FSL Constrói: Um método simples para modificar Cell / Virion superfícies com um intervalo de Marcadores Biológicos sem afectar a viabilidade

O objetivo geral deste procedimento é rotular de forma segura e rápida as superfícies de células vivas ou S com construtos bioativos. Isso é realizado primeiramente preparando uma solução de espaçador funcional, lipídio ou construto FSL. Em seguida, uma parte igual da solução de construto é misturada com uma parte igual da solução de células ou VIRs.

Como terceiro passo, a mistura é incubada por 60 minutos a 37 graus Celsius. O passo final é lavar as células modificadas ou cíticas ou VIRs modificados ou VIRs e utilizá-los experimentalmente como de costume. Em última análise, células vivas com superfície modificada ou S podem ser visualizadas por meio de todas as técnicas rotineiras de análise experimental, incluindo citometria de fluxo, microscopia e aglutinação.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a marcação covalente, é que ela é rápida, robusta, flexível e não afeta a vitalidade da célula modificada ou do Varian. Para preparar a solução estoque do construto FSL, adicione primeiro um mililitro de diluente ao frasco do produto para reconstituir o produto FSL seco, criando uma solução estoque de um miligrama por mililitro. Sonique o frasco por 30 segundos, alíquotas da solução estoque em recipientes estéreis de 100 microlitros e armazene os recipientes entre dois e oito graus Celsius por até uma semana.

Para preparar soluções de trabalho de construtos FSL para inserção logo antes do uso, sonique novamente a solução por 30 segundos para homogeneizar quaisquer agregados, em seguida dilua o construto FSL e o tampão até a concentração necessária. Armazene a solução de trabalho entre dois e oito graus Celsius por até uma semana após a ressuspensão em meio livre de lipídios ou PBS. Centrifugue as células para remoção de lipídios não ligados antes da modificação com FSL. Em seguida, ressuspenda as células em 100 microlitros de diluente e lave as células para os controles nas mesmas condições até obter 100 microlitros de células não modificadas.

Adicione 100 microlitros de uma diluição apropriada da solução FSL, se desejado. Em paralelo, prepare também controles negativos com soluções FSL não relacionadas e/ou PBS. Em seguida, incube todos os subconjuntos celulares por uma hora a 37 graus Celsius após a incubação.

Lave todas as células duas vezes com meio livre de lipídios ou PBS para remover quaisquer constructos FSL livres e prepare uma suspensão apropriada em meio livre de lipídios. Uma vez concluído o processo de modificação com FSL, os coys podem ser armazenados entre quatro e oito graus Celsius como uma flor. Os constructos FSL são compostos por três componentes principais, a cabeça funcional ou F, que pode ser uma variedade de grupos funcionalmente biológicos.

O espaçador RS foi projetado para induzir o afastamento da cabeça funcional da membrana, a fim de melhorar a dispersão em água, e para ser não reativo com soro humano e com o lipídio DAL ou L, o que permite que o construto se incorpore espontaneamente nas superfícies quatro. Grupos FSL representativos são mostrados nas cinco imagens a seguir. Embriões murinos vivos foram diretamente marcados com FSL fluoresceína pelo método de duas horas a 37 graus Celsius em meio de cultura celular livre de soro, lavados e então observados por microscopia de fluorescência.

Nesta primeira imagem, pode-se observar um embrião em espelho de duas células livre de zop palita. A coloração intensa no meio do embrião representa uma coloração clássica do corpúsculo polar. Nas próximas duas imagens, são mostrados embriões em espelho de quatro e oito células livres de zop palita, que exibem coloração difusa nas células localizadas fora do plano de foco do microscópio.

Uma imagem de um embrião espelhado livre de zop palita com 16 células é mostrada nesta última imagem de embriões espelhados vivos marcados com fluoresceína FSL, e embriões blastocistos espelhados intactos com quatro a cinco dias de idade, ambos com marcação no embrião e no zop LUCITA, são exibidos nesta próxima série de imagens. É mostrada a marcação com fluoresceína FSL em peixe-zebra. Esta primeira imagem é de uma microangiografia de larvas de peixe-zebra com 52 horas pós-fertilização, nas quais a fluoresceína FSL foi injetada diretamente na circulação.

A coloração da vasculatura do peixe-zebra pode ser observada aqui. FSL fluoresceína, células heterogêneas de tecido renal de peixe-zebra ou cítos ZK foram criados ex vivo e, em seguida, microinjetados na circulação de um peixe-zebra receptor com 52 horas pós-fertilização. Observações in vivo dos cítos ZK foram realizadas duas horas após a injeção, por meio da imagem da vasculatura em fluorescência com microscopia de lapso de tempo. É mostrado um único quadro de vídeo com grandes células de movimento lento ou imóveis indicadas por setas laranjas e células de movimento rápido, que apareceram borradas devido ao seu deslocamento, indicadas por setas verdes. Nesta imagem, é mostrada a marcação com FSL fluoresceína por captação oral do construto, obtida pela imersão de embriões de peixe-zebra em meio contendo FSL fluoresceína por até cinco dias.

A microscopia de campo claro do peixe-zebra tratado com fluoresceína FSL à esquerda corresponde à imagem fluorescente adjacente à direita. A fluorescência foi localizada preferencialmente no trato intestinal. Nenhuma coloração foi observada nos embriões controle não tratados mostrados aqui.

Aqui, o vírus da estomatite vesicular ou VSV, marcado diretamente com 10 microgramas por mililitro de fluoresceína FSL por duas horas a 37 graus Celsius, seguido de fixação com paraformaldeído a 4%, e depois analisado por varredura de fatores, é mostrado sem purificação do vírion VSV. A marcação pós-FSL foi necessária. Este histograma mostra células testiculares suínas infectadas com o vírus influenza A de Porto Rico 8 19 34 ou H1N1 marcado com fluoresceína FSL.

Células não fluorescentes não infectadas são representadas pela linha preta, enquanto a fusão do coron H um N um com as células suínas, que resultou em fluorescência, é indicada pela linha vermelha. Nesta próxima série de imagens, as células foram primeiramente marcadas com biotina FSL por uma hora a 37 graus Celsius, depois lavadas e reagidas com avidina marcada com Fluor quatro, seguidas de lavagem e montagem úmida para microscopia de fluorescência. A primeira imagem mostra uma imagem confocal composta de blastocistos de embrião murino, e esta figura mostra uma fatia confocal central do embrião a partir da imagem anterior.

Aqui estão humanos móveis com espermatozoides vivos. O desfoque ocorre como consequência de seu movimento. Uma imagem representativa mais nítida de espermatozoides humanos fixados em paraformaldeído 4% após a inserção pode ser vista nesta figura aqui.

Eritrócitos humanos marcados com biotina FSL são mostrados após fixação com 4% paraformaldeído; a presinserção não afeta a marcação com FSL, conforme ilustrado nas duas figuras a seguir. Aqui, podem ser observadas células de carcinoma endometrial humano RL 95 fixadas com 4% paraformaldeído. Enquanto nesta imagem, as células de carcinoma endometrial humano RL 95 não foram fixadas. Praticamente nenhuma diferença na marcação é observada entre as duas imagens, com ou sem fixação.

Células sanguíneas vermelhas marcadas com biotina FSL observadas em uma amostra de sangue coletada duas horas após a infusão intravenosa das células são mostradas aqui à esquerda; as células foram visualizadas por microscopia de luz à direita, e o mesmo campo de células foi observado por fluorescência, onde as duas células presentes podem ser identificadas em verde. O cálculo da proporção entre as células marcadas e as não marcadas pode ser utilizado como indicador de sobrevivência. Esta última imagem de células endometriais humanas vivas marcadas com biotina mostra células visualizadas por ligação a microesferas revestidas com anticorpos.

Esta série final de imagens mostra as interações do construto FSL com marcadores de grupo sanguíneo. A primeira imagem é de células vermelhas humanas GLI revestidas com uma concentração de 500 microgramas por mililitro de FSLG testada contra diluições de soro humano. As células vermelhas humanas não reagem naturalmente com o antígeno Xena GALI.

Assim sendo, os citos podem ser utilizados para quantificar os níveis de anticorpos no soro. Neste exemplo, determinou-se que o paciente possuía uma titulação de antiga de um para 32, criando-se citos com níveis decrescentes de FSL. De forma semelhante à criação de uma titulação de antígeno, pode-se determinar um nível ótimo de antígeno para detectar o anticorpo; podem-se criar células que apresentem resultado positivo apenas quando o nível de anticorpo exceder um título específico.

O nível de antígeno FSL necessário para gerar um resultado positivo depende da qualidade e da quantidade de anticorpo que está sendo detectado. Normalmente, para antígenos carboidratos, uma solução FSL de 100 microgramas por mililitro resultará em uma reação positiva forte. Hemácias humanas do grupo O modificadas para conter um nível específico de antígeno a são chamadas de padronizadas.

Os cítions são utilizados para quantificar com precisão e reprodutibilidade os anti-A no soro humano. Neste exemplo, os cítions foram preparados a partir das próprias hemácias do doador e o nível de anti-A no soro do grupo O testado foi de um para 32. Aqui mostrado, no sexto tubo, antígenos dos grupos sanguíneos A e B foram simultaneamente inseridos numa única amostra de hemácias do grupo O para criar cítions A fraco, B fraco.

Essas hemácias podem ser usadas para fins de controle de qualidade em VO. A análise das hemácias formuladas especificamente para a semana A e para a semana B, testadas contra reagentes anti-A e anti-B, apresenta as reações fracas esperadas, conforme evidenciado nesta figura, com as reações ocorrendo na região inferior central dos tubos. Esta técnica simples pode ser realizada em duas horas, se for executada corretamente.