A Molecular Auslesen Langfristige Olfactory Anpassung in C. elegans

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, die Entwicklung und Implementierung einer molekularen Auslesung der langfristigen olfaktorischen Anpassung in Meereselgan zu beschreiben, die den Anpassungszustand eines Tieres beschreibt. Dies wird erreicht, indem eine Proteinkinase G namens Ei L vier mit einem grün fluoreszierenden Proteinmolekül markiert und diese Proteinfusion in den WC-Neuronen der Amphiflügelzellen vom Typ C oder A exprimiert wird. In einem zweiten Schritt werden Tiere, die die GFP-markierte Form von Ei L vier in den A-WC-Neuronen exprimieren, auf Nematoden-Wachstumsmedienplatten kultiviert, die die bakterielle Nahrungsquelle OP 50 enthalten. Dann, nach vier Tagen, wird eine Population von Tieren von den Anbauplatten gewaschen und 80 Minuten lang einem vom A WC wahrgenommenen Geruch ausgesetzt, um eine langfristige olfaktorische Anpassung zu fördern.

Die Ergebnisse zeigen eine nukleäre Lokalisation des GFP-markierten Eies L vier im A WC von adaptierten Tieren im Vergleich zu einer zytoplasmatischen Lokalisation von GFP markiertem ALE vier von unangepassten Kontrolltieren Durch die Erstellung einer funktionellen Kopie von ALE vier Feldern, den beiden grün fluoreszierenden Proteinen. Wir können die subzelluläre Lokalisation von ACO four in A WC verfolgen und den Verhaltenszustand des Tieres anhand der GFP-Lokalisation beschreiben. Dieses molekulare Werkzeug ermöglicht es uns, schnell die Rolle verschiedener Mutanten oder Behandlungen bei der Gestaltung der zellulären Produktion nach anhaltender neuronaler Stimulation zu untersuchen.

Dieses Protokoll beginnt mit der Konstruktion von GFP-markierten Eiern L vier exprimierenden Tieren, wie in dem schriftlichen Verfahren zu diesem Video beschrieben. Die letzte integrierte Linie wird als I als 500 bezeichnet, und das GFP-markierte Ei L mit vier Molekülen als GFP-Ei L vier kultiviert die IS 500-Tiere bei 25 Grad Celsius auf Standard-10-Zentimeter-NGM-Platten. Am ersten Tag sitzen sie mit OP 50 E coli-Bakterien, Picken vier bis fünf sind 500 Tiere im Larvenstadium vier von Platten, die bei 25 Grad Celsius kultiviert wurden, auf 10 Zentimeter op 50 e coli besäte Platten, indem ein kleiner Platindraht, der als Pickel bezeichnet wird, verwendet wird, um die Tiere aufzunehmen und zu übertragen.

Wiederholen Sie dies für vier weitere Teller. Inkubieren Sie die Platten am vierten Tag bei 25 Grad Celsius. Waschen Sie erwachsene Populationen von IS 500 Tieren von den großen NGM-Platten ab, indem Sie die Platte als Basalpuffer hinzufügen und vorsichtig herumschwenken.

Dadurch werden die Tiere von der Plattenoberfläche in die Pufferlösung entlagert. Aspirieren Sie die Tiere mit Einweg-Glaspipetten von der Platte und geben sie in ein 1,5-Milliliter-Einorröhrchen. Beginnen Sie die Translokationsassays, indem Sie die 500 Tiere in Basilikum waschen, um Bakterien zu entfernen, die nicht zentrifugieren.

Tiere zwischen den Wäschen. Lassen Sie die Tiere lieber durch die Schwerkraft in einem stationären 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen siedeln. Es ist wichtig sicherzustellen, dass alle Bakterien entfernt werden und dass die NGM-Platten frei von Verunreinigungen sind, da sich verbleibende Bakterien negativ auf das Ergebnis des Translokationsassays auswirken.

Wiederholen Sie den Waschgang mit Basilikum zweimal. Stellen Sie die Anpassungslösung her, indem Sie 100 Milliliter S-Basilikumpuffer in einen 100-Milliliter-Messzylinder geben. Wenn Sie eine Aldehydanpassung durchführen, fügen Sie 7,5 Mikroliter Aldehyd zu 100 Millilitern ESP-Basilikum hinzu und versiegeln Sie den Zylinder mit einem Streifen Param.

Drehen Sie den Messzylinder, der als Basilikum und Geruch enthält, vorsichtig 30 Mal um. Um eine gleichmäßige Emulsion zu erhalten, fügen Sie jedem Röhrchen Tiere hinzu und versuchen Sie, die Anzahl der Tiere zwischen 100 und 200 in jedem Röhrchen zu halten. Mit etwas Übung ist es möglich, die ungefähre Anzahl der Tiere in einem Gaumen mit dem Auge zu schätzen, nachdem sich die Tiere niedergelassen haben.

Nach der S-Basilikumwäsche die gesamte Flüssigkeit aus dem Epi-Orph-Röhrchen entfernen, ein neues Röhrchen positiv und das andere neue Röhrchen als negativ beschriften. Geben Sie dann einen Milliliter der Adaptionsmischung in das Mikrozentrifugenröhrchen mit positiver Adaptation und geben Sie einen Milliliter S-Basilikum in das negative unangepasste Mikrozentrifugenröhrchen mit Kontrolle. Setzen Sie einen 1,5-Milliliter-Kappenschutz für Mikrozentrifugenröhrchen auf jedes Röhrchen und legen Sie die Röhrchen 80 Minuten lang auf einen Rotator.

Nach 80 Minuten waschen Sie die Tiere dreimal in S-Basilikum, damit sich die Tiere zwischen den einzelnen Wäschen durch die Schwerkraft absetzen können. Stellen Sie 2%aros-Pads her, die fünf Millimolare Natriumazide enthalten, indem Sie die Gelelektrophorese aros auflösen. Geben Sie in destilliertem Wasser einen einzelnen Tropfen mol und aros, die Natriumazid enthalten, auf einen Glasobjektträger. Legen Sie sofort einen weiteren Glasmikroskopobjektträger auf den ersten Objektträger, um den Tropfen geschmolzenen Agros zu glätten.

Lassen Sie es 30 Sekunden einwirken und toupieren Sie die Objektträger dann vorsichtig auseinander, so dass ein Objektträger ein flaches Arous-Pad von etwa einem Millimeter hat. An diesem Punkt ist es unerlässlich, dass jeder Experimentator einen Schlüssel entwickelt, um zu verfolgen, welche Objektträger das positive Experiment und welche die negative Kontrolle sind. Nachdem sich die Würmer aus dem letzten Waschen als Basilikum abgesetzt haben, entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit und geben Sie die Tiere tropfenweise auf die aros Pads mehrerer Objektträger.

Es ist wichtig, die Anzahl der Tiere pro Rutsche auf 50 bis 100 zu begrenzen. Zu viele Tiere pro Folie erschweren die Bewertung und erzeugen oft ein zerstreutes Leuchten. Nach der Anregung mit blauem Licht kann überschüssige Flüssigkeit mit einem kleinen Kim-Tuch aus dem Aros-Pad abgeleitet werden.

Legen Sie einen 0,5 Millimeter dicken Glasabdeckschirm auf das Pad und lassen Sie es zwei Minuten lang stehen, damit das Natriumazid die Tiere bewegungsunfähig machen kann. Geben Sie als Nächstes die Objektträger an eine andere Person weiter, die das Lokalisierungsmuster GFP Egg L vier blind bewertet. Auf diese Weise werden für jedes Experiment oder jeden Bias-Score zwischen 50 und 100 Tiere pro Objektträger mit einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop mit Objektiven mit 10 x 40-facher und 63-facher Vergrößerung und G-F-P-R-F-P-Filtern kontrolliert.

Lokalisieren Sie zunächst Tiere unter 10-facher Vergrößerung mit Hellfeldbeleuchtung. Zweitens, lokalisieren Sie das A-WC-Neuron, indem Sie die Hellfeldbeleuchtung ausschalten und den RFP-Filter verwenden. Der Promotorgeruch.

Ein DS red steuert die Expression in einem WB- und einem WC-Neuron. Die A-WC-Neuronen haben im Vergleich zu den WB-Zellkörpern, die kleiner und kreisförmig sind, ausgeprägte ovale Zellkörper. Sobald der A-WC-Zellkörper lokalisiert wurde, wechseln Sie zum GFP-Filter und zeichnen Sie die Lokalisation des GFP-Eies L vier als nukleär oder zytoplasmatisch auf.

Die Verwendung eines Zählers ermöglicht es dem Experimentator, während des Ritzens des Objektträgers weiter in das Okular zu schauen. Dieser Vorgang wird mindestens dreimal an verschiedenen Tagen wiederholt, um statistisch signifikante Daten zu erhalten. Ein Beispiel für das Lokalisationsmuster von GFP Ei L vier im A WC vor und nach längerer Geruchsexposition ist vor längerer Geruchsexposition dargestellt.

Das GFP-Ei L vier ist nach 80 Minuten Geruchsexposition im Zytosol des A WC lokalisiert. Das vierte GFP-Ei ist auf der Verhaltensebene im Kern des A-WC lokalisiert. Tiere mit zytosolischem GFP-Ei vier in einem WC werden von einer Punktgeruchsquelle angezogen.

Diese Grafik wurde aus repräsentativen Ergebnissen von Chemotaxis-Assays an nicht adaptierten Tieren erstellt. Beachten Sie, dass der CHEMOTAXIS-Index nahe bei eins liegt. Tiere, die im WC A die nukleare G-F-P-E-L vier aufweisen, werden nicht von einer Punktquelle des adaptiven Geruchs angezogen.

Diese Grafik wurde aus repräsentativen Ergebnissen von CHEMOTAXIS-Assays an adoptierten Tieren erstellt. Beachten Sie, dass der CHEMOTAXIS-Index nahe Null liegt. Sobald Ei L vier in den Kern der A-WC-Neuronen gelangt, verursacht es stabile und lang anhaltende Veränderungen in der Physiologie von A WC, die auch dann bestehen bleiben, wenn sich Ei L vier nicht mehr im Zellkern befindet.

Nach 80 Minuten Geruchsexposition ignorieren die Tiere eine Punktquelle des adaptiven Geruchs, und diese Anpassung bleibt auch nach 120 Minuten Erholung bestehen. Nach 80 Minuten Geruchseinwirkung. GFP Egle vier wird im Kern des A WC beobachtet. Dieser nukleare Eintrag in die NU ist sowohl notwendig als auch ausreichend, um eine langfristige Anpassung im A WC zu induzieren. Nach 120 Minuten Genesung weisen diese Tiere kein nukleares GFP Eagle vier mehr auf, ignorieren aber immer noch eine Punktquelle des adaptiven Geruchsaldehyds auf Verhaltensebene, ohne Berücksichtigung der Kultivierungszeiten.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in wenigen Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.