Name: Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprenda métodos de ensaio para avaliar comportamentos motores e sensoriais em Drosophila melanogaster. Este protocolo demonstra ensaios de rastejamento, anel e cortejo para estudar função motora, coordenação e fatores genéticos.

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Gostaríamos de agradecer a Astha Maltare para gerar os dados rastejantes larvas. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Nicholas Lanson Jr. para dar seus comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Robert Packard Centro de ALS em Johns Hopkins (a UBP) e da Associação de Esclerose Lateral Amiotrófica (UBP) e R01MH083689 do National Institutes of Mental Health (CDN).

A. Ensaio Crawling larval 1. Coleta de larvas <ol><li> Configure uma garrafa de 8 onças de moscas machos (10-15 + de 10-15 fêmeas). </li><li> Deixe moscas põem ovos para 24 horas, em seguida, garrafa transparente de moscas. (Transfira os adultos em um novo frasco e repetir se necessário). </li><li> Incubar garrafa durante 3-4 dias, ou até larvas de terceiro estádio são visíveis. </li><li> Adicionar 50 - 100 ml de sacarose a 20% para a garrafa com larvas e deixar assentar durante 20 minutos. As larvas irá flutuar para o topo. </li><li> Coletar larvas utilizando uma pipeta de 25 ml sorológico com a ponta cortada, e coloque em uma cesta de malha. </li><li> Lavar as larvas no cesto de malha duas vezes com desionizada H 2 O. As larvas são agora pronto para os experimentos. </li></ol> 2. Para tratar larvas com droga <ol><li> Usar uma escova para transportar o número desejado de larvas para um copo de 5 ml contendo uma solução de sacarose a 5% + droga. </li><li> Deixe alimentam as larvas por pelo menos 15 minutos.</li><li> Verter droga tratada com larvas para um cesto de malha e enxaguar. Eles estão agora prontos para usar. </li></ol> 3. Ensaio Locomotor (medição da distância total percorrida ou contrações da parede do corpo) <ol><li> Usar uma escova para o transporte de larva indivíduo a uma: <ol><li> 15 centímetros placa de Petri contendo agarose a 2% (previamente vertida e deixou-se endurecer) ao longo de papel de gráfico com uma grade de 0,2 cm 2. <ol><li> Contar o número de linhas de grade cruzados em 1 minuto. </li></ol></li><li> Poço de um prato de dissecção de vidro contendo uma solução diluída de pasta de levedura. <ol><li> Conte peristaltismo (contrações anterior completo para posterior movimento de contração = 1) em um minuto, observando sob um microscópio de dissecção. </li></ol></li></ol></li><li> Repita até que os números desejados de larvas foram contadas. </li></ol> B. rápida iterativo geotaxis negativos (ANEL) Protocolo Este ensaio foi originalmente anulaçõesdescrita por Gargano et al 5. <ol><li> Colete recém-emergidas moscas machos adultos sob luz anestesiados CO 2 e coloque em um alimento frasco contendo padrão (ou alimento droga +). </li><li> Manter as moscas à temperatura ambiente (no topo de bancada. ~ 22 ° C) durante 2-3 dias para permitir a recuperação a partir de CO 2 (e acumulação de níveis de estado estacionário droga se for caso disso). </li><li> Transferir cerca de 25 moscas sem anestesia para frascos de poliestireno preparados. </li><li> Montar frascos com moscas dentro do aparelho ANEL (Figura 1). </li><li> Permitir que as moscas se aclimatar ao ambiente, tranquilo, por 15-20 minutos. </li><li> Durante este tempo câmara lugar ~ digital 1 m em frente do aparelho (em uma plataforma, se necessário, para alinhar o centro da lente a meia-altura do frascos), concentrar e ampliar a câmara para o aparelho, e definir um temporizador para 3,0 segundos. </li><li> Com cuidado, tomar posse do aparelho ANEL com a mão esquerda para não disturb as moscas, e mantenha o timer com sua mão direita. </li><li> Acentuadamente toque no aparelho para baixo sobre a superfície da bancada três vezes, assegurando que a torneira é bastante difícil de abater todas as moscas para a parte inferior dos frascos. </li><li> Simultaneamente com a realização do terceiro toque, iniciar a contagem regressiva de 3 segundos. </li><li> Em três segundos tirar uma foto. </li><li> Redefinir o temporizador para 1 minuto e começar. Durante este tempo, redefinir a câmera eo foco sobre o aparelho, e um outro canal do temporizador para três segundos. </li><li> Após 1 minuto, repita os passos 1,7-1,10 </li><li> Após um total de 5-6 ensaios, fazer upload de imagens para um computador e usar o seu visualizador de imagens favorito abrir e marcar a altura média subiu para cada frasco. </li><li> Realização de análise estatística em seus diferentes grupos, comparando a altura média subiu. </li></ol> C. Corte e Ensaio Mating <ol><li> A primeira coisa de manhã, bem claras produtoras de garrafas de flies a ser usado. </li><li> Durante o curso do dia (cada 3-4 horas), recolher recém-emergidas machos sexualmente ingénuos e fêmeas: <ol><li> Coloque machos individualmente em frascos ou tubos com meio. </li><li> Coloque 5-6 fêmeas em conjunto por frasco / tubo. </li><li> Isolar moscas recolhidos a 25 ° C sob 12 hr luz / escuro durante 5 dias. </li><li> Transferir uma fêmea para a câmara de uma roda de acasalamento. </li><li> Transferir um macho para dentro da câmara de uma roda de acasalamento. </li><li> Observe par sob um microscópio de dissecção para os seguintes comportamentos: <ol><li> Orientação (os orienta masculina para a mulher) </li><li> Tapping (o macho bate o sexo feminino) </li><li> Música Wing (o macho estende e vibra uma asa) </li><li> Lamber (os licks do sexo masculino a genitália feminina) </li><li> Curling (o macho enrola seu abdômen debaixo de si mesmo) </li><li> Tentativa de cópula (Curling atividade ao tentar montar a fêmea) </li></ol></li></ol></li><li> Observar durante 10 minutos ou até que a cópula bem sucedida, observando o tempo em que cada comportamento ocorre (latência), o tempo total envolvida em comportamento de corte até cópula (para calcular o índice de corte), bem como o número de pares que realizar com sucesso um determinado comportamento ( freqüência). 100% dos pares de tipo selvagem, em geral acasalar dentro de 5 minutos. </li><li> Calcular um índice de corte (IC) é calculada dividindo o tempo gasto no corte dividida pelo tempo total de até cópula. Para pares de tipo selvagem isso geralmente varia entre 0,6-0,8. </li></ol> D. Representante Resultados Rastejando ensaio Larva tipo normal selvagem vai passear a 3 centímetros por minuto, e exibem 40-50 ~ de contrações da parede do corpo em um minuto. Recentemente, desenvolvemos um modelo de Drosophila FUS / TLS relacionada com esclerose lateral amiotrófica, que mostra defeito rastejando larval, tempo de vida reduzido e adultos escalada deficiência 6. Visamos a expressão of tipo selvagem e formas mutantes de FUS / TLS para os neurônios motores (OK-371-gal4 motorista) e realizou um ensaio de rastreamento larval. Como mostrado abaixo, as larvas do tipo selvagem rastrear até 12 cm, enquanto que a expressão de FUS tipo selvagem diminuiu a capacidade de larvas de rastreamento a cerca de 6 cm. Animais que expressam o R521C mutação ALS-causando em FUS / TLS demonstram uma deterioração muito grave no seu movimento de rastreamento (Figura 1), arrastando apenas cerca de 1 cm / minuto. Ensaio ANEL negativo geotaxis Jovens moscas do tipo selvagem adultos deve ter uma altura média de escalada de ~ 4-5 cm de um período de tempo de 3 segundos (o tempo pode ser ajustado de 3 segundos para acomodar diferentes estirpes ou os níveis de actividade para definir uma altura média dada para uma dada tensão / tratamento). Moscas que permanecem na parte inferior é atribuído um valor de 0. Não é aconselhável a utilização de mais de 25 moscas por frasco porque, em seguida, torna-se difícil determinar a localização de cada indivíduo mosca para medir a altura. Ndessensibilização o tem sido observada em até os 6 ensaios consecutivos espaçados 1 minuto para além de que têm empregado. É crítico para NÃO reutilizar os frascos de polistireno de teste neste ensaio, após os conjuntos de dados iniciais são recolhidas porque as moscas novos colocados em frascos utilizados não irá subir para a mesma extensão como em frascos frescos. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3795/3795fig1.jpg" /> Figura 1. Configuração para o Ensaio RING. A câmera digital é colocado ~ m 1 na frente do aparelho contendo moscas nos frascos de poliestireno, foco e zoom da câmera para o aparelho e definir um temporizador para 3,0 segundos. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3795/3795fig2.jpg" /> Dados Figura 2. Representativos do ensaio rastejar larval usando moscas ectopicamente expressando UAS-FUS WT, e UAS-FUS R521C sob o controlo de um controlador de neurónio motor (OK371-gal4). <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt;

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</ol>

Não temos nada a divulgar.

Comportamento Drosophila é estreitamente regulada por fatores genéticos e ambientais. Nós, e outros, já utilizado nos ensaios aqui descritos para coletar dados para analisar genes relacionados a comportamentos e voar para humanos doenças neurodegenerativas modelados em Drosophila 5-19. Para o ensaio de rastreamento, seleção criteriosa de 3 º ínstar é um passo crítico. Se o tratamento com um medicamento, levará 10-15 minutos (ou mais dependendo do tipo e da natureza da droga) para ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Fisher Scientific </td><td> S5-500 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> 6 oz garrafa de Drosophila </td><td> Genesee Científico </td><td> 32-130 </td></tr><tr><td> Paint Brush (# 1) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 11859 </td></tr><tr><td> Fly componentes dos alimentos </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Farinha de milho </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9109741 </td></tr><tr><td> Agar </td><td> Genesee Científico </td><td> 66-104 </td></tr><tr><td> Melaço </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9349176 </td></tr><tr><td> Ácido propiônico </td><td> Acros </td><td> 14930-0010 </td></tr><tr><td> Tegosept </td><td> Ápice </td><td> 20-258 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> PescadorCientífico </td><td> BP2818-4 </td></tr><tr><td> Levedura </td><td> Genesee Científico </td><td> 62-107 </td></tr></tbody></table>

métodos de ensaio para drosophila comportamento

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, a mosca da fruta, tem sido utilizada para estudar os mecanismos moleculares de uma ampla gama de doenças humanas, tais como o cancro, doença cardiovascular e várias doenças neurológicas 1. Nós otimizamos simples e robusto ensaios comportamentais para determinar a locomoção das larvas, a capacidade de escalar adulto (ensaio ANEL), e os comportamentos de corte de Drosophila. Estes ensaios comportamentais são amplamente aplicáveis ​​para o estudo do papel dos fatores genéticos e ambientais sobre o comportamento da mosca. Capacidade de rastreamento das larvas pode ser confiavelmente utilizado para determinar alterações em início de carreira nas habilidades de rastreamento de larvas de Drosophila e também para examinar efeito de drogas ou de genes de doenças humanas (em moscas transgénicas) em sua locomoção. O ensaio de rastreamento larval torna-se mais aplicável se a expressão ou a supressão de um gene provoca letalidade nas fases de pupa ou adulto, como estas moscas não chegam à idade adulta, onde de outra forma poderia ser avaliado. Esta base umssay também pode ser utilizado em conjunto com luz brilhante ou stress para examinar respostas comportamentais adicionais em larvas de Drosophila. Comportamento de corte tem sido amplamente utilizada para investigar base genética do comportamento sexual, e também pode ser usado para examinar a actividade e coordenação, bem como a aprendizagem ea memória. Drosophila comportamento de corte envolve a troca de vários estímulos sensoriais incluindo visual, auditivo, e os sinais de quimio entre homens e mulheres que levam a uma série complexa de condutas motoras bem caracterizadas, culminando na cópula bem-sucedida. Ensaios adultos tradicionais de escalada (geotaxis negativos) são de trabalho, tedioso intensivo e demorado, com variação significativa entre os diferentes estudos 2-4. O rápido iterativo geotaxis negativos (ANEL) ensaio 5 tem muitas vantagens sobre os protocolos mais amplamente empregadas, oferecendo uma abordagem de transferência reproduzível, sensível e de alta para quantificar locomotor adulto e negativos geotaxis behaviors. No ensaio de RING, vários genótipos ou tratamentos de drogas podem ser testados simultaneamente utilizando grande número de animais, com a abordagem de alto rendimento tornando-o mais favorável para as experiências de rastreio.

Drosophila melanogaster é um sistema modelo de genética e comportamentalmente tratável que tem sido usada para compreender a base molecular e celular de muitos processos biológicos importantes para mais de um século 1. Drosophila tem sido bem explorado para obter insights sobre a base genética do comportamento da mosca.

Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento

A *Drosophila melanogaster*, a mosca-da-fruta, tem sido utilizada para estudar os mecanismos moleculares de uma ampla gama de doenças humanas, tais como o cancro, doenças cardiovasculares...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar métodos para examinar comportamentos sensoriais, motores e de coordenação em drosófila. Isso é realizado primeiramente avaliando a função motora de larvas, utilizando o ensaio de rastejamento, avaliando a função motora de adultos, utilizando o ensaio do anel, e avaliando as habilidades de coordenação e sensoriais de adultos com o ensaio de cortejo. Em última instância, este conjunto de ensaios comportamentais pode mostrar como fatores genéticos e externos, como tratamentos com drogas, podem influenciar a atividade e a coordenação.Intra sofala. A principal vantagem deste ensaio em relação a métodos existentes, como o eixo geo negativo, é que o ensaio em anel apresenta maior produtividade e sensibilidade. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área das doenças neurodegenerativas, como a detecção em estágios iniciais de defeitos locomotores.Este ensaio será demonstrado pela Dra. Jamie Becknell, pós-doutoranda do meu laboratório. O ensaio de rastejamento larval é utilizado para medir o efeito de fatores genéticos e ambientais sobre a motilidade. Para começar, monte um cruzamento de 10 a 15 machos e 10 a 15 fêmeas v

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Ensaios de comportamento para as funções de medição de locomoção, aprendizado e habilidades de memória...

Locomotor ensaio, Aprendizagem e Memória Os déficits no Drosophila Modelos de neurodegeneração

A agressão é um comportamento inato e a experiência anterior de luta afeta a estratégia de luta e o resultado de competições posteriores em moscas. Este vídeo descreve um ensaio usado para estudar o comportamento agressivo da Drosophila. O protocolo de exemplo apresenta o ensaio realizado em uma configuração que elimina o manuseio de moscas e, portanto, reduz o estresse para os animais, o que de outra forma afetaria o desempenho dos sujeitos.

drosófila Ensaio de agressão: um método para testar a plasticidade comportamental em moscas

Neste artigo de vídeo, descrevemos um método automatizado para medir o efeito de fome ou saciedade em olfativo comportamento de busca de alimentos dependente na fruta Drosophila melanogaster mosca adulta.

A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em Drosophila

Aqui nós descrevemos um método para a medição rápida e precisa do desempenho de vôo em Drosophila, permitindo seleção de alto rendimento.

Um método melhorado para rápido e preciso de medição de desempenho em vôo<em&gt; Drosophila</em

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar a evitação de indivíduos estressados. Este paradigma é poderoso, mas fácil de usar, e pode ser usado para avaliar a influência de genes e ambiente em um tipo de interação social em Drosophila melanogaster.

Ensaio simples para Quantificação de Prevenção Social Drosophila melanogaster

Para identificar novas mutações que afetam a mecanosensação, projetamos um ensaio que mede a resposta comportamental à estimulação tátil de cerdas de moscas em clones mutantes gerados pelo método MARCM. A combinação de técnicas permite a identificação de mutações mecanossensíveis que, de outra forma, seriam letais.

Clones em um ensaio comportamental para Mechanosensation de MarcM baseada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Descrevemos aqui uma configuração comportamental e método de análise de dados para testar as respostas olfativas de até 100 moscas do vinagre (Drosophila melanogaster). Este sistema pode ser usado com estímulos olfativos únicos ou múltiplos e adaptável para ativação optogenética ou silenciamento de subconjuntos neuronais.

Comportamentos olfativos ensaiadas pelo monitoramento do computador de<em&gt; Drosophila</em&gt; Em um olfatômetro de quatro quadrantes

O presente protocolo avalia a atividade locomotora de Drosophila rastreando e analisando o movimento de moscas em uma arena artesanal usando software de código aberto Fiji, compatível com plugins para segmentar pixels de cada quadro com base em gravação de vídeo de alta definição para calcular parâmetros de velocidade, distância, etc.

Uma técnica simples para avaliar a atividade locomotora em Drosophila

O Transtorno do Espectro do Autismo (TEA) está associado ao comportamento social e comunicativo prejudicado e ao surgimento de comportamento repetitivo. Para estudar a inter-relação entre genes de TEA e déficits comportamentais no modelo de Drosophila , cinco paradigmas comportamentais são descritos neste artigo para testar o espaçamento social, agressão, namoro, aliciamento e comportamento de habituação.

Paradigmas para Avaliação Comportamental no Modelo de Drosophila de Transtorno do Espectro do Autismo

O protocolo apresenta um método de alto rendimento e custo-benefício para avaliar a neurotoxicidade na mosca-da-fruta por meio da quantificação da disfunção locomotora como alternativa aos modelos tradicionais de mamíferos. Tem como objetivo avaliar os efeitos neurotóxicos de compostos farmacêuticos, agentes ambientais ou modificações genéticas usando um modelo sensível, reprodutível e eticamente favorável.

Análise comportamental da disfunção locomotora em Drosophila melanogaster como leitura de neurotoxicidade

Esse protocolo fornece uma estrutura para avaliar mudanças comportamentais induzidas pelo estresse em Drosophila melanogaster. Combinar ensaios complementares permite quantificar atividade, exploração e tomada de decisão para moscas individuais. A abordagem é flexível e pode ser adaptada a uma ampla gama de estudos que investigam biologia do estresse, metabolismo e função neurocomportamental.

Fenotipagem Comportamental Multimodal de Estados Semelhantes à Depressão Induzidos pelo Estresse em Drosophila melanogaster

Aprenda métodos de ensaio para avaliar comportamentos motores e sensoriais em Drosophila melanogaster. Este protocolo demonstra ensaios de rastejamento, anel e cortejo para estudar função motora, coordenação e fatores genéticos.

Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento

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