Acessível usando Arrays LED para Foto Estimulação de Neurônios

O objetivo deste procedimento é preparar e operar remotamente matrizes de LED para controlar a atividade neural em fatias de cérebro. Isso é feito usando fatias in vitro de animais com neurônios que expressam o canal REDSIN dois e usando uma matriz de LED em conjunto com um microscópio para ativar esses neurônios. Este vídeo aborda como calibrar um LED e um microscópio para fornecer intensidades conhecidas de luz à câmara de corte.

Com essa configuração, os limiares de ativação dos neurônios que expressam o canal dois podem ser medidos com precisão em resposta à estimulação da luz por meio da estimulação de campo amplo dos neurônios que expressam opsina dois do canal. Esta técnica permite o controle óptico temporariamente preciso de uma grande população neuronal. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos optogenéticos existentes, incluindo aqueles que usam lasers ou métodos baseados em obturador, é que ela é muito barata e pode ser facilmente instalada em um escopo de patch clamp existente.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurogênese adulta, incluindo como a atividade molda a integração de novos neurônios no cérebro adulto. As implicações dessa técnica se estendem a terapias ou diagnósticos baseados em células-tronco neurais adultas, pois oferece controle temporal preciso sobre a atividade dos neurônios nascidos em adultos que se integram aos circuitos neurais existentes. Embora esse método possa fornecer informações sobre as consequências funcionais da neurogênese adulta, ele também pode ser realizado em qualquer preparação in vitro.

Contendo neurônios que expressam adoção de canal Comece selecionando uma matriz de LED que produza sua potência de pico no comprimento de onda desejado. Além disso, escolha a matriz com uma classificação de corrente máxima. Integre a matriz de LED ao microscópio.

Comece conectando a matriz de LED a um ventilador chamado dissipador de calor usando pasta térmica para aumentar a eficácia do dissipador de calor. Em seguida, remova o LED de estoque de baixa potência do conjunto da lente e fixe o LED de potência mais alta na lente. Agora substitua o campo claro lamp com o aparelho de LED montado e certifique-se de que o ventilador esteja firmemente aterrado ao aterramento comum do sistema.

Posicionamento cuidadoso das matrizes de LED necessárias para garantir que a luz feita pela chamada esteja alinhada com o objetivo. Objetivo. Obtenha a iluminação Kohler focalizando o condensador de modo que a imagem do diafragma de campo seja focada na câmara de fatia e centralizada sob o caminho óptico da objetiva. Um tecido fino de papel para lentes pode ajudar a focar a imagem da abertura traseira em outras profundidades.

Agora, faça furos de diâmetros conhecidos em um material opaco que possa atuar como uma abertura para o medidor de energia. Coloque um desses pequenos orifícios sobre o sensor do medidor de potência óptica. Em seguida, fixe o medidor de potência no microscópio para focar o condensador no orifício.

Posicione manualmente o medidor de potência até que ele dê uma leitura máxima. Fixe o medidor de potência nesta posição. Se o medidor de potência máximo estiver acima do plano da fatia, restabeleça a iluminação Kohler nesse plano.

Em seguida, abra totalmente todas as aberturas. Mova sistematicamente o medidor de potência em relação ao caminho da luz óptica usando os manipuladores de palco. Uma vez terminado, meça a uniformidade da potência óptica dentro da área iluminada fazendo leituras de potência sistematicamente em uma grade em torno da potência máxima, que deve estar sob o foco da objetiva, O microscópio está configurado corretamente com iluminação mais fria centrada no foco da objetiva, a potência máxima da matriz deve estar neste foco regiões fora do foco devem agora receber uma quantidade conhecida de energia de acordo com a uniformidade enredo.

Agora, meça a potência máxima para cada tamanho de pinhole com o conhecimento do diâmetro da broca usada para fazer com que cada pinhole plote a potência óptica em função da área do pinhole. Como os furos perfurados não são perfeitos, a média desses valores produzirá uma boa estimativa da densidade de potência óptica. A matriz de LED será usada para remendar a óptica.

Certifique-se de levar em consideração todos os elementos ópticos necessários para o patch ao criar o gráfico de potência e o gráfico de uniformidade. Por exemplo, muitos microscópios têm uma tela difusora flippable que você pode usar para sacrificar a energia por uma questão de uniformidade. Prepare fatias de tecido cerebral usando métodos padrão e, enquanto permite que as fatias se recuperem por 30 a 45 minutos em LCR A aquecido, faça as pipetas de adesivo.

Uma vez que os tecidos tenham se recuperado, coloque suavemente uma fatia na câmara de registro do microscópio sob perfusão constante de LCR A oxigenado. Confirmar a presença de canais EYFP redsin dois canais por epifluorescência sob iluminação fluorescente. Localize na fatia um neurônio EYFP do canal dois saudável com morfologia madura.

Em seguida, localize este soma de neurônio sob óptica de remendo e produza uma vedação de giga ohm entre a membrana plasmática e as paredes do eletrodo de remendo. Se o eletrodo estiver suficientemente fechado para um neurônio de pico, a atividade espontânea deve produzir um potencial de campo local mensurável, mesmo sem uma vedação de giga ohm. Agora, o canal de ativação adota dois neste neurônio piscando diferentes doses de luz porque as doses de luz, uma função da potência e da duração do LED, calculam quanta luz é necessária para evocar um potencial de ação em várias potências e durações.

Um microscópio Olympus BX 51 wi foi configurado com um LED em linha com duas aberturas e uma lente condensadora. Contraste de campo claro suficiente para gravação de patch clamp foi obtido fechando o diafragma de campo e o diafragma de abertura. Um gráfico de uniformidade da intensidade da luz LED foi construído em uma região ao redor do campo de visão objetivo indicado pelo círculo pontilhado.

Com todos os diafragmas totalmente abertos, os fatiadores foram expostos à potência máxima de luz para ativação do canal de adoção. Essa configuração produz três ordens de magnitude mais poderosa do que a configuração usada para visualização de patch clamp. A marcação generalizada de grânulos de bulbo olfatório nascidos em adultos e neurônios glomerulares foi observada quatro semanas após a infecção lentiviral de neuroblasto migratório no fluxo migratório rostral.

Gravações de manchas soltas de um único canal nascido Adotando duas células granulares expressando EYFP indicaram que, para esse neurônio, uma estimulação de cinco milissegundos na potência máxima era suficiente para evocar picos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma tarde. É importante lembrar após este procedimento para sempre monitorar seu equipamento e suas configurações quanto à deriva ao longo do tempo Desde o seu desenvolvimento, essas técnicas optogenéticas abriram caminho para pesquisadores no campo da neurociência explorarem a transmissão sináptica e a integração em vários organismos modelo, como vermes, camundongos e até primatas.