Name: Acessível usando Arrays LED para Foto Estimulação de Neurônios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Aprenda a usar arrays LED para estimulação óptica de neurônios em fatias cerebrais. Este método de optogenética permite controlar precisamente a atividade neural com baixo custo e integração simples a microscópios existentes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado pela empresa de seguros de vida &quot;AG2R-La Mondiale-&quot;, Ecole des Neurociências de Paris (PEV), a Agence Nationale de la Recherche &quot;ANR-09-NEUR-004&quot; no quadro de &quot;NEURON ERA-NET &quot;do 7 º PQ programa pela Comissão Europeia, e da Fundação Pasteur. Sebastien Wagner foi apoiado pela Fundação Letten.

1. Calibração óptico: Power LED de medição <ol><li> Anexar uma matriz de LEDs para um dissipador de calor ativa refrigerada por uma ventoinha e apor este aparato LED / dissipador de calor para uma lente colimadora. </li><li> Troque a lâmpada usada em iluminação com LED brightfield / heatsink / fan / aparelho lente. Este aparelho deve ser cuidadosamente posicionado de modo que o feixe colimado LED viaja ao longo de um caminho reto em direção à lente óptica condensador. Verifique se o dissipador de calor / ventilador está devidamente aterrado para um terreno comum do sistema. </li><li> Unidade de matriz LED com uma fonte de alimentação que pode dar pulsos rápidos e quadrado da corrente. Esta fonte de alimentação pode ser controlado por um pulso TTL 5V proveniente de um gerador de pulsos. </li><li> Centro do feixe colimado ao longo do caminho da luz definida entre o diafragma de campo ea lente condensador. Idealmente, o feixe de LED será ligeiramente sobrecarregue o diafragma de campo totalmente aberto. Tipicamente, um feixe mais firmemente colimado LED vai encher esta abertura menos, e vai produzir morpoder e à custa de uniformidade. Em nossa configuração, aumentamos a uniformidade de luz, escolhendo uma lente colimadora que projetam uma imagem ligeiramente ampliada da matriz de LED no seu plano conjugado no diafragma consenser. </li><li> Atingir a iluminação Kohler, concentrando-se o condensador, para que a imagem do diafragma de campo (o diafragma mais próximo da fonte de luz) é focada na câmara de slice (fig. 1). Um tecido de papel fino lente pode agir como uma tela de projeção para visualizar a imagem focalizada do diafragma de campo em outras profundidades. </li><li> Perfurar uma série de furos de diâmetro conhecido em um material opaco. Coloque um desses pequenos furos sobre o sensor óptico de um poder metros. Coloque o medidor de energia no palco exemplar e centro do medidor de energia sobre a imagem focada do diafragma de campo simplesmente movendo o medidor de energia até que dá uma leitura máxima. Apor metros o poder nesta posição. </li><li> Totalmente aberta todas as aberturas (diafragma e Aberturacampo diafragma). Sistematicamente mover a câmara anexada fatia metros / potência em relação ao caminho óptico óptico e calcular a uniformidade de potência óptica dentro da área iluminada. Construir o enredo uniformidade para o seu sistema. Se o microscópio está configurada corretamente com iluminação Kohler centrado em foco o objetivo, a potência máxima deve ser diretamente abaixo do objetivo, e as regiões fora deste foco agora deve receber uma quantidade conhecida de energia de acordo com o enredo uniformidade. </li><li> Para cada tamanho de pinhole, construir uma curva padrão de potência óptica versus superfície pinhole. Ao ajustar a corrente de entrada para a matriz de LED, produzir esta curva em múltiplos níveis de potência e de cada curva de calcular a potência por mm2. Se a matriz de LEDs é para ser usado para correção óptica, certifique-se de introduzir elementos de óptica necessários para remendar (condensadores, pinholes e filtros) para saber a quantidade de luz é transmitido sob iluminação patching. </li><li> Lançando o medidor de potência paraenfrentar o objetivo, calcular a intensidade de iluminação em 470nm quando a lâmpada de mercúrio está ligado. </li><li> Adicionar uma fatia ao vivo para a câmara, e reconstruir as curvas padrão para determinar a potência de luz transmitida através do tecido cerebral de espalhamento. </li></ol> 2. Procedimento corte e Eletrofisiologia Uma parte: Preparação Slice <ol><li> Anestesiar (60 mg / kg cetamina e Xilazina 2mg/kg) e decapitar o mouse. Dissecar o cérebro no líquido cerebral espinhal artificial (ACSF, em mM: 124 NaCl, KCl 3, 1,3 MgSO 4, 26 NaHCO 3, 1,25 NaHPO 4, 20 glicose, 2 CaCl 2; ~ 310mOsm, pH 7,4, quando borbulhou com uma mistura de O2 de 95% e 5% CO 2 5,1), tomando cuidado para não danificar os bulbos olfatórios. Separar os dois hemisférios e colocar em agar com a superfície ventral, mesmo com uma borda (para seções horizontal). </li><li> Cola o ágar e superfície dorsal de cada hemisfério cortical à vibrAtome chuck, e, lentamente, encher a banheira com gelo frio ACSF. Fatia da superfície ventral em 300 seções M, transferindo cada seção para aquecido (34-36 ° C) e ACSF oxigenado, permitindo-lhes recuperar para 30-45 minutos. </li></ol> Parte B: Medição patch soltas do Threshold para Spike <ol start="3"><li> Depois de trazer as fatias à temperatura ambiente por 30 minutos, coloque delicadamente uma fatia na câmara de gravação da câmara de microscópio sob perfusão constante de ACSF oxigenado. Em risco de excessivamente estimulante ChR2 neurônios infectados, a presença de EYFP-ChR2 pode ser confirmado sob epifluorescência (fig. 2) </li><li> Puxe eletrodos de vidro em um extrator da pipeta (Sutter P-97). Preencha este eletrodo com ACSF. Quando colocada no banho ACSF a resistência da ponta deve ficar entre 70-10 Mohms. </li><li> Sob iluminação fluorescente, localizar a fatia de um neurônio ChR2-EYFP saudável com morfologia maduro. Também localizar essa soma neurônio sob a ótica patching. </li><li> Com pressão positiva de luz atravessou a ponta do eletrodo, menor o eletrodo de patch para o neurônio identificados fluorescente. Quando o contato da membrana é feita de forma rápida liberação de pressão positiva e aplique uma pequena quantidade e breve de sucção através da ponta. Um selo giga-ohm deve ser feita entre a membrana plasmática e as paredes do eletrodo patch. </li><li> Mesmo que um giga-selo não é formado, se o eletrodo está suficientemente perto de uma atividade dos neurônios fluorescentes spiking deve produzir um potencial campo mensuráveis ​​local. Ativar ChR2 neste neurônio, piscando doses diferentes de luz. Porque a luz da dose é uma função tanto do poder LED e duração, calcular a quantidade de luz que é necessário evocar um potencial de ação em múltiplos poderes e durações (fig. 2b). Também observar o quanto spiking ocorre sob a iluminação de mercúrio da lâmpada. </li></ol> 3. Resultados representativos: Em nosso microscópio (Olympus BX51WI), o nosso LED é in linha com duas aberturas e uma lente condensador, mantendo assim o caminho óptico original da fábrica instalada lâmpada de arco. Fechando tanto o diafragma de campo e Abertura do diafragma, podemos alcançar contraste brightfield suficientes para gravações de patch-clamp (fig. 1b). Com todos os diafragmas totalmente aberta expomos a fatia ao poder máximo de luz para channelrodopsina ativação (fig. 1a). Em nosso microscópio, essa configuração patching produz luz de densidade que é de aproximadamente três ordens de magnitude menor do que a densidade de campo máxima cheia (4,1 μW / mm 2 versus 6,88 mW / mm 2). Vemos etiquetagem robusta do adulto-nascido grânulo bulbo olfatório e semanas após a infecção neurônios periglomerular lentiviral de migrar neuroblastos no fluxo migratório rostral (fig. 2) A gravação solta-patch a partir de um único adulto-nascido ChR2-EYFP expressar célula granular indica que a 5 ms na estimulação máximahum alimentação (6,88 mW / mm 2) é suficiente para evocar spiking (fig. 2b). Desde nível de expressão varia entre as células, a quantidade de luz que passa o limiar a espiga vai variar e deve ser descrito estatisticamente para cada tipo de célula de interesse. <img src="/files/ftp_upload/3379/3379fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. LED de configuração matriz para full-campo fotoestimulação e patch-clamp eletrofisiologia fatia. Para ativar channelrodopsina (ChR2) projetamos um feixe colimado através de aberturas dos fundos aberta e óptica condensador (a). Esta configuração pode ser alterada em óptica de alto contraste patching por fechar completamente o diafragma de campo ea largura da modulação do diafragma de campo (b). Abreviaturas: a. ventilador, dissipador de calor b., c. matriz de LEDs, d. colimação lente, espelho e., f. diafragma de campo, g. diafragma de abertura, h. lente condensadora, i. sample palco, j. objetivo. <img src="/files/ftp_upload/3379/3379fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Imagem de uma fatia horizontal de 300μm bulbo olfatório de patch clamp e de todo o campo fotoestimulação (a). Lentivirally células infectadas pelo adulto-nascido grânulo expressar ChR2-EYFP pode ser visto irradiando a partir do núcleo do bulbo olfatório. A luz da dose necessária para evocar spiking pode ser encontrada, aumentando a duração do flash LED (b). O limite para essa célula granular foi 5ms em intensidade LED completa (2.43mW/mm 2). Escala em (a) = 500μm, escala em (b) = 50ms.

<ol><li>Nissant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+promotes+synaptic+plasticity+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis promotes synaptic plasticity in the olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 12, 728-730 (2009).</li>
<li>Apicella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+Cells+in+Piriform+Cortex+Receive+Convergent+Input+from+Distinct+Olfactory+Bulb+Glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pyramidal Cells in Piriform Cortex Receive Convergent Input from Distinct Olfactory Bulb Glomeruli.</a> Journal of Neuroscience. 30, 14255-14260 (2010).</li>
<li>Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature. 8, 1263-1263 (2005).</li>
<li>Bardy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((where+new+inhibitory+neurons+release+neurotransmitters+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb.</a> The Journal of Neuroscience. 30, 17023-17034 (2010).</li>
<li>Grubb, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+of+the+first+synapse+in+olfaction%3A+development+and+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional maturation of the first synapse in olfaction: development and adult neurogenesis.</a> The Journal of neuroscience. 28, 2919-2932 (2008).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit-breakers%3A+optical+technologies+for+probing+neural+signals+and+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit-breakers: optical technologies for probing neural signals and systems.</a> Nature reviews. Neuroscience. 8, 577-581 (2007).</li>
<li>Grossman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-site+optical+excitation+using+ChR2+and+micro-LED+array%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neural+engineering%22%5BJournal%5D)">Multi-site optical excitation using ChR2 and micro-LED array.</a> Journal of neural engineering. 7, 16004-16004 (2010).</li>
<li>Dhawale, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-redundant+odor+coding+by+sister+mitral+cells+revealed+by+light+addressable+glomeruli+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Non-redundant odor coding by sister mitral cells revealed by light addressable glomeruli in the mouse.</a> Nature neuroscience. 13, 1404-1412 (2010).</li>
<li>Weick, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+control+of+transplantable+human+ESC-derived+neurons+via+optogenetic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Functional control of transplantable human ESC-derived neurons via optogenetic targeting.</a> Stem cells. 28, 2008-2016 (2010).</li>
<li>Toni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+born+in+the+adult+dentate+gyrus+form+functional+synapses+with+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurons born in the adult dentate gyrus form functional synapses with target cells.</a> Nature Neuroscience. 11, 901-907 (2008).</li>
<li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2+Localised+to+the+Axon+Initial+Segment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2 Localised to the Axon Initial Segment.</a> PLoS ONE. 5, e13761-e13761 Forthcoming.</li>
<li>Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+circuitry+mediating+reversible+and+bidirectional+control+of+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety.</a> Nature. 471, 358-362 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nos últimos anos temos visto uma explosão na popularidade de ferramentas para pesquisa em neurociência optogenetic 6. Como resultado, é cada vez mais importante para diminuir a barreira de entrada para laboratórios que desejam começar a usar estas novas ferramentas. Aqui nós descrevemos como conduzir uma adaptação simples e de baixo custo e calibração de um equipamento de patch-clamp convencionais, de modo que ele pode fazer de campo total estimulação óptica de channelrodopsina-expressando neurônios. Em parti...

<table><tbody><tr><td>Ketamina</td><td>Imalg&amp;#232;ne 1000</td><td></td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Rompun</td><td></td><td>2%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>&amp;amp;nbps;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaHPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Pipetador</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>P-97</td></tr><tr><td>Capilares de vidro</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC150T-10</td><td>1,5 mm de diâmetro externo/1,17 mm de diâmetro interno</td></tr><tr><td>Matriz de LED</td><td>Bridgelux</td><td>BXRA-C2000</td><td></td></tr><tr><td>Lente colimadora</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>LEDC1</td><td>40 mm de diâmetro do feixe</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação</td><td>A1W Electronik</td><td>HKO2800</td><td>2,8 amp</td></tr><tr><td>Medidor de potência óptica</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PM 100</td><td></td></tr><tr><td>Dissipador de calor</td><td>Thermaltake</td><td>A1838</td><td>Silent Boost K8</td></tr><tr><td>Ventoinha</td><td>Thermaltake</td><td>A1838</td><td>Silent Boost K8</td></tr><tr><td>Vibrátomo</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

acessível usando arrays led para foto estimulação de neurônios

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Eletrofisiologia fatia padrão tem permitido aos pesquisadores sondar os componentes individuais dos circuitos neurais gravando respostas elétricas de células individuais em resposta a elétrica ou farmacológica 1,2 manipulações. Com a invenção de métodos para controle de neurônios geneticamente opticamente alvo (optogenética), os pesquisadores agora têm um nível sem precedentes de controle sobre grupos específicos de neurônios na preparação fatia padrão. Em particular, fotossensível channelrodopsina-2 (ChR2) permite que os pesquisadores para ativar os neurônios com 3,4 luz. Ao combinar calibração cuidadosa de LED com base em fotoestimulação de ChR2 com eletrofisiologia fatia padrão, somos capazes de sonda com maior detalhe o papel de adulto-nascido interneurônios no bulbo olfativo, o primeiro relé central do sistema olfativo. Usando a expressão viral de ChR2-YFP especificamente no adulto-nascido neurônios, podemos controlar seletivamente jovens adultos-nascido neurônios em um ambiente de mais umd neurônios maduros. Nosso controle óptico usa um sistema simples e barato LED, e vamos mostrar como esse sistema pode ser calibrado para entender como muita luz é necessária para evocar spiking atividade de neurônios individuais. Por isso, lampejos de luz azul pode controlar remotamente o padrão de disparo de ChR2-transduzidas células recém-nascido.

Adulto-nascido neurônios expressando ChR2 pode ser manipulado em preparações fatia eletrofisiológicos, a fim de examinar sua contribuição para a função olfativa de circuitos neurais.

Acessível usando Arrays LED para Foto Estimulação de Neurônios

A eletrofisiologia convencional em fatias permitiu que pesquisadores investigassem componentes individuais da circuitaria neural por meio do registro de respostas elétricas de neurônios únicos...

O objetivo deste procedimento é preparar e operar remotamente matrizes de LED para controlar a atividade neural em fatias cerebrais. Isso é realizado utilizando fatias in vitro de animais com neurônios que expressam o canal REDSIN dois, e empregando uma matriz de LED em conjunto com um microscópio para ativar esses neurônios. Este vídeo aborda como calibrar um LED e um microscópio para fornecer intensidades conhecidas de luz à câmara de fatias.Com essa configuração, os limiares de ativação de neurônios que expressam o canal dois podem ser medidos com precisão em resposta à estimulação luminosa por meio da estimulação ampla de neurônios que expressam a opsina do canal dois. Esta técnica permite o controle óptico temporariamente preciso de uma grande população neuronal. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos optogenéticos existentes, incluindo aqueles que utilizam lasers ou métodos baseados em obturadores, é que ela é muito econômica e pode ser facilmente adaptada a um microscópio de grampo de patch já existente.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da neurogênese adulta, como, por exemplo, como a atividade influencia a integração de novos neurônios no cérebro adulto. As implicações dessa técnica se estendem para terapias ou diagnósticos baseados em células-tronco neurais adultas, pois oferece controle temporal preciso sobre a atividade de neurônios recém-nascidos que se integram à circuitaria neural existente. Embora este método possa fornecer informações sobre as consequências funcionais da neurogênese adulta, ele também pode ser realizado em qualquer preparação in vitro.Contendo neurônios que expressam canais de adoção. Comece selecionando uma matriz de LED que produza sua potência máxima no comprimento de onda desejado. Além disso, escolha a matriz com a classificação máxima de corrente. Integre a matriz de LED ao microscópio.Comece fixando a matriz de LED a um ventilador chamado dissipador de calor usando pasta térmica para aumentar a eficácia do dissipador. Em seguida, remova o LED padrão de baixa potência de sua montagem de lente e fixe o LED de maior potência à lente. Agora substitua a lâmpada de Campo Claro pelo conjunto montado de LED, e certifique-se de que o ventilador esteja corretamente aterrado ao terra comum do sistema.O posicionamento cuidadoso dos arranjos de LED é necessário para garantir que a luz emitida esteja alinhada com o objetivo. Objetivo: obter a iluminação de Köhler ajustando o condensador de modo que a imagem do diafragma de campo seja focalizada na câmara de fatias e esteja centralizada sob o trajeto óptico do objetivo. Um pedaço fino de papel de lente pode ajudar a focalizar a imagem da abertura traseira em outras profundidades.Agora, faça furos com diâmetros conhecidos em um material opaco que possa atuar como uma abertura para o medidor de potência. Coloque um desses pequenos furos sobre o sensor do medidor de potência óptica. Em seguida, fixe o medidor de potência ao microscópio para focalizar o condensador no furo.Posicione manualmente o medidor de potência até que ele forneça a leitura máxima. Fixe o medidor de potência nesta posição. Se o máximo do medidor de potência estiver acima do plano do corte, restabeleça a iluminação de Köhler nesse plano.Em seguida, abra completamente todas as aberturas. Mova sistematicamente o medidor de potência em relação ao trajeto óptico da luz utilizando os manipuladores da platina. Após concluir, meça a uniformidade da potência óptica dentro da área iluminada, realizando sistematicamente leituras de potência em uma grade ao redor da potência máxima, que deve estar localizada sob o foco da objetiva. O microscópio está corretamente configurado com a iluminação refrigerada centralizada no foco da objetiva; a potência máxima do arranjo deve estar nesse foco, e as regiões fora do foco devem agora receber uma quantidade conhecida de potência de acordo com o gráfico de uniformidade.Agora, meça a potência máxima para cada pinhole de tamanho distinto, considerando o diâmetro da broca utilizado para fabricar cada um, e construa um gráfico da potência óptica em função da área do pinhole. Como os pinholes perfurados não são perfeitos, fazer a média desses valores produzirá uma boa estimativa da densidade de potência óptica. A matriz de LED será utilizada para a óptica de gravação.Certifique-se de levar em consideração todos os elementos ópticos necessários para o apamento ao construir o gráfico de potência e o gráfico de uniformidade. Por exemplo, muitos microscópios possuem uma tela difusora acoplada que pode ser girada e que você pode usar, sacrificando potência em benefício da uniformidade. Prepare fatias de tecido cerebral usando métodos padrão e, enquanto as fatias se recuperam por 30 a 45 minutos em A CSF aquecido, prepare os eletrodos de patch.Uma vez que os tecidos tenham se recuperado, coloque suavemente uma fatia na câmara de registro do microscópio sob perfusão constante de A CSF oxigenado. Confirme a presença do canal EYFP reds em dois canais por epi-fluorescência sob iluminação fluorescente. Localize na fatia um neurônio EYFP saudável do canal dois com morfologia madura.Em seguida, localize o soma desse neurônio sob a óptica de selamento e produza um selo de giga ohm entre a membrana plasmática e as paredes do eletrodo de selamento. Se o eletrodo estiver suficientemente próximo de um neurônio em atividade elétrica, a atividade espontânea deverá produzir um potencial de campo local mensurável, mesmo sem um selo de giga ohm. Agora, ative o canal opa2 neste neurônio aplicando diferentes doses de luz, pois a dose de luz é função tanto da potência quanto da duração do LED; calcule quanta luz é necessária para evocar um potencial de ação em múltiplas potências e durações.Um microscópio Olympus BX 51 wi foi configurado com um LED alinhado a duas aberturas e uma lente condensadora. Obteve-se contraste suficiente em campo claro para gravação por patch clamp fechando-se tanto o diafragma de campo quanto o diafragma de abertura. Um gráfico de uniformidade da intensidade da luz do LED foi construído em uma região ao redor do campo de visão objetivo indicado pelo círculo tracejado.Com todos os diafragmas totalmente abertos, os fatiadores foram expostos à potência máxima de luz para a ativação do canal adoptin. Esta configuração produz luz três ordens de magnitude mais potente do que a configuração utilizada para a visualização em registro por patch clamp. Observou-se uma marcação difusa de granuleiros recém-nascidos no bulbo olfatório e de neurônios periglomerulares quatro semanas após a infecção lentiviral de neuroblastos migratórios no trajeto migratório rostral.Registros em configuração livre de um único canal nato expressando EYFP em uma célula granular indicaram que, para este neurônio, uma estimulação de cinco milissegundos com potência máxima foi suficiente para induzir descargas elétricas. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma tarde. É importante lembrar que, após este procedimento, deve-se sempre monitorar os equipamentos e as configurações quanto a desvios ao longo do tempo. Desde o seu desenvolvimento, técnicas optogenéticas como esta abriram caminho para que pesquisadores na área de neurociência explorem a transmissão e integração sinápticas em diversos organismos modelo, como verme, mosca, camundongo e até primatas.

using-affordable-led-arrays-for-photo-stimulation-of-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neurônios adultos-nascido do bulbo olfativo pode ser controlado usando optogenetically Channelrhodopsin2 expressando injeção lentiviral no fluxo migratório rostral e fotoestimulação crônica com uma miniatura implantado LED.

Transdução Viral seletiva de Adultos-nascido neurônios olfativos de crônica In vivo Estímulo Optogenetic

Este vídeo demonstra um procedimento para analisar a conectividade sináptica entre o córtex pré-frontal medial (mPFC) e os neurônios da amígdala usando fatias agudas de cérebro de amígdala de camundongos. Os neurônios mPFC nesses camundongos expressam a canalrodopsina fundida a uma proteína fluorescente. As channelrodopsinas facilitam o influxo de íons e a geração de potencial de ação nos neurônios mPFC após a ativação da luz. Consequentemente, os neurônios mPFC liberam neurotransmissores que...

Visualização e mapeamento de vias neuronais em uma fatia de cérebro de amígdala

O recente desenvolvimento de ferramentas de neurociência que combinam genética e óptica, denominado "optogenetics", possibilita o controle sobre a atividade do circuito neural com um nível sem precedentes de resolução espacial e temporal. Aqui nós fornecemos um protocolo para a integração na gravação vivo com manipulação optogenetic de subconjuntos geneticamente definidos de neurônios piramidais corticais pré-frontais e subicular.

Um Método para High Fidelity Optogenetic Controle de Individual Piramidal neurônios<em&gt; In vivo</em

Aqui descrevemos nossa estratégia para obter gravações de unidade única estáveis e bem isoladas de interneurônios inibitórios identificados no córtex de camundongo anestesiado. Os neurônios que expressam ChR2 são identificados por sua resposta à luz azul. O método usa equipamento de gravação extracelular padrão e serve como uma alternativa barata à imagem de cálcio ou patch guiado visualmente.

Um Guia para In vivo Gravação única unidade de Optogenetically Identificado Cortical Inibitória Interneurônios

Um protocolo para gerar um sistema de co-cultura consistindo de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), neurônios corticais primários e astrócitos é descrito. Este sistema de co-cultura permite a detecção da formação de contatos e circuitos sinápticos entre novos neurônios derivados de iPSC e neurônios corticais pré-existentes que expressam channelrhodopsina-2.

Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

Um método para estimulação da atividade elétrica de culturas de células in vitro com luz visível é descrito.

Controle óptico de células vivas atividade elétrica por conjugados Polymers

Aqui, é apresentado um procedimento para ativar seletivamente uma proteína neuronal com um pulso curto de luz codificando geneticamente um aminoácido não natural foto-reativo em uma proteína neuronal alvo expressa em neurônios em cultura ou in vivo.

Controlo óptico de uma proteína neuronal utilizando um ácido Unnatural Amino geneticamente codificados em neurónios

No coração, os eventos moleculares coordenar a função contráctil e eléctrica do órgão. Um conjunto de técnicas de microscopia de fluorescência de campo locais aqui apresentadas permite a gravação de variáveis ​​de celular em corações intactos. Identificação de mecanismos que definem a função cardíaca é fundamental na compreensão de como o coração trabalha em situações patológicas.

O campo local microscopia de fluorescência: Geração de sinais de celular em corações intactos

Este protocolo descreve como realizar experimentos optogenéticos para controlar a expressão gênica com luz vermelha e vermelha distante usando PhyB e PIF3. Estão incluídas instruções passo-a-passo para a construção de um sistema de iluminação simples e flexível, que permite o controle da expressão gênica ou outra optogenética com um computador.

Construindo um sistema de iluminação simples e versátil para experimentos optogenéticos

Aqui, apresentamos o método de fabricação de um sistema optrode com fibras ópticas para entrega de luz e uma matriz de eletrodos para gravação neural. Experimentos in vivo com camundongos transgênicos expressando channelrhodopsin-2 mostram a viabilidade do sistema para estimulação optogenética simultânea e gravação eletrofisiológica.

Oprode Array para modulação optogenética simultânea e gravação neural elétrica

Desenvolvimentos recentes na pesquisa da dor destacam o potencial da fotoneuromodulação usando diodos emissores de luz verde (GLED) como tratamento não farmacológico. O GLED modula as vias da dor, oferecendo alívio eficaz da dor. Este artigo tem como objetivo padronizar e refinar os protocolos de exposição ao GLED, melhorando a consistência entre os estudos e avançando na aplicação clínica dessa terapia.

Otimizando técnicas de fotoneuromodulação para avaliar o papel dos diodos emissores de luz verde no controle da dor

Aprenda a usar arrays LED para estimulação óptica de neurônios em fatias cerebrais. Este método de optogenética permite controlar precisamente a atividade neural com baixo custo e integração simples a microscópios existentes.

Acessível usando Arrays LED para Foto Estimulação de Neurônios

Explorar mais vídeos