Seleção e isolamento de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos adultos reprogramado

Nós apresentamos um protocolo para a reprogramação eficiente de células somáticas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC) usando vetores retrovirais codificando OCT3 / 4, Sox2, KLF4 e c-myc (OSKM) e identificação de hiPSC corretamente reprogramado pela coloração ao vivo com tradi- 1-81 anticorpo.

Neste artigo em vídeo, fibroblastos adultos humanos são reprogramados para gerar células-tronco pluripotentes usando vetores retrovirais. Primeiro, os fibroblastos humanos são transduzidos com vetores retrovirais que codificam os fatores de transcrição. T três quatro, SOX dois, KLF quatro e cmic.

Os fibroblastos infectados são cultivados em células alimentadoras embrionárias de camundongos por 14 a 28 dias. As culturas resultantes são coradas com o anticorpo TRA 180 1 para identificar colônias de células reprogramadas. As colônias positivas são então transferidas para placas contendo MEF para expansão.

A coloração imunocitoquímica confirma a expressão de marcadores de pluripotência e o estabelecimento de linhagens de células-tronco pluripotentes. Estudos adicionais devem ser realizados para caracterizar melhor as linhagens. Geralmente, indivíduos novos na programação de células somáticas e culturas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos terão dificuldades porque é difícil identificar as colônias IPSC corretas.

Demonstrando o procedimento estará a Dra. Sula Pollak pós-Doutora O Fellow do meu laboratório. Comece este procedimento plaqueando células Phoenix AM FO a uma densidade de cerca de sete a 8 milhões de células por placa de 10 centímetros em 10 mililitros de DMEM com alto teor de glicose na incubadora e cultura durante a noite. No dia seguinte, prepare misturas de transfecção consistindo de 12 microgramas de um vetor que codifica T, três, quatro, SOX, dois klf, quatro genes cmic ou GFP e 35 microlitros, poucos genes seis, em um volume total de 500 microlitros de soro livre de alta glicose DMEM com L glutamina.

Incubar as misturas durante 20 minutos. Em seguida, para transfectar as células da fênix, pipetar suavemente os complexos de DNA nas placas contendo células da fênix, que devem ser 70 a 80% confluentes. Incube as células a 37 graus centígrados após seis a oito horas.

Aspire o meio e substitua-o por oito mililitros de DMEM com alto teor de glicose com antibióticos. Em seguida, retorne as placas à incubadora por 12 horas após a incubação. Use uma pipeta para aspirar e coletar o meio contendo vírus.

Em seguida, substitua o meio e repita esse processo a cada 12 horas até que o meio seja coletado quatro vezes. Armazene o meio a quatro graus centígrados. Depois que todo o meio for coletado, combine todas as porções e despeje-o através de um filtro superior de tubo de 0,45 micrômetro em um tubo cônico de 50 mililitros para remover células destacadas e detritos.

O meio filtrado, que contém partículas virais, pode ser mantido na geladeira por duas semanas sem perder a atividade infecciosa. O congelamento não é recomendado. No dia anterior ao procedimento de transdução, descongele o estoque congelado de fibroblastos humanos adultos e adicione uma vez 10 às quintas células por cada poço de seis placas revestidas de gelatina.

No dia seguinte, em um tubo cônico de 50 mililitros, combine 3,5 mililitros cada um de T quatro SOX dois, klf quatro e meio viral CMIC e adicione poli cérebro a uma concentração final de seis microgramas por litro como controle. Prepare um mililitro de meio viral GFP, três mililitros de cultura, meio e poli cérebro a uma concentração final de seis microgramas por mililitro. Aspire o meio da placa contendo fibroblastos humanos.

Em seguida, adicione quatro mililitros de meio viral misto ou meio de controle e centrifugue as placas a 1600 G por uma hora a 20 graus centígrados após a centrifugação. Incube as placas por aproximadamente 12 horas. Em seguida, substitua o meio viral por meio de cultura de fibroblastos e incube por mais 12 horas.

Repita esse processo da infecção para a cultura em meio de fibroblastos, duas vezes adicionais após a última infecção. Cultive os fibroblastos em DMEM por 48 horas. Em seguida, verifique a eficiência da infecção das transduções paralelas com o meio retroviral GFP.

Em seguida, iniciar a reprogramação de células somáticas para pluripotentes. Os fibroblastos infectados são cultivados em meio de células-tronco embrionárias humanas ou meio HES embrionário de camundongo, fibroblastos ou MEFs a uma densidade de cerca de duas vezes 10 a quinta células por poço da gelatina tratada. Placa de seis poços em meio de crescimento de fibroblastos no dia seguinte.

Divida os fibroblastos humanos infectados usando 0,05% de tripsina EDTA e semeie-os na densidade de aproximadamente 1,2 vezes 10 elevado a quatro por poço no meio de crescimento de fibroblastos. No dia seguinte. Substitua o meio por meio HES contendo butirato de sódio 0,5 milimolar durante os sete dias iniciais da reprogramação.

Mude o meio diariamente. Substitua a mídia por mídia HES sem butirato de sódio e continue a reprogramação por mais sete a 21 dias. Mude o meio diariamente todos os dias.

Verifique as células transduzidas quanto a alterações morfológicas. As colônias de células começarão a surgir aproximadamente 10 dias após a transferência dos fibroblastos transduzidos para as células alimentadoras. As colônias contendo as células reprogramadas são agora chamadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos ou células IPS humanas.

As colônias de células IPS humanas estarão prontas para serem isoladas em 14 a 28 dias após o plaqueamento nas células alimentadoras de MEF. Nesta fase, as colônias de células IPS humanas podem ser transferidas para placas contendo MEF ou cobertas com matrigel aqui. A transferência para as placas contendo MEF é demonstrada um dia antes da colheita das colônias de células IPS humanas Semeie placas de 24 poços contendo células alimentadoras de MEF irradiadas por gama em meio de crescimento de fibroblastos.

Incube a 37 graus Celsius com 5% de CO2 no dia em que as colônias de células IPS humanas serão colhidas. Aspire o meio de crescimento de fibroblastos do ME Fs e enxágue-os com PBS para remover quaisquer vestígios de FBS. Posteriormente, adicione 0,5 mililitros de células-tronco embrionárias humanas ou meio HES contendo 10 inibidores de rocha micromolar Y 2 7 6 3 2 a cada poço, em seguida, usando um microscópio montado em uma capela de fluxo laminar, examine as placas de reprogramação para a formação de colônias de células IPS humanas.

Se necessário, remova os fibroblastos ao redor das colônias de células IPS humanas com uma agulha de calibre 21. Enxágue as placas com PBS e adicione meio HES fresco contendo o anticorpo específico TRA 180 1 stain alive. Retorne as células para a incubadora a 37 graus centígrados com 5% de CO2.

Após 30 minutos, substitua o meio por meio HES fresco suplementado com inibidor de rocha 10 micromolar. Em seguida, veja as colônias sob o microscópio fluorescente. Marque TRA de uma a 81 colônias positivas.

Usando um marcador objetivo usando uma agulha de calibre 21. Corte as colônias de células IPS humanas positivas TRA 180 1 em vários pedaços pequenos. Em seguida, usando uma pipeta automática, transfira fragmentos de colônias de células IPS humanas para poços individuais da placa de 24 poços com ME Fs. Evite transferir células não IPS.

Coloque as placas na incubadora e deixe as colônias de células IPS humanas se fixarem por 24 a 36 horas e troquem de meio diariamente. As colônias de células IPS humanas com morfologia correta do tipo HE serão visíveis 48 horas após a transferência inicial para uma placa de 24 poços que passa manualmente as colônias de células IPS humanas a cada seis a oito dias, cortando-as com uma placa de agulha de calibre 21. Expansão de culturas em um poço de 12 e, posteriormente, em uma placa de seis poços após a expansão clonal.

E estabelecendo as linhagens celulares IPS humanas, analise a expressão dos marcadores de pluripotência TRA um, 60, SSEA, quatro, T, três, quatro, SOX, dois e nanog, usando imunoquímica, uma vez que as linhas tenham sido estabelecidas. A caracterização pormenorizada pode implicar in vitro e in vivo. Análise de diferenciação, análise de cariótipo, análise de estudos de metilação de silenciamento de transgenes e estudos de expressão gênica.

A transdução eficiente com meio contendo retrovírus é fundamental para uma reprogramação bem-sucedida para determinar a eficácia da transdução viral. Fibroblastos humanos adultos derivados de um paciente com ataxia de Friedrichs foram visualizados após duas infecções consecutivas com meio retroviral GFP quando os fibroblastos foram infectados por incubação simples com meio viral, menos de 20% das células são transduzidas. No entanto, quando a adição do meio retroviral GFP foi imediatamente seguida pela eficiência da transdução aumentou drasticamente.

Aqui, mais de 80% das células são transduzidas para realizar uma caracterização inicial das colônias isoladas de células IPS humanas. A expressão de marcadores de pluripotência característicos de células ES humanas foi avaliada por imunoquímica, conforme mostrado aqui. As colônias isoladas de células IPS humanas foram positivas para os marcadores de pluripotência.

T três quatro SOX dois nano SSEA quatro e TRA um 60 DNA. A coloração Cos com DPI mostrada nos painéis superiores é detectada nas colônias de células IPS humanas e nas células alimentadoras. Esses resultados demonstram que as células IPS humanas obtidas usando este protocolo de reprogramação expressam marcadores de pluripotência apropriados característicos para células-tronco pluripotentes humanas indiferenciadas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como reprogramar com sucesso fibroblastos humanos em células-tronco pluripotentes usando transações retrovirais identificadas como indutoras humanas corretas, colônias de células-tronco pluripotentes e realizar a caracterização inicial de HI PCs.