Contínua observação microscópica de alta resolução de replicativa envelhecimento em leveduras de brotamento

O objetivo geral deste procedimento é acompanhar células haploides de levedura individualmente durante toda a sua vida útil replicativa. O primeiro passo é fabricar um chip microfluídico contendo uma matriz de microplacas. Em seguida, as células de levedura são carregadas no chip microfluídico, e como a região sob as microplacas possui uma altura semelhante ao diâmetro de uma célula de levedura, as células se acomodam nesse local.

Posteriormente, um fluxo contínuo de meio fresco é aplicado sobre as células de levedura aprisionadas, e as células filhas emergentes são removidas pelo fluxo do meio em microscopia de campo claro e fluorescência. A microscopia é utilizada para visualizar alterações na morfologia celular ou de organelas, expressão proteica e localização proteica que podem ocorrer em células de levedura envelhecidas. A principal vantagem desta técnica em relação ao método clássico de microdissecação é que ela é menos trabalhosa e permite a obtenção de imagens microscópicas contínuas de longo prazo de todo o período de vida de células individuais de levedura.

Embora este método possa fornecer informações sobre o envelhecimento replicativo, ele também pode ser utilizado em estudos que exigem observação microscópica contínua durante períodos prolongados de tempo. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois é necessário ter cuidado em etapas específicas da produção do chip micro feic. Além disso, o carregamento das células no chip micro feic pode exigir alguma experiência.

O molde de wafer de silício é produzido por litografia macia. Para obter detalhes sobre sua produção, consulte o protocolo complementar. Corte um pedaço de etiqueta resistente em tiras finas de aproximadamente 0,5 milímetros por três milímetros.

Com um bisturi, posicione cuidadosamente as tiras sobre o molde de silício ligeiramente acima da estrutura do canal, entre os canais de entrada e o micro pai. Em seguida, cubra um recipiente de vidro de Petri com uma dupla camada de folha de alumínio e coloque o wafer no interior do recipiente. A folha de alumínio impedirá que a PDMS escorra entre o wafer e o recipiente durante a fabricação dos chips microfluídicos.

Para iniciar o procedimento de fabricação de chips microfluídicos, coloque um copo plástico vazio sobre a balança e tare a balança. Despeje 40 gramas da base de PDMS no copo plástico. Adicione o agente de cura do PDMS numa proporção de peso para peso de um para 10, o que, neste caso, equivale a cerca de quatro mililitros.

Usando a pipeta plástica descartável, misture bem por vários minutos; é importante que a mistura fique homogênea para garantir a adequada polimerização do PDMS posteriormente. Despeje o PDMS sobre a pastilha no interior da placa de Petri de vidro. A mistura de PDMS na placa de Petri conterá muitas bolhas, que precisarão ser removidas por desgaseificação.

Coloque o PDMS na placa de Petri dentro de um dessecador conectado a uma bomba de vácuo por cerca de 30 minutos, até que todas as bolhas tenham sido removidas. Polimerize o PDMS colocando a placa de Petri com o wafer sobre uma placa aquecedora a 120 graus Celsius por uma hora, seguido de 65 graus Celsius por mais uma hora. Após as duas horas, remova o wafer de folha de alumínio e o PDMS polimerizado da placa de Petri de vidro.

Retire cuidadosamente a folha de alumínio do PDMS a partir da parte traseira da pastilha. Em seguida, levante com cuidado a camada de PDMS do topo da pastilha. Coloque a camada de PDMS de cabeça para baixo, com os canais voltados para cima sobre a bancada, e corte cuidadosamente os desenhos individuais dos chips impressos no PDMS com o bisturi.

Tente manter cerca de três milímetros de PDMS ao redor das bordas dos canais. O próximo passo é furar orifícios no PDMS nas extremidades do canal de entrada, do canal de saída e do canal lateral, conforme ilustrado neste diagrama. Para fazer um furo, empurre um pino de agulha de calibre 20 completamente através do PDMS de maneira reta.

Remova a coluna de PDMS no toco do atrativo antes de puxar o toco para fora. Novamente, isso evita que a coluna de PDMS obstrua o novo orifício perfurado. Depois que todos os orifícios tiverem sido perfurados, limpe as superfícies do chip de partículas de poeira e resíduos de PDMS colocando fita adesiva sobre ele e removendo imediatamente a fita.

Da mesma forma, limpe o vidro de cobertura ao qual o chip será fixado. Coloque o chip e o vidro de cobertura abaixo da lâmpada UV de um limpador de ozônio UV de bancada, com as faces que precisam ser ligadas voltadas para a lâmpada, expostas à luz UV por seis a oito minutos, e posicione as superfícies expostas uma sobre a outra. Toque suavemente ao redor das bordas do chip para promover a adesão do PDMS ao vidro de cobertura e remover quaisquer bolhas de ar.

Não toque na parte superior da estrutura do canal, pois isso pode fazer com que as microplacas aderem à tampa. O mesmo vale para o vidro. Coloque o dispositivo microfluídico recém-fabricado em uma placa aquecedora a 100 graus Celsius por uma hora.

Posteriormente, verifique a ligação do vidro de cobertura ao chip de PDMS levantando levemente as bordas do chip de PDMS. Se isso não for possível, a ligação foi bem-sucedida e o chip está pronto para uso. Para preparar o chip microfluídico para o carregamento de células, coloque o chip no suporte metálico com gel de silicone entre o vidro do chip e as partes metálicas do suporte.

Para criar um selo impermeável, parafuse as porcas suavemente para evitar quebrar o vidro. Conecte tubos finos ao canal lateral e ao canal de saída do chip. O uso de pinças facilita a inserção dos tubos nos orifícios perfurados.

Encha uma seringa com trava de 50 mililitros com meio de cultura. Remova o ar da seringa e conecte-a sequencialmente a uma seringa. Filtre por um suporte de agulha de calibre 20, um tubo curto e grosso e um tubo fino.

Coloque a seringa na bomba de seringa e avance rapidamente a bomba até que o tubo fino esteja completamente preenchido com meio. Insira o tubo fino conectado à seringa no canal de entrada do chip e deixe o meio fluir através do chip a uma taxa de 10 microlitros por minuto. Colete o meio que sai do chip em uma placa de Petri.

O meio irá escoar pelo canal lateral. Devido à diferença de resistência entre o canal lateral feito com a etiqueta robusta de grande porte e o canal de saída. Coloque o chip sobre a platina do microscópio e ajuste o foco do microscópio sobre as plataformas.

Para iniciar este procedimento, conecte uma seringa com ponteira de cinco mililitros a um adaptador de 20 polegadas e a um tubo grosso. Carregue a seringa com aproximadamente um mililitro da suspensão celular que será carregada no chip. A concentração celular recomendada para o carregamento é entre um e cinco vezes 10 elevado a seis células por mililitro.

Reduza a taxa de fluxo da bomba de seringa para 0,5 microlitros por minuto. A parte mais difícil deste procedimento é o carregamento das células no chip micrométrico. Isso geralmente requer alguma prática.

Conecte a seringa contendo a suspensão celular ao tubo do canal de saída. Carregue as células pressionando o êmbolo da seringa. Observe cuidadosamente as células entrando e se acomodando sob os microsuportes por meio da ocular ou da tela do computador.

Mantenha pressão no êmbolo até que células suficientes se depositem sob os pads. A carga ideal é de uma a três células por pad. Desconecte a seringa usada para o carregamento celular e lave o canal lateral por alguns minutos com taxas de fluxo mais altas para remover bolhas de ar e/ou células que ainda não saíram do chip.

Diminua novamente o fluxo da bomba de seringa para 0,5 microlitros por minuto e feche o canal lateral conectando-o a um tubo grosso contendo um tampão de cateter em sua extremidade. Aumente o fluxo da bomba de seringa até uma taxa final de fluxo de um a cinco microlitros por minuto. As taxas de fluxo podem variar dependendo do meio e da linhagem de levedura.

Inicie um filme com as configurações do microscópio e da câmera adequadas ao objetivo do experimento. Este é um exemplo de filme em lapso de tempo de uma única célula E de tipo selvagem crescendo em YPD. As imagens do meio foram capturadas a cada 10 minutos e a barra de escala mostrada representa cinco micrômetros.

A célula produz um total de 30 brotos antes de morrer. A longevidade replicativa pode ser determinada pela contagem do número de brotos produzidos por uma única célula mãe. Esses dados são transformados em uma curva de longevidade ao se plotar a porcentagem de células viáveis em função do número de brotos produzidos ou do número de gerações.

Esta figura mostra um exemplo de curvas de longevidade obtidas para uma linhagem selvagem de levedura e duas linhagens mutantes. A deleção do gene SER dois resulta em uma longevidade mais curta, enquanto a deleção do gene FOB um resulta em uma longevidade mais longa. A morfologia mitocondrial em função da idade pode ser estudada utilizando o dispositivo microfluídico.

Um experimento de envelhecimento foi realizado com células de levedura selvagem BY 7 42 expressando ILV 3G FP, que é direcionado às mitocôndrias. Nesta figura, um exemplo representativo de alterações associadas à idade na morfologia mitocondrial em uma única célula é indicado pela seta branca. Todas as imagens possuem a mesma escala e a barra de escala representa cinco micrômetros.

O segundo filme com lapso de tempo mostra uma única célula expressando ILV 3G FP do experimento em que a morfologia mitocondrial em função da idade foi observada. As imagens foram capturadas a cada 30 minutos e a barra de escala representa cinco micrômetros. Esta figura final mostra as morfologias mitocondriais observadas no mesmo conjunto de células em diferentes idades replicativas antes de produzirem seu primeiro broto, após 10 brotos e pouco antes da morte.

É incluída uma imagem exemplo de cada classe de morfologia: tubular, tubular fragmentado, pontos e pontos grandes. As alterações morfológicas observadas em células de idade intermediária assemelham-se às relatadas anteriormente. Ao monitorar continuamente as células enquanto se dividem, este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no envelhecimento replicativo de leveduras, como por que uma célula de levedura envelhece, quais mudanças fenotípicas estão ocorrendo e como essas influenciam a longevidade replicativa da levedura?

Após assistir a este vídeo, você deverá saber como criar seus próprios microchips e estudar o envelhecimento replicativo em células utilizando basicamente qualquer microscópio fluorescente.