo O forte Um células antígeno positivo, o que pode ser detectado por uma diluição 1:512 de anticorpos monoclonais anti-A. A 5 - e 10 vezes menor FSL-A (tri) soluções produzidas kodecytes com o grupo menos sangue A expressão do antígeno. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig1.jpg" alt="Visão geral do construto FSL" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Visão geral do construto FSL"> Figura 1. FSL visão geral construir. Como uma flor constrói FSL consiste em três componentes principais. O chefe funcional (F) no caso da construção FSL pode ser uma variedade de diferentes grupos biologicamente funcionais, um espaçador (S) para a indução de espaçamento de F longe da membrana, melhorar a dispersão de água e ser não-reativo com soro, enquanto os lipídios diacyl permite a construção de espontaneamente incorporar em superfícies. (I) FSL-GB3 com um grupo de sangue Gb 3 (ou P k) trissacarídeo Galα4Galβ4Glcβ epítopo. (II)-A FSL (tri), com um grupo sanguíneo A epítopo trissacarídeo GalNAcα3 (Fucα2) Galβ. (III) FSL-fluoresceína. (IV) FSL-biotina com uma porção única F biotina. O grupo funcional de estruturas em I-III são conjugados a um derivado ativado adipato de dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), enquanto o espaçador da estrutura IV é carboxymethylglycine-adipato base. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig2.jpg" alt="Embriões murinos marcados com FSL-Fluoresceína" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Embriões murinos marcados com FSL-Fluoresceína"> Figura 2. FSL-Fluoresceína rotulados embriões de camundongos. Todas as imagens são de embriões vivos que foram rotulados quando sua zona pelúcida (ZP) estava intacta (ie a construção FSL passaram pela ZP para rotular o embrião no interior). Imagens I-IV são de ZP-livre embriões liberados de suas ZP com ácido rotulagem pós tyrodes com FSL-fluoresceína. Coloração idêntica ocorre independentemente de embriões foram FSL modificado com ZP intacta ou livre ZP. Embriões são diretamente rotulados com FSL-fluoresceína, pela 2 horas 37 ° C no soro método de meios de cultura livre de células, lavadas e, em seguida, visto sob microscopia de fluorescência. (I) ZP livre embrião de duas células de camundongos, mostrando também a coloração do corpo clássico intensa polar. (II-III) ZP livre quatro células e oito embriões de células de camundongo, ambos mostrando coloração sombria das células que são outside avião o microscópio de foco. (IV) ZP livre embrião de 16 células de camundongos. (V) ZP intacta embriões murinos blastocisto (d4-d5) onde ambos embrião e zona são rotulados. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig3.jpg" alt="FSL-Fluoresceína e peixe-zebra" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="FSL-Fluoresceína e peixe-zebra"> Figura 3. FSL-Fluoresceína e zebrafish 14. (I) Microangiography em 52 larvas de peixe-zebra hpf (horas fecundação post) injetado diretamente na circulação com FSL-fluoresceína. A vasculatura zebrafish é manchada. (II) FSL-Fluoresceína heterogêneo Zebrafish células de rim de tecido (ZK kodecytes) foram criados ex vivo, em seguida, micro-injetado na circulação de um 52 Zebrafish destinatário hpf. Observações in vivo do kodecytes ZK foram feitas duas horas após a injeção por imagem do vasculatura sob fluorescência com o tempo de lapso de microscopia. É mostrado um quadro de vídeo com grandes células lento ou imóvel (indicado por setas laranja) e rápido células em movimento (imagens desfocadas devido ao movimento - indicado por setas verdes). Rotulagem permite em tempo real na observação in vivo do comportamento e da biodistribuição kodecytes ZK. (III) a absorção oral de FSL-Fluoresceína alcançado por imersão em embriões do zebrafish FSL-Fluoresceína contendo mídia para até 5 dias. Lavar roupa foi alcançado através da transferência de embriões em meios que não contenham construções FSL (pelo menos 6 horas é necessário, mas pode ser por vários dias). (IIIa) microscopia de campo brilhante do zebrafish FSL-Fluoresceína tratados correspondente à imagem ao lado de fluorescência (IIIb). O fluoresence foi localizado preferencialmente no trato intestinal. Coloração não foi observada em embriões controle sem tratamento (IVa e IVb). <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig4.jpg" alt="Marcagem FSL-Fluoresceína de vírions" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Marcagem FSL-Fluoresceína de vírions"> Figura 4. Rotulagem FSL-Fluoresceína de virions 10 VSV e H1N1. (I) vírus da estomatite vesicular (VSV) foi diretamente rotulados com 10 mg / ml FSL-Fluoresceína por 2 horas a 37 ° C, seguido de fixação com paraformaldeído 4% e, em seguida, citometria de fluxo. Nenhuma purificação do kodevirion VSV pós FSL rotulagem era necessário. (II) A citometria de fluxo de porcos infectados com células testiculares humana A / Puerto Rico/8/1934 (H1N1) kodevirions rotulados com FSL-fluoresceína. Células não infectadas são vistos como a linha preta, enquanto a fusão do kodevirion H1N1 com os resultados ST células em uma célula fluorescente (linha vermelha). <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig5.jpg" alt="Células marcadas com FSL-biotina" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Células marcadas com FSL-biotina"> Figura 5. FSL-biotina células marcadas e visualização posterior via avidina rotulados 7,8. Todas as células foram marcadas com FSL primeiro-biotina por 1 hora a 37 ° C, lavado em seguida, reagiu com fluoróforo rotulados avidina, lavados e úmidos montadas para microscopia de fluorescência. (I) Compilado imagem confocal de um blastocisto de embriões de camundongos. (II) fatia Central confocal do embrião a partir da imagem anterior. (III) Live espermatozóides móveis humano - indefinição ocorre como conseqüência de seu movimento. (IV) Fixo (inserção pós paraformaldeído 4%) espermatozóides humanos. (V) de eritrócitos humanos. (VI) Fixo (4% paraformaldeído pré-inserção) RL95 carcinoma endometrial humano. (VII) não fixadas RL95 linha celular humana endometrial carcinoma. (VIII) Biotina RBC kodecytes observada em uma amostra de sangue colhida 2 horas após a infusão intravenosa de kodecytes com (VIIIa), representando um campo visto sob microscopia de luz while (VIIIb) é o mesmo campo visto sob fluorescência, identificando os dois kodecytes presentes no campo de vista. Cálculo do rácio de kodecytes às células sem rótulo pode ser usado como um indicador de sobrevivência. (IX) Live humana kodecytes biotina endometrial visualizada por ligação a contas avidinylated. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig6.jpg" alt="FSL-Carboidrato para adicionar marcadores de grupo sanguíneo para perfil sorológico" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="FSL-Carboidrato para adicionar marcadores de grupo sanguíneo para perfil sorológico"> Figura 6. FSL-Carboidratos para adicionar marcadores grupo sanguíneo para o perfil sorológico. (I) Human kodecytes células vermelhas Galili foram criados com um conjunto de concentração FSL-Galili (500 mcg / mL) e testadas contra diluições de soro humano. Eritrócitos humanos não ocorrem naturalmente com o antígeno Galili xenoantigen. Kodecytes tal pode ser usado para níveis quantitativos de anticorpo no soro. Neste exemplo, o doador foi determinada a ter um título de anti-Galili de 1:32. (II) Ao criar kodecytes com diminuição dos níveis de FSL ("títulos de antígeno"), um nível ideal de antígeno para detectar anticorpos pode ser determinado (neste exemplo Le a). As células podem ser criados apenas para dar um resultado positivo quando o nível de anticorpos excede um título específico. O nível de FSL antígeno necessária para dar um resultado positivo depende da qualidade e do nível de anticorpo a ser detectado. Para antígenos de carboidratos, uma solução FSL de 100 mcg / ml costumam resultar em uma forte reação positiva. (III) Human grupo de células vermelhas O foram modificados para ter um nível específico de Uma formigaigen (padronizado A kodecytes), e usado para quantificar de forma precisa e reproduzível anti-A no soro humano. Neste exemplo o anti-A título no soro testado O grupo é 1:32 e as kodecytes foram preparadas a partir do doador próprios glóbulos vermelhos. (IV) do grupo sanguíneo A e B antígenos simultaneamente inserido em um grupo O único amostra de células vermelhas são usadas para criar um kodecytes B fraco fraco. Estes kodecytes pode ser usado para fins de controle de qualidade ABO. Este resultado mostra a análise de um formulado especificamente kodecyte B Um fraco fraco testado contra os reagentes anti-A e anti-B e dá esperava reações fracas.

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</ol>

Deborah A. em branco e Stephen M. Henry são funcionários e acionistas da Kode Biotech limitada ao detentor da patente da tecnologia Kode. Dan Bess é um funcionário da Sigma-Aldrich, que patrocinou a produção deste vídeo-artigo.

Células modificando e virions com construções FSL é uma técnica muito simples e robusto 3-11. Para descrever e distinguir FSL construir células modificadas e virions a partir de células não modificado, eles são chamados kodecytes e kodevirions respectivamente 60-10, mas somente quando o grupo apresentou funcional pode ser mostrado para estar presente em sua membrana. Quando kodecytes são feitos com diferentes concentrações de construções FSL, eles podem ser referidos pela concentração da solução de construir FSL usado para criá-los, por exemplo, 15 mcg / mL A kodecytes, ou se mais de um FSL é usado, então, um termo combinados, por exemplo, A + biotina kodecytes 7,8. Quando as células diferentes podem ser comparados, incluindo o tipo de célula na descrição é recomendado, por exemplo, de células vermelhas kodecytes biotina ou kodecytes biotina endometrial 7,8. Embora o processo de inserção é muito robusto e de inserção (embora com taxas diferentes) ocorrerá em um amplo intervalo de temperatura 4-37 ° C e dentro de minutos a horas, para obter o controle de inserção reprodutíveis estrita de tempo de contato, temperatura, concentração FSL ( incluindo a formulação de diluente), e, em menor grau de concentração de células são obrigatórios. Até à data, todas as construções FSL pode ser usado para modificar as células através da mesma técnica 4-11, no entanto espera-se que certas condições serão mais favoráveis ​​para o fluxo de trabalho e / ou os requisitos ótimo manuseio das células / virions a ser modificado . A concentração FSL exata para alcançar o efeito desejado precisa ser determinado pelo usuário 4. A FSL resultante construir células modificadas / virions geralmente pode ser usado da mesma maneira como uma célula sem modificações / virion em sistemas biológicos ou analítica 4-11. Como as construções FSL eluir lentamente a partir de superfícies modificada quando em contato com soluções de lipídios 7,8, ou ser consumido por células ativas 11, estas questões devem ser consideradas com relação ao nível de sinal ou atividade obtidos ao longo de períodos de tempo. Kodecytes pode ser fixo (por exemplo, glutaraldeído / formol) após a inserção, desde que o fixador não contém lipídios eluidor de solventes eo grupo funcional é compatível com o fixador. Alternativamente células fixas podem ser modificadas com construções FSL. Além da modificação da superfície das células e virion constrói FSL também pode ser infundido diretamente na circulação de animais de laboratório causando na modificação in vivo de células circulantes 7 e para inibir vírus 12, toxinas, 12 e anticorpos 7. FLS construções também foram usadas para decorar lipossomas e podem ser impressos em superfícies de papel 13, onde se imobilizar, e pode então ser usada em ensaios de diagnóstico. A capacidade de facilmente modificar células vivas com uma gama crescente de construções FSL deve provar ser uma pesquisa útil e ferramenta de desenvolvimento para o estudo da biologia superfície da célula.

<img src="/files/ftp_upload/3289/3289table1.jpg" alt="Tabela 1"> Tabela 1. Construções disponíveis comercialmente FSL descrito neste artigo.

fsl constrói: um método simples para modificar cell / virion superfícies com um intervalo de marcadores biológicos sem afectar a viabilidade

FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability

A capacidade de modificar / visualizar superfícies biológicas, e depois estudar a célula modificada / virion em uma gama de in vitro e in vivo ambientes é essencial para ganhar mais conhecimentos sobre a função de moléculas específicas ou a entidade inteira. Estudos de modificação da superfície biológicos são geralmente limitados a engenharia genética do organismo ou a ligação covalente de metades químicos para a superfície da célula 1,2. No entanto, estas técnicas tradicionais expor a célula de reagentes químicos, ou que exigem manipulação significativa para alcançar o resultado desejado, tornando-pesado, e eles também podem inadvertidamente afetar a viabilidade / funcionalidade da célula modificada. Um método simples para harmlessly modificar a superfície de células é necessário. Recentemente uma nova tecnologia, Tecnologia Kode lançou uma série de construções de novas constituído por três componentes: um grupo cabeça funcional (F), um espaçador (S) e uma cauda de lipídios (L) e são conhecidos como Função-Espaçador Lipid ou FSL constructs3. O espaçador (S) é selecionada para fornecer uma construção que é dispersível em água, ainda assim de forma espontânea e estável incorporar em uma membrana. FSL construir metades funcional (F) até agora incluem uma gama de sacarídeos incluindo grupo sanguíneo relacionados determinantes, ácidos siálicos, polissacarídeos de ácido hialurônico, fluoróforos, biotina, radiolabels, e uma variedade de peptídeos 3-12. FSL construções têm sido usados ​​em embriões modificando, espermatozóides, peixe-zebra, células epiteliais / endometrial, as células vermelhas do sangue, e virions para criar sistemas de controles de qualidade e painéis de diagnóstico, para modificar a adesão celular / interação / separação / imobilização, e para in vitro e in vivo de imagens de células / virions 3-12. O processo de modificar células / virions é genérica e extremamente simples. O procedimento mais comum é a incubação de células (em lipídios mídia livre) com uma solução para FSL constrói por 1-2 horas a 37 ° C 4-10. Durante a incubação, a FSL constrói espontaneamente incorporar na membrana, eo processo está completo. Lavagem é opcional. Células modificadas por construções de FSL são conhecidos como kodecytes 6-9, enquanto virions são kodevirions 10. FSL constrói como infusões diretos e kodecytes / kodevirions têm sido utilizados em modelos animais experimentais 7,8,10. Todos os kodecytes / kodevirions parecem manter a sua vitalidade normal e funcionalidade ao ganhar a nova função da fracção F 7,8,10,11. A combinação de dispersão em meios biocompatíveis, incorporação espontânea em membranas celulares, e baixa toxicidade aparente, faz FSL construções valiosas ferramentas de pesquisa para o estudo de células e virions.

Função Espaçador Lipid (FSL) constrói permitir as características da superfície de células vivas e virions ser modificado sem perda de vitalidade. O método requer apenas simples contato de uma solução de construção de uma célula com FSL / virion e incorporação de superfície espontânea e estável ocorre.

FSL Constrói: Um método simples para modificar Cell / Virion superfícies com um intervalo de Marcadores Biológicos sem afectar a viabilidade

A capacidade de modificar/visualizar superfícies biológicas e, em seguida, estudar a célula/virion modificado em diversos ambientes in vitro e in vivo é essencial...

O objetivo geral deste procedimento é rotular de forma segura e rápida as superfícies de células vivas ou S com construtos bioativos. Isso é realizado primeiramente preparando uma solução de espaçador funcional, lipídio ou construto FSL. Em seguida, uma parte igual da solução de construto é misturada com uma parte igual da solução de células ou VIRs.Como terceiro passo, a mistura é incubada por 60 minutos a 37 graus Celsius. O passo final é lavar as células modificadas ou cíticas ou VIRs modificados ou VIRs e utilizá-los experimentalmente como de costume. Em última análise, células vivas com superfície modificada ou S podem ser visualizadas por meio de todas as técnicas rotineiras de análise experimental, incluindo citometria de fluxo, microscopia e aglutinação.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a marcação covalente, é que ela é rápida, robusta, flexível e não afeta a vitalidade da célula modificada ou do Varian. Para preparar a solução estoque do construto FSL, adicione primeiro um mililitro de diluente ao frasco do produto para reconstituir o produto FSL seco, criando uma solução estoque de um miligrama por mililitro. Sonique o frasco por 30 segundos, alíquotas da solução estoque em recipientes estéreis de 100 microlitros e armazene os recipientes entre dois e oito graus Celsius por até uma semana.Para preparar soluções de trabalho de construtos FSL para inserção logo antes do uso, sonique novamente a solução por 30 segundos para homogeneizar quaisquer agregados, em seguida dilua o construto FSL e o tampão até a concentração necessária. Armazene a solução de trabalho entre dois e oito graus Celsius por até uma semana após a ressuspensão em meio livre de lipídios ou PBS. Centrifugue as células para remoção de lipídios não ligados antes da modificação com FSL. Em seguida, ressuspenda as células em 100 microlitros de diluente e lave as células para os controles nas mesmas condições até obter 100 microlitros de células não modificadas.Adicione 100 microlitros de uma diluição apropriada da solução FSL, se desejado. Em paralelo, prepare também controles negativos com soluções FSL não relacionadas e/ou PBS. Em seguida, incube todos os subconjuntos celulares por uma hora a 37 graus Celsius após a incubação.Lave todas as células duas vezes com meio livre de lipídios ou PBS para remover quaisquer constructos FSL livres e prepare uma suspensão apropriada em meio livre de lipídios. Uma vez concluído o processo de modificação com FSL, os coys podem ser armazenados entre quatro e oito graus Celsius como uma flor. Os constructos FSL são compostos por três componentes principais, a cabeça funcional ou F, que pode ser uma variedade de grupos funcionalmente biológicos.O espaçador RS foi projetado para induzir o afastamento da cabeça funcional da membrana, a fim de melhorar a dispersão em água, e para ser não reativo com soro humano e com o lipídio DAL ou L, o que permite que o construto se incorpore espontaneamente nas superfícies quatro. Grupos FSL representativos são mostrados nas cinco imagens a seguir. Embriões murinos vivos foram diretamente marcados com FSL fluoresceína pelo método de duas horas a 37 graus Celsius em meio de cultura celular livre de soro, lavados e então observados por microscopia de fluorescência.Nesta primeira imagem, pode-se observar um embrião em espelho de duas células livre de zop palita. A coloração intensa no meio do embrião representa uma coloração clássica do corpúsculo polar. Nas próximas duas imagens, são mostrados embriões em espelho de quatro e oito células livres de zop palita, que exibem coloração difusa nas células localizadas fora do plano de foco do microscópio.Uma imagem de um embrião espelhado livre de zop palita com 16 células é mostrada nesta última imagem de embriões espelhados vivos marcados com fluoresceína FSL, e embriões blastocistos espelhados intactos com quatro a cinco dias de idade, ambos com marcação no embrião e no zop LUCITA, são exibidos nesta próxima série de imagens. É mostrada a marcação com fluoresceína FSL em peixe-zebra. Esta primeira imagem é de uma microangiografia de larvas de peixe-zebra com 52 horas pós-fertilização, nas quais a fluoresceína FSL foi injetada diretamente na circulação.A coloração da vasculatura do peixe-zebra pode ser observada aqui. FSL fluoresceína, células heterogêneas de tecido renal de peixe-zebra ou cítos ZK foram criados ex vivo e, em seguida, microinjetados na circulação de um peixe-zebra receptor com 52 horas pós-fertilização. Observações in vivo dos cítos ZK foram realizadas duas horas após a injeção, por meio da imagem da vasculatura em fluorescência com microscopia de lapso de tempo. É mostrado um único quadro de vídeo com grandes células de movimento lento ou imóveis indicadas por setas laranjas e células de movimento rápido, que apareceram borradas devido ao seu deslocamento, indicadas por setas verdes. Nesta imagem, é mostrada a marcação com FSL fluoresceína por captação oral do construto, obtida pela imersão de embriões de peixe-zebra em meio contendo FSL fluoresceína por até cinco dias.A microscopia de campo claro do peixe-zebra tratado com fluoresceína FSL à esquerda corresponde à imagem fluorescente adjacente à direita. A fluorescência foi localizada preferencialmente no trato intestinal. Nenhuma coloração foi observada nos embriões controle não tratados mostrados aqui.Aqui, o vírus da estomatite vesicular ou VSV, marcado diretamente com 10 microgramas por mililitro de fluoresceína FSL por duas horas a 37 graus Celsius, seguido de fixação com paraformaldeído a 4%, e depois analisado por varredura de fatores, é mostrado sem purificação do vírion VSV. A marcação pós-FSL foi necessária. Este histograma mostra células testiculares suínas infectadas com o vírus influenza A de Porto Rico 8 19 34 ou H1N1 marcado com fluoresceína FSL.Células não fluorescentes não infectadas são representadas pela linha preta, enquanto a fusão do coron H um N um com as células suínas, que resultou em fluorescência, é indicada pela linha vermelha. Nesta próxima série de imagens, as células foram primeiramente marcadas com biotina FSL por uma hora a 37 graus Celsius, depois lavadas e reagidas com avidina marcada com Fluor quatro, seguidas de lavagem e montagem úmida para microscopia de fluorescência. A primeira imagem mostra uma imagem confocal composta de blastocistos de embrião murino, e esta figura mostra uma fatia confocal central do embrião a partir da imagem anterior.Aqui estão humanos móveis com espermatozoides vivos. O desfoque ocorre como consequência de seu movimento. Uma imagem representativa mais nítida de espermatozoides humanos fixados em paraformaldeído 4% após a inserção pode ser vista nesta figura aqui.Eritrócitos humanos marcados com biotina FSL são mostrados após fixação com 4% paraformaldeído; a presinserção não afeta a marcação com FSL, conforme ilustrado nas duas figuras a seguir. Aqui, podem ser observadas células de carcinoma endometrial humano RL 95 fixadas com 4% paraformaldeído. Enquanto nesta imagem, as células de carcinoma endometrial humano RL 95 não foram fixadas. Praticamente nenhuma diferença na marcação é observada entre as duas imagens, com ou sem fixação.Células sanguíneas vermelhas marcadas com biotina FSL observadas em uma amostra de sangue coletada duas horas após a infusão intravenosa das células são mostradas aqui à esquerda; as células foram visualizadas por microscopia de luz à direita, e o mesmo campo de células foi observado por fluorescência, onde as duas células presentes podem ser identificadas em verde. O cálculo da proporção entre as células marcadas e as não marcadas pode ser utilizado como indicador de sobrevivência. Esta última imagem de células endometriais humanas vivas marcadas com biotina mostra células visualizadas por ligação a microesferas revestidas com anticorpos.Esta série final de imagens mostra as interações do construto FSL com marcadores de grupo sanguíneo. A primeira imagem é de células vermelhas humanas GLI revestidas com uma concentração de 500 microgramas por mililitro de FSLG testada contra diluições de soro humano. As células vermelhas humanas não reagem naturalmente com o antígeno Xena GALI.Assim sendo, os citos podem ser utilizados para quantificar os níveis de anticorpos no soro. Neste exemplo, determinou-se que o paciente possuía uma titulação de antiga de um para 32, criando-se citos com níveis decrescentes de FSL. De forma semelhante à criação de uma titulação de antígeno, pode-se determinar um nível ótimo de antígeno para detectar o anticorpo; podem-se criar células que apresentem resultado positivo apenas quando o nível de anticorpo exceder um título específico.O nível de antígeno FSL necessário para gerar um resultado positivo depende da qualidade e da quantidade de anticorpo que está sendo detectado. Normalmente, para antígenos carboidratos, uma solução FSL de 100 microgramas por mililitro resultará em uma reação positiva forte. Hemácias humanas do grupo O modificadas para conter um nível específico de antígeno a são chamadas de padronizadas.Os cítions são utilizados para quantificar com precisão e reprodutibilidade os anti-A no soro humano. Neste exemplo, os cítions foram preparados a partir das próprias hemácias do doador e o nível de anti-A no soro do grupo O testado foi de um para 32. Aqui mostrado, no sexto tubo, antígenos dos grupos sanguíneos A e B foram simultaneamente inseridos numa única amostra de hemácias do grupo O para criar cítions A fraco, B fraco.Essas hemácias podem ser usadas para fins de controle de qualidade em VO. A análise das hemácias formuladas especificamente para a semana A e para a semana B, testadas contra reagentes anti-A e anti-B, apresenta as reações fracas esperadas, conforme evidenciado nesta figura, com as reações ocorrendo na região inferior central dos tubos. Esta técnica simples pode ser realizada em duas horas, se for executada corretamente.

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