Name: Staphylococcus aureus usando hemoglobina humana como uma fonte de ferro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Aprenda a avaliar a aquisição de ferro em Staphylococcus aureus utilizando hemoglobina humana como única fonte de ferro. Este ensaio de crescimento identifica fatores bacterianos essenciais para o metabolismo do ferro.

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Esta pesquisa foi suportada por concessões de Saúde Pública dos Estados Unidos Serviço AI69233 e AI073843 do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas. EPS é um Burroughs Wellcome Fellow na patogênese de doenças infecciosas. KPH foi financiado pelo Celular e Molecular Microbiology concessão de Treinamento Programa 5 T32 A107611-10.

1. Purificação da hemoglobina a partir de sangue fresco <ol><li> Adquirir sangue humano fresco suplementado com um anticoagulante. Manter o sangue em gelo ou a 4 ° C durante a purificação. </li><li> Centrifugar o sangue durante 20 minutos a 1500 x g. As células vermelhas do sangue (RBC) irá ficar na parte inferior do tubo. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet cuidadosamente em solução gelada de NaCl a 0,9% (w / v). Voltar a centrifugar e lavar 3 vezes. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 volume de mM arrefecido com gelo 10 Tris-HCl (pH 8,0). Isto irá induzir a lise dos glóbulos vermelhos devido à pressão osmótica. Adicionar tolueno a ~ 20% do volume final. </li><li> Incubar a 4 ° C durante a noite em um espeto. </li><li> Centrifuga-se o lisado a 20.000 xg durante 1 hora. Recolher a fracção hemolisado meio deixam os tolueno (flutuante no topo) e pellet. Usar uma pipeta de gargalo longo de recolher a fracção do meio. </li><li> Passar através de filtro de seringa de 0,44 | im. Se a solução contiver partículasmatéria e não pode ser passada através do filtro, repetir o passo 1.5. </li><li> Purificar a hemoglobina (Hb) com uma cromatografia líquida de alta performance (HPLC) em coluna de permuta aniónica (Varian, PL-SAX 1000 por 8 um, 150 mm x 4,6 mm). A fase móvel A é 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) e a fase móvel B é 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M de NaCl. Um gradiente de 0% -100% de solvente B é administrado ao longo de 2 min a taxa de fluxo de 2,0 ml / min. A eluição é controlada com base na absorção (λ: 410 nm e 280 nm). Recolher apenas a fracção caracterizada por uma cor vermelho brilhante e um pico de absorção proeminente (Figura 1). </li><li> Dialisar a eluição contra salino tamponado com fosfato (PBS) durante a noite e, em seguida, por algumas horas, de novo. Esterilizar por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 um. </li><li> Para medir a concentração de Hb, preparar soluções-padrão de concentrações conhecidas de hemoglobina em PBS. Determinar a concentração de Hb no exemplo por mistura das soluções-padrão (ver a tabela com reagentes nosed) ou da solução de amostra com o reagente de Drabkin 2x (preparada a partir de pó), a uma proporção de 1:1. Por exemplo, misturar 100 ul de solução de Hb com o reagente de Drabkin 100 ul de 2x, em placas de 96 poços. Incubar durante 15 min e a absorvância medida a 540 nm. Desenhar uma curva padrão e determinar a concentração de Hb na amostra. Cinco a 15 mg / ml rendimentos são típicos. </li><li> Executar 15-20 ug purificado hemoglobina em 15% SDS-PAGE em duplicado. Stain um dos géis; transferir as proteínas a partir de um outro gel para uma membrana de nitrocelulose e imunotransf erência para a hemoglobina (Figura 2). </li><li> Congelar e armazenar alíquotas de 1 ml de hemoglobina em azoto líquido. </li></ol> 2. Preparação de Ferro-empobrecem meios de crescimento <ol><li> Prepare Roswell Park Memorial Institute (RPMI) caldo por dissolução do pó de RPMI em água, adicionar bicarbonato de sódio, tal como recomendado pelo fabricante, e 1% de ácidos cassamino (CA) (w / v). Esterilizar por passagem através de um filtro de 0,2 um e refrig lojarado. </li><li> Prepare-metal empobrecido RPMI (NRPMI) pela adição de 7% (w / v) Chelex 100 e misturando durante a noite numa placa de agitação. Remover Chelex 100, passando através de um filtro de 0,2 um e armazenamento refrigerado. Suplemento meios essenciais com metais não-ferrosos: 25 fiM de ZnCl2, 25 mM de MnCl2, 100 mM de CaCl2 e 1 mM de MgCl2 preparado antecipadamente como uma solução estéril x 1000. Use recipientes de plástico descartáveis ​​para esta etapa para evitar a contaminação de ferro a partir de re-utilizáveis ​​suprimentos. </li></ol> 3. Crescimento Staphylococcus aureus utilizando hemoglobina como uma fonte de ferro Sole <ol><li> Streak S. aureus para isolamento em agar de soja tríptica (TSA) a partir de um estoque congelado. Incubar a 37 ° C durante 20-24 hr. </li><li> Ressuspender o ácido etilenodiamino-N, N&#39;-bis (ácido 2-hidroxifenilacético) (EDDHA) em etanol anidro a 100 mM. EDDHA não entra em solução, mas é esterilizada por etanol. </li><li> Adicionar EDDHA de RPMI a uma concentração final de 0,5 mM. PermitirEDDHA para dissolver, pelo menos, 30 minutos antes de prosseguir para o passo seguinte. Devido ao lote-a-lote de variação, a concentração final de EDDHA pode precisar de ser reduzidos para 0,25 mM para permitir o crescimento bacteriano. </li><li> Inocular colónias isoladas de S. aureus em 5 ml de meio RPMI contendo EDDHA em 15 ml com tampa de rosca tubos cónicos. Incubar a 37 ° C com agitação a 180 rotações por minuto (rpm) durante 16-20 horas. </li><li> Centrifugar as culturas durante a noite para 5 min a 7500 xg e ressuspender o sedimento em NRPMI contendo 0,5 mM de EDDHA. Normalizar a OD 600 ~ 3. </li><li> Prepare NRPMI contendo 2,5 ug por ml de Hb e 0,1-1,0 mM EDDHA. Devido a variação entre os lotes, a concentração necessária EDDHA de quelação de ferro livre no NRPMI pode variar. </li><li> Ul subcultura 10 de suspensão bacteriana a partir do passo 3,5 em 1 ml NRPMI + + EDDHA Hb num tubo de 15 ml com tampa de rosca cónica. </li><li> Incubar as culturas a 37 ° C durante até 48 horas com agitação a 180 rpm ou num tambor giratório. </li><li&gt; Cada hr 6-12 tomar leituras de DO 600, removendo 50 ul da cultura e da sua mistura com 150 ul de PBS, em placas de 96 poços. </li></ol>

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<li>Shen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+unmodified+human+adult+hemoglobin+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).</li>
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</ol>

Não temos nada a revelar.

O ferro é um nutriente essencial necessário por organismos de todos os reinos da vida 15. Em vertebrados, o ferro é sequestrado para evitar a toxicidade causada por este elemento. Este seqüestro também esconde ferro de micróbios invasores em um processo conhecido como imunidade nutricional 16. Em resposta, os patógenos evoluíram estratégias que burlam a imunidade nutricional. Um tal mecanismo depende de hemoglobina, que é o mais abundante fonte de ferro no interior do hospedeiro 17. Hemo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> HPLC em coluna de permuta aniónica </td><td> Varian </td><td> PL1551-3802 </td><td></td></tr><tr><td> Reagente de Drabkin </td><td> Sigma </td><td> D5941-6VL </td><td></td></tr><tr><td> Padrão de hemoglobina </td><td> Pointe Científico </td><td> H7506-STD </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> HyClone </td><td> SH30011.02 </td><td></td></tr><tr><td> Chelex forma sódica 100 </td><td> Sigma </td><td> C7901 </td><td></td></tr><tr><td> EDDHA </td><td> LGC Standards GmbH </td><td> ANC 001 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo hemoglobina um </td><td> Santa Cruz Biotechnology, Inc </td><td> SC-21005 </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Agar de soja tríptica </td><td> BD </td><td> 236920 </td><td></td></tr></tbody></table>

staphylococcus aureus usando hemoglobina humana como uma fonte de ferro

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus é uma bactéria patogênica que requer ferro para realizar funções vitais metabólicas e causam doenças. O reservatório mais abundante de ferro no interior do hospedeiro humano é heme, que é o cofactor da hemoglobina. Para adquirir ferro da hemoglobina, S. aureus utiliza um elaborado sistema conhecido como o determinante superfície de ferro-regulado (DSI) do sistema 1. Componentes da hemoglobina Isd sistema host primeiro ligar, em seguida, extrair e importar heme, e, finalmente, libertar ferro de heme no citoplasma bacteriano 2,3. Este caminho tem sido dissecado através de numerosos estudos in vitro 4-9. Além disso, a contribuição do sistema Isd a infecção tem sido repetidamente demonstrado em modelos de ratos 8,10-14. Que institui a contribuição do sistema Isd à hemoglobina derivada de aquisição de ferro e de crescimento tem se mostrado mais desafiador. Ensaios de crescimento utilizando hemoglobina como fonte única de ferro é complicada by a instabilidade da hemoglobina disponível comercialmente, contaminando ferro livre no meio de crescimento, e a toxicidade associada com quelantes de ferro. Aqui apresentamos um método que supera estas limitações. Hemoglobina de alta qualidade é preparado a partir de sangue fresco e armazenado em azoto líquido. Hemoglobina purificada é complementada em ferro-esgotar meio imitando o ambiente pobre em ferro encontrado por agentes patogénicos no interior do hospedeiro vertebrado. Pela fome S. aureus de ferro livre e completando com uma forma minimamente manipuladas de hemoglobina que induzem o crescimento de uma maneira que é totalmente dependente da capacidade de se ligar a hemoglobina, extrair heme, heme passar através do envelope celular bacteriana e degradar heme no citoplasma. Este ensaio será útil para pesquisadores que procuram elucidar os mecanismos de aquisição de ferro em S. hemoglobin-/heme-derived aureus e, eventualmente, outros agentes patogénicos bacterianos.

Temos hemoglobina humana purificada a partir de hemolisado com HPLC (Protocolo passo 1.7). Figura 1 mostra registada a absorvância do eluato a 280 e 410 nm, comprimentos de onda. Fracção 5 foi recolhido e outras fracções foram descartados. Os rendimentos de 5-15 miligramas de hemoglobina por mililitro de fluido são normalmente adquiridas. Hemoglobina purificada foi analisada por SDS-PAGE em duplicado e os géis foram corados quer para as proteínas ou transferidas para nitrocelulose e imunotrans (Protocol...

Descrevemos aqui um ensaio de crescimento de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Usando hemoglobina como a única fonte de ferro nutrientes disponíveis. Este ensaio estabelece o papel dos fatores bacterianos envolvidos na hemoglobina derivada de aquisição de ferro.

Staphylococcus aureus usando hemoglobina humana como uma fonte de ferro

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Este experimento testa a capacidade do staphylococcus aureus de utilizar a hemoglobina humana como única fonte de ferro. Primeiro, isole os glóbulos vermelhos do sangue humano fresco. Purifique a hemoglobina por cromatografia líquida de alta eficiência para garantir a integridade da hemoglobina.Agora adicione hemoglobina ao meio empobrecido de ferro para fornecer o ferro na forma de hemoglobina Próxima cultura. S reus. Na presença de hemoglobina e medir sua capacidade de utilizar a hemoglobina como fonte de ferro.Os resultados mostram que o reus prolifera na presença de hemoglobina como única fonte de ferro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da microbiologia, como se um patógeno pode utilizar proteínas do hospedeiro como fontes de ferro e quais mecanismos são necessários para utilizar o ferro usando esse processo. Portanto, esse método pode fornecer informações sobre a aquisição de estafilococos por ferro da hemoglobina.Também pode ser aplicado aos estudos de outras bactérias e como elas usam proteínas contendo ferro do hospedeiro. Demonstrando essa técnica estarão GLA Ani e Catherine Haley do meu laboratório. Primeiro, obtenha sangue humano recém-isolado, suplementado com um anticoagulante e mantenha a quatro graus Celsius durante toda a purificação Pellet os glóbulos vermelhos por centrifugação por 20 minutos a 15.000 Gs.Aspire cuidadosamente o snat e ressuspenda suavemente o pellet em solução gelada, cloreto de sódio a 0,9% Após três lavagens, resus, suspenda o pellet em um volume de triss gelada de 10 milimolares, HCL para ly as hemácias por pressão osmótica.Em seguida, adicione tolueno a 20% do volume final e incube a quatro graus Celsius em um rotador durante a noite. Próxima centrífuga. O lisado a 20.000 Gs por hora.Coletar a fração média do hemolisado, deixando a camada superior de tolueno e o pellet intactos. Passe o hemolisado por um filtro de seringa de 0,44 micrômetro. Se a solução contiver partículas e não puder ser passada através do filtro, repita a centrifugação a alta velocidade.Agora purifique a hemoglobina com uma coluna de troca aniônica de cromatografia líquida de alta eficiência. Use uma fase móvel A de 10 milimolares tris, HCL, e uma fase móvel B de 10 milimolares tris, HCL mais 0,5 molar de cloreto de sódio. Execute um gradiente de 0% a 100% do solvente B durante dois minutos a uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto.Monitore a eluição com base na absorção em 410 nanômetros e 280 nanômetros. Colete a fração caracterizada por uma cor vermelha brilhante e um pico de absorção proeminente. Dialisar a eluição contra solução salina tamponada com fosfato durante aproximadamente 16 horas.Para esterilizar a amostra, passe-a por um filtro de seringa de 0,22 micrômetro para determinar a concentração de hemoglobina. Prepare soluções padrão HP em PBS. Agora misture as soluções padrão ou as soluções de amostra com dois reagentes xra kins na proporção de um para um em placas de 96 poços após uma incubação de 15 minutos meça a absorbância a 540 nanômetros.Traçar uma curva padrão e determinar a concentração de HP das amostras de cinco a 15 miligramas por mililitro. Os rendimentos são alíquotas típicas de amostra de hemoglobina purificada de 15 a 20 microgramas em dois géis de página 15% STS. Pinte um dos géis e transfira as proteínas de outro gel para uma membrana de nitrocelulose para immunoblot para congelamento da hemoglobina e armazene alíquotas de um mililitro da hemoglobina isolada em nitrogênio líquido de uma faixa de estoque congelada S aureus em tríptico, ágar soja e incube a 37 graus Celsius por 20 a 24 horas.Inocular colônias individuais em cinco mililitros de RPMI contendo E-D-D-H-A e cultivar a 37 graus Celsius com agitação a 180 RP M durante a noite. Pulverize as bactérias por centrifugação por cinco minutos a 7.500 Gs. Em seguida, Resus, suspenda as bactérias em RPMI contendo 0,5 milimolar E-D-D-H-A e normalize para um OD 600 de cerca de três. Em seguida, prepare N-R-P-M-I contendo 2,5 microgramas por mililitro, HB e 0,1 a um milimolar E-D-D-H-A para quelar o ferro livre.Agora, subcultive 10 microlitros de suspensão bacteriana em um mililitro de N-R-P-M-I mais E-D-D-H-A mais HP, incube as culturas a 37 graus Celsius por até 48 horas com agitação a 180 RRP M a cada seis a 12 horas. Remova 50 microlitros da mistura de cultura com 150 microlitros de PBS em placas de 96 poços e faça leituras de OD 600. Nesta purificação por HPLC da hemoglobina humana do hemolisado, a absorbância do eluato em comprimentos de onda de 280 e 410 nanômetros é medida com a fração cinco contendo a hemoglobina.Normalmente, rendimentos de cinco a 15 miligramas de hemoglobina por mililitro são obtidos por preparação. A hemoglobina purificada foi analisada por SDS page em duplicata, e os géis foram substituídos por proteínas ou transferidos para nitrocelulose e immunoblotted. Em seguida, a hemoglobina humana purificada foi testada quanto à capacidade de suportar o crescimento do tipo selvagem asus e ASUS que não possui o receptor de hemoglobina necessário para a aquisição de ferro derivado da hemoglobina.O aumento da densidade óptica das culturas ao longo do tempo indica que em N-R-P-M-I mais E-D-D-H-A mais hb, o tipo selvagem ASUS prolifera, mas o mutante não. Em contraste, a capacidade de utilizar ferro livre suplementado é idêntica tanto no tipo selvagem quanto nas cepas mutantes, nenhuma delas prolifera na ausência de uma fonte. Nesta comparação de meios suplementados com hemoglobina purificada de sangue fresco ou hemoglobina liofilizada, a hemoglobina purificada do sangue requer ISDB para crescimento.Enquanto a hemoglobina liofilizada permite a proliferação do mutante ISDB Uma vez dominada, uma purificação adequada da hemoglobina pode ser concluída em poucas horas. Lembre-se, os doadores são potenciais portadores de patógenos transmitidos pelo sangue, portanto, trate o sangue humano como um material de risco biológico.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um protocolo geral para o estudo da invasão das células do hospedeiro por um agente patogénico, com foco...

Invasão das células humanas por um agente patogénico

Fonte: Gupta, S., et al. Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas ao ferro. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o procedimento de cultivo de Mycobacterium tuberculosis sob condições limitadas de ferro para induzir estresse de ferro e promover a secreção de sideróforos que suportam a sobrevivência bacteriana.

Cultivo de Mycobacterium tuberculosis em condições limitadas por ferro

Fonte: Maurakis, S., et al. Crescimento limitado por metal de Neisseria gonorrhoeae para caracterização de genes responsivos a metais e aquisição de metais de ligantes hospedeiros. J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra um ensaio de crescimento bacteriano limitado a metais para estudar o papel dos genes responsivos a metais. Bactérias selvagens e mutantes cultivadas em meio empobrecido em metal são incubadas com ligante de metal e seu crescimento é monitorado usando um leitor de placas. Em...

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Fonte: Behera, R.K. et al., Um método baseado em fluorescência para estudar a regulação gênica bacteriana em tecidos infectados. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a preparação de culturas hemolíticas de Staphylococcus aureus para padronizar o crescimento bacteriano e alcançar a sincronização metabólica para estudos de interação hospedeiro-patógeno.

Preparando uma Cultura Hemolítica de Staphylococcus aureus para Estudos de Interação Hospedeiro-Patógeno

Neste vídeo, demonstramos um ensaio para detectar a citotoxicidade de cepas virulentas e menos virulentas de Staphylococcus aureus contra neutrófilos humanos após fagocitose usando citometria de fluxo.

Ensaio de citotoxicidade de cepas de Staphylococcus aureus em neutrófilos após fagocitose

Aqui, descrevemos um protocolo para a extracção de metabolitos a partir de Staphylococcus aureus e a sua subsequente análise por meio de cromatografia líquida e espectrometria de massa.

Uma abordagem baseada em Espectrometria Tandem Cromatografia Líquida de Massachusetts para análise de metabolitos de<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Descrito aqui é um método de análise de expressão gênica bacteriana em tecidos animais em nível celular. Este método fornece um recurso para estudar a diversidade fenotípica ocorrendo dentro de uma população bacteriana em resposta ao ambiente de tecido durante uma infecção.

Um método baseado em fluorescência para estudar o Regulamento de Gene bacteriano em tecidos infectados

Descrevemos aqui um método de crescimento da gonorreia Neisseria em meio líquido restrito ao metal para facilitar a expressão de genes para a captação de metais. Também delineamos experimentos a jusante para caracterizar o fenótipo de gonococci cultivado nessas condições. Esses métodos podem ser adaptados para serem adequados para caracterização de genes reativos metálicos em outras bactérias.

Crescimento metal-limitado de neisseria gonorrhoeae para caracterização de genes reativos metálicos e aquisição de metais da Host Ligands

Este protocolo tem como objetivo descrever como estudar a extensão da internalização do Staphylococcus aureus e sua capacidade de sobreviver dentro da célula hospedeira humana, bem como a eficácia intracelular de compostos antimicrobianos.

Ensaio de proteção de enzimas melhorada para estudar a internalização staphylococcus aureus e eficácia intracelular de compostos antimicrobianos

Neste manuscrito, fornecemos um protocolo abrangente para avaliar a sobrevida de antibióticos para Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus, transformando plasmídeos em P. aeruginosa e S. aureus para criar cepas repórteres e visualizar variantes fenotípicas, como persistentes, por microscopia de epifluorescência de lapso de tempo.

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