Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar métodos de exame dos comportamentos sensoriais e de coordenação motores da drosófila. Isso é feito avaliando primeiro a função motora da lava, usando o ensaio de rastreamento, avaliando a função motora do adulto, usando o ensaio do anel e avaliando a coordenação do adulto e as habilidades sensoriais com o ensaio de namoro. Em última análise, este painel de ensaios comportamentais pode mostrar como fatores genéticos e externos, como tratamentos medicamentosos, podem influenciar a atividade e a coordenação.

Intra sophala. A principal vantagem deste ensaio sobre os métodos existentes, como o eixo geográfico negativo, é que o ensaio em anel é de maior rendimento e mais sensível. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das doenças neurodegenerativas, como a detecção em estágio inicial de defeitos locomotores.

Demonstrando este ensaio estará o Dr. Jamie Becknell, um pós-doutorado do meu laboratório. O asay de rastreamento larval é usado para medir o efeito de fatores genéticos e ambientais na motilidade para começar a montar um cruzamento de 10 a 15 machos e 10 a 15 virgens em uma garrafa padrão. Após 24 horas, os adultos saudáveis terão posto ovos suficientes para preencher a mamadeira para manter a população com idade correspondente a 24 horas.

Limpe os adultos para uma garrafa nova e repita o processo. Agora incube a garrafa até que as larvas da terceira estrela sejam observadas na comida para a garrafa. Adicione 50 a 100 mililitros de sacarose a 20% e deixe descansar por 20 minutos.

As larvas flutuarão até o topo, coletarão as larvas usando uma pipeta sorológica de 25 mililitros com o corte da ponta e colocarão em uma cesta de malha. Lave as larvas na cesta de malha duas vezes com água deionizada. Eles agora podem ser experimentados.

Para tratar as larvas com um medicamento, use uma escova para transportar o número desejado de larvas para um copo de cinco mililitros contendo uma solução de sacarose a 5% e o medicamento de interesse. Deixe-os se alimentar da solução de açúcar drogada por 15 minutos, depois despeje-os de volta na cesta de malha, enxágue-os e prossiga com a medição do efeito da droga na motilidade. Use uma escova para transportar uma lava individual para uma placa de Petri de 15 centímetros contendo 2%aros.

Coloque sobre uma folha de papel de enxerto. Agora colete os dados. Basta contar o número de linhas de grade que a lava cruza em um minuto.

Em seguida, use o pincel para transferir a lava para o poço de uma placa de dissecação de vidro contendo uma solução diluída de pasta de fermento sob um microscópio de dissecação durante um período de um minuto, conte as contrações de Percys. Uma única contração é contada como um movimento posterior completo ao anterior. Repita até que o número desejado de larvas tenha sido contado.

O protocolo do anel mede a velocidade locomotiva de animais adultos, coleta moscas machos adultas recém-emergidas sob anestesia leve e as transfere para um arquivo padrão contendo alimentos normais ou drogados. Coloque aproximadamente 25 moscas por frasco. Mantenha as moscas em temperatura ambiente por dois a três dias para uma recuperação completa da anestesia e acúmulo de níveis de drogas em estado estacionário.

Em seguida, transfira cerca de 25 moscas sem anestesia para frascos de poliestireno com tampões moldados e monte os frascos em um ou mais aparelhos de anel. Deixe as moscas descansarem por 15 a 20 minutos enquanto alinha uma câmera digital para fotografar os frascos de lado, tenha um cronômetro pronto e ajuste-o para a duração desejada para o ensaio. Normalmente três segundos para realizar o ensaio.

Segure o aparelho de anel em uma mão sem perturbar as moscas e segure o temporizador da câmera com a outra mão com força. Bata no aparelho no banco três vezes para derrubar as moscas e, simultaneamente, inicie o cronômetro de contagem regressiva da câmera. Repita o ensaio uma vez por minuto até que cinco ou seis tentativas tenham sido realizadas.

É fundamental não reutilizar os frascos de teste de poliestireno após a coleta dos conjuntos de dados iniciais. Porque as moscas novas colocadas em frascos usados não sobem na mesma medida que as moscas colocadas em frascos novos. Para coletar os dados usando um visualizador de imagens, marque a altura média, suba pelos diferentes grupos.

Este ensaio requer cruzamentos genéticos preparados em garrafas que estão produzindo progênie abundante para coletar moscas para o ensaio. Dentro de algumas horas após o subjetivo do animal, o amanhecer limpa as garrafas para coletar todos os adultos em intervalos de três a quatro horas. Colete machos e fêmeas sexualmente ingênuos recém-emergidos e aloje os machos individualmente em frascos ou tubos com comida para abrigar as fêmeas em grupos de cinco a seis.

Em recintos semelhantes, um número igual de machos e fêmeas é necessário para o ensaio. Depois de isolar as moscas coletadas por cinco dias, prepare-se para carregá-las em uma roda de acoplamento e realizar o ensaio. Em seguida, transfira cuidadosamente uma fêmea e um macho para a câmara de uma roda de acoplamento sob um microscópio de dissecação.

Observe o par por 10 minutos ou até que eles copulem com sucesso durante esse tempo. Registre quando cada um dos vários comportamentos é observado pela primeira vez. Registre quando o homem se vira pela primeira vez para o registro feminino.

Quando o macho toca pela primeira vez a fêmea com seu registro de perna, quando o macho primeiro se estende e vibra um registro de asa quando o macho lambe pela primeira vez o registro da genitália feminina Quando o macho primeiro enrola seu abdômen sob si mesmo. Registre quando o homem tenta montar o e-mail feminino pela primeira vez. Finalmente, registre o tempo total envolvido no comportamento de namoro até que ocorra a cópula.

Para animais do tipo selvagem, isso ocorre quase sempre dentro de cinco a 10 minutos, colete dados por três parâmetros diferentes. Primeiro, a latência de um comportamento é o tempo que leva antes de ser observado pela primeira vez. Em segundo lugar, a frequência de um comportamento é se ele é observado ou não.

E terceiro, o índice de namoro é o tempo gasto no namoro dividido pelo tempo total e até a cópula em um experimento com animais. Abrigando mutações em F-U-S-T-L-S relacionadas a uma esclerose lateral miotrófica. Os mutantes genéticos com um centro de inserção mostraram metade da capacidade de rastreamento dos controles do tipo selvagem à esquerda e uma mutação missense R 5 21 C reduziu a velocidade de rastreamento para apenas cerca de um centímetro por minuto.

O teste de anel de moscas adultas jovens do tipo selvagem resultou em uma altura média, subida entre três e cinco centímetros em um período de três segundos. Neste ensaio, nenhuma dessensibilização foi observada em até cinco tentativas consecutivas com intervalo de um minuto ao tentar o ensaio do anel. É importante lembrar de ser o mais preciso possível em relação ao tempo.

Uma vez dominado, o ensaio de aglomeração de larvas pode ser feito em 30 a 40 minutos para observar 10 tentativas para um genótipo, se for realizado corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você também deve ter uma boa compreensão de como observar e pontuar comportamentos de namoro na mosca.