Contínua observação microscópica de alta resolução de replicativa envelhecimento em leveduras de brotamento

O objetivo geral deste procedimento é rastrear células de levedura haplo únicas durante toda a sua vida útil replicativa. O primeiro passo é fazer um chip microfluídico contendo uma série de micro almofadas. Em seguida, as células de levedura são carregadas no chip microfluídico e, como a área abaixo das microalmofadas tem uma altura semelhante ao diâmetro de uma célula de levedura, as células se depositam lá.

Posteriormente, um fluxo contínuo de meio fresco é aplicado sobre as células de levedura aprisionadas e as células-filhas emergentes são lavadas pelo fluxo de campo claro médio e fluorescência. A microscopia é usada para visualizar mudanças na morfologia celular ou organela, expressão de proteínas e localização de proteínas que podem ocorrer em células de levedura envelhecidas. A principal vantagem dessa técnica sobre o método clássico de microdissecção é que ela é menos trabalhosa e permite imagens microscópicas contínuas de longo prazo de toda a vida útil de células de levedura individuais.

Embora esse método possa fornecer informações sobre o envelhecimento replicativo, ele também pode ser usado para estudos que requerem observação microscópica contínua por períodos prolongados de tempo. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é necessário ter cuidado em etapas específicas da produção do chip micro feic. Além disso, o carregamento das células no chip micro feic pode exigir alguma experiência.

O molde de wafer de silício é produzido por litografia suave. Para obter detalhes sobre sua produção, consulte o protocolo que acompanha o protocolo. O texto cortou um pedaço de etiqueta resistente em tiras finas de cerca de 0,5 milímetros por três milímetros.

Com um bisturi, coloque as tiras cuidadosamente no molde de wafer de silício ligeiramente em cima da estrutura do canal entre os canais de entrada e o micro padre. Em seguida, cubra uma placa de Petri de vidro com uma camada dupla de papel alumínio e coloque o wafer na placa de Petri. A folha de alumínio impedirá que o PDMS escorra entre o wafer e a placa de Petri durante a produção dos chips microfluídicos.

Para iniciar o procedimento de fabricação de chips microfluídicos, coloque um copo de plástico vazio na balança e rasgue a balança. Despeje 40 gramas de base PDMS no copo de plástico. Adicione o agente de cura PDMS em uma proporção peso-peso de um para 10, que neste caso é de cerca de quatro mililitros.

Usando a pipeta de plástico descartável bem misturada por vários minutos, é importante que a mistura seja bem misturada para garantir a polimerização adequada do PDMS posteriormente. Despeje o PDMS em cima do wafer na placa de Petri de vidro. A mistura PDMS na placa de Petri conterá muitas bolhas para Degas.

O PDMS coloca, a placa de Petri em um dessecador conectado a uma bomba de vácuo por cerca de 30 minutos quando todas as bolhas foram removidas. Polimerizar o PDMS colocando a placa de Petri com o wafer em cima de uma placa quente a 120 graus Celsius por uma hora, seguida de 65 graus Celsius por mais uma hora. Após as duas horas, remova o wafer de folha de alumínio e o PDMS polimerizado da placa de Petri de vidro.

Retire a folha de alumínio em PDMS da parte de trás do wafer. Em seguida, levante cuidadosamente a camada de PDMS da parte superior do wafer. Coloque a camada PDMS de cabeça para baixo com os canais voltados para cima na bancada e corte cuidadosamente os desenhos de chip único impressos no PDMS com o bisturi.

Tente reter cerca de três milímetros de PDMS ao redor das bordas dos canais. A próxima etapa é fazer furos no PDMS nas extremidades da saída de entrada e do canal lateral, conforme ilustrado neste diagrama. Para fazer um furo, empurre um stub de isca de calibre 20 por todo o PDMS de maneira reta.

Remova a coluna de PDMS no stub da isca antes de puxar o stub para fora. Novamente, isso evita que a coluna PDMS bloqueie o furo recém-perfurado. Depois que todos os furos forem perfurados, limpe as superfícies do chip de partículas de poeira e PDMS residual colocando fita adesiva sobre ele e removendo imediatamente a fita.

Da mesma forma, limpe o vidro de cobertura ao qual o chip será fixado. Coloque o chip e a tampa do vidro abaixo da lâmpada UV de um limpador de ozônio UV de bancada com os lados que precisam ser colados, de frente para a lâmpada exposta à luz ultravioleta por seis a oito minutos, e coloque as superfícies expostas umas sobre as outras. Bata suavemente nas laterais do chip para promover a fixação do PDMS à lamínula e remover quaisquer bolhas de ar.

Não bata na parte superior da estrutura do canal, pois isso pode fazer com que as micro almofadas fiquem presas à tampa. Vidro também. Coloque a configuração microfluídica recém-feita em uma placa quente a 100 graus Celsius por uma hora.

Em seguida, verifique a ligação da lamínula ao chip PDMS levantando levemente as bordas do chip PDMS. Se isso não for possível, a colagem é bem-sucedida e o chip está pronto para uso. Para preparar o chip microfluídico para carregamento celular, coloque o chip no suporte de metal com gel de silicone entre o vidro do chip e as partes metálicas do suporte.

Para criar uma vedação à prova d'água, aperte as porcas suavemente para evitar quebrar o vidro. Conecte tubos finos ao canal lateral e ao canal de saída do chip. O uso de pinças facilita a inserção da tubulação nos orifícios perfurados.

Encha uma seringa de 50 mililitros com meio de cultura. Retire o ar da seringa e ligue-o sequencialmente a uma seringa. Filtre um toco de isca de calibre 20, um tubo curto e grosso e um tubo fino.

Coloque a seringa na bomba da seringa e avance rapidamente a bomba até que o tubo fino esteja completamente cheio de meio. Empurre o tubo fino conectado à seringa para o canal de entrada do e deixe o meio fluir através do chip a uma taxa de 10 microlitros por minuto. Colete o meio deixando o chip em uma placa de Petri.

O meio se esgotará pelo canal lateral. Por causa da diferença de resistência entre a grande etiqueta resistente feita canal lateral e o canal de saída. Coloque o chip na platina do microscópio e defina o foco do microscópio nas almofadas.

Para iniciar este procedimento, conecte uma seringa de ponta de isca de cinco mililitros a um toco de isca de calibre 20 e um tubo grosso. Carregue a seringa com aproximadamente um mililitro da suspensão celular a ser carregada no chip. A contagem de células preferida para carregamento é entre uma e cinco vezes 10 das seis células por mililitro.

Diminua a vazão da bomba de seringa para 0,5 microlitros por minuto. A parte mais difícil desse procedimento é o carregamento das células no chip microme. Isso geralmente requer alguma prática.

Conecte a seringa contendo a suspensão celular ao tubo do canal de saída. Carregue as células pressionando o êmbolo da seringa. Observe suavemente as células entrando e se acomodando sob as micro almofadas através da ocular ou da tela do computador.

Mantenha a pressão no êmbolo até que células suficientes se assentem sob as almofadas. A carga ideal é de uma a três células por almofada. Desconecte a seringa usada para carregamento de células e lave o canal lateral por alguns minutos em taxas de fluxo mais altas para remover bolhas de ar e/ou células que ainda não saíram do chip.

Diminua o fluxo da bomba de seringa para 0,5 microlitros por minuto novamente e feche o canal lateral conectando-o a um tubo grosso contendo um plugue de cateter em sua extremidade. Aumente o fluxo da bomba de seringa para uma vazão final de um a cinco microlitros por minuto. As taxas de fluxo podem variar dependendo do meio e da cepa de levedura.

Inicie um filme com a configuração do microscópio e da câmera adequada para o objetivo do experimento. Este é um exemplo de filme de lapso de tempo de uma única célula selvagem do tipo E crescendo em YPD. Imagens médias foram tiradas a cada 10 minutos e a barra de escala mostrada representa cinco micrômetros.

A célula produz um total de 30 botões antes de morrer. A vida útil replicativa pode ser determinada pela contagem do número de gemas produzidas por uma única célula-mãe. Esses dados são transformados em uma curva de vida útil, traçando a porcentagem de células viáveis em relação ao número de gemas produzidas ou ao número de gerações.

Esta figura mostra um exemplo de curvas de tempo de vida obtidas para uma cepa de levedura do tipo selvagem e duas cepas mutantes. A deleção do gene SER dois resulta em uma vida útil mais curta, enquanto a deleção do gene FOB um resulta em uma vida útil mais longa. A morfologia mitocondrial em função da idade pode ser estudada usando o dispositivo microfluídico.

Um experimento de envelhecimento foi realizado com células de levedura do tipo selvagem BY 7 42 expressando ILV 3G FP, que é direcionado para as mitocôndrias. Nesta figura, um exemplo representativo de alterações associadas à idade na morfologia mitocondrial em uma única célula é indicado pela seta branca. Todas as imagens são dimensionadas de forma idêntica e a barra de escala representa cinco micrômetros.

O segundo filme de lapso de tempo é de uma única célula expressando ILV 3G FP do experimento onde a morfologia mitocondrial em função da idade foi observada. As imagens foram tiradas a cada 30 minutos e a barra de escala representa cinco micrômetros. Esta figura final mostra as morfologias mitocondriais observadas no mesmo conjunto de células em diferentes idades replicativas antes de produzir seu primeiro botão após 10 botões e antes da morte.

Uma imagem de exemplo de cada classe de morfologia é incluída tubular, tubular fragmentada e manchas e manchas grandes. As mudanças morfológicas observadas em células de meia-idade se assemelham às relatadas anteriormente, monitorando continuamente as células à medida que se dividem. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no envelhecimento replicativo de leveduras, como por que uma célula de levedura envelhece, quais mudanças fenotípicas estão ocorrendo e como elas influenciam a vida útil replicativa da levedura?

Depois de assistir a este vídeo, você deve saber como criar seus próprios microchips e estudar o envelhecimento replicativo em células usando basicamente qualquer microscópio fluorescente.