Staphylococcus aureus usando hemoglobina humana como uma fonte de ferro

Este experimento testa a capacidade do staphylococcus aureus de utilizar a hemoglobina humana como única fonte de ferro. Primeiro, isole os glóbulos vermelhos do sangue humano fresco. Purifique a hemoglobina por cromatografia líquida de alta eficiência para garantir a integridade da hemoglobina.

Agora adicione hemoglobina ao meio empobrecido de ferro para fornecer o ferro na forma de hemoglobina Próxima cultura. S reus. Na presença de hemoglobina e medir sua capacidade de utilizar a hemoglobina como fonte de ferro.

Os resultados mostram que o reus prolifera na presença de hemoglobina como única fonte de ferro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da microbiologia, como se um patógeno pode utilizar proteínas do hospedeiro como fontes de ferro e quais mecanismos são necessários para utilizar o ferro usando esse processo. Portanto, esse método pode fornecer informações sobre a aquisição de estafilococos por ferro da hemoglobina.

Também pode ser aplicado aos estudos de outras bactérias e como elas usam proteínas contendo ferro do hospedeiro. Demonstrando essa técnica estarão GLA Ani e Catherine Haley do meu laboratório. Primeiro, obtenha sangue humano recém-isolado, suplementado com um anticoagulante e mantenha a quatro graus Celsius durante toda a purificação Pellet os glóbulos vermelhos por centrifugação por 20 minutos a 15.000 Gs.Aspire cuidadosamente o snat e ressuspenda suavemente o pellet em solução gelada, cloreto de sódio a 0,9% Após três lavagens, resus, suspenda o pellet em um volume de triss gelada de 10 milimolares, HCL para ly as hemácias por pressão osmótica.

Em seguida, adicione tolueno a 20% do volume final e incube a quatro graus Celsius em um rotador durante a noite. Próxima centrífuga. O lisado a 20.000 Gs por hora.

Coletar a fração média do hemolisado, deixando a camada superior de tolueno e o pellet intactos. Passe o hemolisado por um filtro de seringa de 0,44 micrômetro. Se a solução contiver partículas e não puder ser passada através do filtro, repita a centrifugação a alta velocidade.

Agora purifique a hemoglobina com uma coluna de troca aniônica de cromatografia líquida de alta eficiência. Use uma fase móvel A de 10 milimolares tris, HCL, e uma fase móvel B de 10 milimolares tris, HCL mais 0,5 molar de cloreto de sódio. Execute um gradiente de 0% a 100% do solvente B durante dois minutos a uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto.

Monitore a eluição com base na absorção em 410 nanômetros e 280 nanômetros. Colete a fração caracterizada por uma cor vermelha brilhante e um pico de absorção proeminente. Dialisar a eluição contra solução salina tamponada com fosfato durante aproximadamente 16 horas.

Para esterilizar a amostra, passe-a por um filtro de seringa de 0,22 micrômetro para determinar a concentração de hemoglobina. Prepare soluções padrão HP em PBS. Agora misture as soluções padrão ou as soluções de amostra com dois reagentes xra kins na proporção de um para um em placas de 96 poços após uma incubação de 15 minutos meça a absorbância a 540 nanômetros.

Traçar uma curva padrão e determinar a concentração de HP das amostras de cinco a 15 miligramas por mililitro. Os rendimentos são alíquotas típicas de amostra de hemoglobina purificada de 15 a 20 microgramas em dois géis de página 15% STS. Pinte um dos géis e transfira as proteínas de outro gel para uma membrana de nitrocelulose para immunoblot para congelamento da hemoglobina e armazene alíquotas de um mililitro da hemoglobina isolada em nitrogênio líquido de uma faixa de estoque congelada S aureus em tríptico, ágar soja e incube a 37 graus Celsius por 20 a 24 horas.

Inocular colônias individuais em cinco mililitros de RPMI contendo E-D-D-H-A e cultivar a 37 graus Celsius com agitação a 180 RP M durante a noite. Pulverize as bactérias por centrifugação por cinco minutos a 7.500 Gs. Em seguida, Resus, suspenda as bactérias em RPMI contendo 0,5 milimolar E-D-D-H-A e normalize para um OD 600 de cerca de três. Em seguida, prepare N-R-P-M-I contendo 2,5 microgramas por mililitro, HB e 0,1 a um milimolar E-D-D-H-A para quelar o ferro livre.

Agora, subcultive 10 microlitros de suspensão bacteriana em um mililitro de N-R-P-M-I mais E-D-D-H-A mais HP, incube as culturas a 37 graus Celsius por até 48 horas com agitação a 180 RRP M a cada seis a 12 horas. Remova 50 microlitros da mistura de cultura com 150 microlitros de PBS em placas de 96 poços e faça leituras de OD 600. Nesta purificação por HPLC da hemoglobina humana do hemolisado, a absorbância do eluato em comprimentos de onda de 280 e 410 nanômetros é medida com a fração cinco contendo a hemoglobina.

Normalmente, rendimentos de cinco a 15 miligramas de hemoglobina por mililitro são obtidos por preparação. A hemoglobina purificada foi analisada por SDS page em duplicata, e os géis foram substituídos por proteínas ou transferidos para nitrocelulose e immunoblotted. Em seguida, a hemoglobina humana purificada foi testada quanto à capacidade de suportar o crescimento do tipo selvagem asus e ASUS que não possui o receptor de hemoglobina necessário para a aquisição de ferro derivado da hemoglobina.

O aumento da densidade óptica das culturas ao longo do tempo indica que em N-R-P-M-I mais E-D-D-H-A mais hb, o tipo selvagem ASUS prolifera, mas o mutante não. Em contraste, a capacidade de utilizar ferro livre suplementado é idêntica tanto no tipo selvagem quanto nas cepas mutantes, nenhuma delas prolifera na ausência de uma fonte. Nesta comparação de meios suplementados com hemoglobina purificada de sangue fresco ou hemoglobina liofilizada, a hemoglobina purificada do sangue requer ISDB para crescimento.

Enquanto a hemoglobina liofilizada permite a proliferação do mutante ISDB Uma vez dominada, uma purificação adequada da hemoglobina pode ser concluída em poucas horas. Lembre-se, os doadores são potenciais portadores de patógenos transmitidos pelo sangue, portanto, trate o sangue humano como um material de risco biológico.