FSL Constrói: Um método simples para modificar Cell / Virion superfícies com um intervalo de Marcadores Biológicos sem afectar a viabilidade

O objetivo geral deste procedimento é rotular de forma inofensiva e rápida as superfícies de células vivas ou S com construções bioativas. Isso é feito preparando primeiro uma solução de construção de espaçador de função, lipídio ou FSL. Em seguida, uma parte igual da solução de construção é misturada com uma parte igual da solução de células ou VIRs.

Como terceira etapa, a mistura é incubada por 60 minutos a 37 graus Celsius. A etapa final é lavar as células ou citos modificados ou VIRs modificados ou VIRs e usá-los experimentalmente como de costume. Em última análise, as células vivas modificadas na superfície ou S podem ser visualizadas por meio de todas as técnicas de análise experimental de rotina, incluindo citometria de fluxo, microscopia e aglutinação.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a marcação covalente, é que ela é rápida, robusta, flexível e não afeta a vitalidade da célula modificada ou da Varian. Para preparar a solução estoque de construção FSL primeiro, adicione um mililitro de diluente ao arquivo do produto para reconstituir o produto FSL seco, criando uma solução estoque de um miligrama por mililitro. Sonicar o frasco para injetáveis durante 30 segundos, alíquota do caldo para recipientes estéreis de 100 microlitros e armazenar os recipientes a dois a oito graus Celsius durante uma semana.

Para preparar soluções de construção FSL de trabalho para inserção imediatamente antes do uso, sonicate a solução novamente por 30 segundos para homogeneizar quaisquer células MIS, depois dilua a construção FSL e tampão até a concentração necessária. Armazene a solução de trabalho a dois a oito graus Celsius por até uma semana após a suspensão de Resus em meio livre de lipídios ou centrifugue PBS as células para modificação de FSL livres de lipídios não ligados. Em seguida, embale as células em 100 microlitros de diluente, lave as células para os controles nas mesmas condições para 100 microlitros de células não modificadas.

Adicione 100 microlitros de uma diluição apropriada da solução FSL, se desejar. Em paralelo, também crie controles negativos com soluções FSL não relacionadas e/ou PBS. Em seguida, incube todos os subconjuntos de células por uma hora a 37 graus Celsius após a incubação.

Lave todas as células duas vezes com meio livre de lipídios ou PBS para remover quaisquer construções de FSL livres e prepare uma suspensão apropriada em meio livre de lipídios. Uma vez concluído o processo de modificação do FSL, os coys podem ser armazenados a quatro a oito graus Celsius como uma flor. As construções FSL consistem em três componentes principais, a cabeça funcional ou F, que pode ser uma variedade de grupos biologicamente funcionais.

O espaçador RS projetado para induzir o espaçamento da cabeça funcional longe da membrana para melhorar a dispersão da água e não ser reativo com o soro humano e o lipídio DAL ou L, o que permite que a construção se incorpore espontaneamente nas superfícies quatro. Os grupos FSL representativos são mostrados nas cinco imagens a seguir. Embriões murinos vivos foram marcados diretamente com fluoresceína FSL pelo método de duas horas a 37 graus Celsius em meios de cultura de células livres de soro lavados e depois visualizados em microscopia de fluorescência.

Nesta primeira imagem, um embrião de espelhamento de duas células livre de zop palita pode ser visto. A coloração intensa no meio do embrião é representativa de uma coloração clássica do corpo polar. Nas próximas duas imagens, embriões de quatro células livres de zop palita e oito células espelhando que exibem coloração sombria das células que estão fora do microscópio P de foco são mostrados aqui.

Uma imagem de um embrião de espelhamento de 16 células livre de zop palita é mostrada nesta última imagem de embriões de espelhamento vivos marcados com fluoresceína FSL embriões de blastos de espelhamento intactos de quatro a cinco dias de idade com embrião e zop LUCITA marcados são mostrados nesta próxima série de imagens. A marcação de fluoresceína FSL do peixe-zebra é mostrada. Esta primeira imagem é de uma microangiografia de uma larva de peixe-zebra 52 horas após a fertilização que teve fluoresceína FSL injetada diretamente na circulação.

A coloração da vasculatura do peixe-zebra pode ser observada aqui. A fluoresceína FSL, células heterogêneas do tecido renal do peixe-zebra ou citos ZK foram criadas exvivo e, em seguida, microinjetadas na circulação de um peixe-zebra receptor 52 horas após a fertilização, as observações in vivo dos citontes ZK foram feitas duas horas após a injeção por imagem da vasculatura sob fluorescência com microscopia de lapso de tempo mostrada é um único quadro de vídeo com grandes células lentas ou imóveis indicadas com setas laranja e células em movimento rápido, que pareciam borrados devido ao seu movimento indicado com setas verdes. Nesta imagem, é mostrada a marcação com fluoresceína FSL por absorção oral da construção obtida pela imersão de embriões de peixe-zebra e meios contendo fluoresceína FSL por até cinco dias.

A microscopia de campo claro do peixe-zebra tratado com fluoresceína FSL à esquerda corresponde à imagem fluorescente adjacente à direita. A fluorescência foi preferencialmente localizada no trato intestinal. Nenhuma coloração foi observada nos embriões de controle não tratados mostrados aqui.

Aqui, o vírus da estomatite vesicular ou VSV foi marcado diretamente com 10 microgramas por mililitro de fluoresceína FSL por duas horas a 37 graus Celsius, seguido de fixação com aldeído paraforme a 4% e, em seguida, a análise por varredura de fato não mostrou purificação do VSV vir. A rotulagem pós-FSL foi necessária. Este histograma mostra células testiculares suínas infectadas com humanos A Porto Rico 8 19 34 ou H um N um VIRs marcados com fluoresceína FSL.

As células não infectadas não fluorescentes são representadas pela linha preta, enquanto a fusão do coron H one N one com as células suínas, que resultou em fluorescência, é indicada pela linha vermelha. Nesta próxima série de imagens, as células foram primeiro marcadas com biotina FSL por uma hora a 37 graus Celsius, depois lavadas e reagiram com avadon marcado com Fluor quatro e, em seguida, lavadas e montadas úmidas para microscopia de fluorescência. A primeira imagem mostra uma imagem confocal compilada de uma assistência de blastos de embriões murinos, e esta figura mostra uma fatia confocal central do embrião da imagem anterior.

Aqui estão humanos móveis vivos e permanentes zoa. O desfoque ocorre como consequência de seu movimento. Uma imagem representativa mais distinta de espermatozóides humanos fixados em 4% de inserção de aldeído paraforme pode ser vista nesta figura aqui.

Os eritrócitos humanos marcados com biotina FSL são mostrados fixação com a inserção de pré-aldeído paraforme 4% não afeta a marcação FSL, conforme ilustrado nas duas figuras a seguir aqui, células de carcinoma humano endometrial RL 95 fixadas a 4% podem ser observadas. Considerando que, nesta imagem, as células do carcinoma humano endometrial RL 95 não são fixas. Praticamente não são observadas diferenças na rotulagem entre as duas imagens com ou sem fixação.

Os citos de hemácias marcados com biotina FSL observados em uma amostra de sangue coletada duas horas após a infusão intravenosa dos citos são mostrados aqui à esquerda, as células foram visualizadas em microscopia óptica à direita, o mesmo campo de células foi visualizado sob fluorescência e os dois citos presentes podem ser identificados em verde. O cálculo da proporção de citos para células não marcadas pode ser usado como um indicador de sobrevivência. Esta última imagem celular marcada com biotina FSL mostra citotas de biotina endometrial humana vivas que foram visualizadas ligando-se a grânulos abatidos.

Esta série final de imagens mostra as interações da construção FSL com marcadores de grupos sanguíneos. A primeira imagem é de citos GLI de glóbulos vermelhos humanos revestidos com uma concentração de 500 microgramas por mililitro de FSLG testada contra diluições de soro humano. Os glóbulos vermelhos humanos não reagem naturalmente com o antígeno Xena GALI.

Como tal, os citos podem ser usados para quantificar os níveis de anticorpos no soro. Neste exemplo, o paciente foi determinado como tendo um título antigo de um a 32, criando citos com níveis decrescentes de FSL. Semelhante à criação de um título de antígeno, um nível de antígeno ideal para detectar anticorpos pode ser determinado, as células podem ser criadas para dar um resultado positivo somente quando o nível de anticorpos excede um título específico.

O nível de antígeno FSL necessário para dar um resultado positivo depende da qualidade e do nível de anticorpo que está sendo detectado. Normalmente, para antígenos de carboidratos, uma solução de FSL de 100 microgramas por mililitro resultará em uma forte reação positiva. Os glóbulos vermelhos do grupo O humano modificados para ter um nível específico de um antígeno ou os chamados padronizados.

Os citos são usados para quantificar com precisão e reprodutibilidade a antia no soro humano. Neste exemplo, os citos foram preparados a partir dos próprios glóbulos vermelhos do doador e o nível de antia no soro do grupo O testado foi de um a 32. Mostrado aqui no sexto tubo, os antígenos do grupo sanguíneo A e B inseridos simultaneamente em uma única amostra de glóbulos vermelhos do grupo O foram usados para criar uma semana, citos da semana B.

Esses citos podem ser usados para fins de controle de qualidade VO. A análise do cite especificamente formulado de uma semana, B semana testada contra reagentes antia e anti B dá as reações fracas esperadas, como evidenciado nesta figura, com as reações ocorrendo na área inferior média dos tubos. Esta técnica simples pode ser feita em duas horas se for executada corretamente.