Medição Span vida replicativa na levedura de brotamento

A levedura de brotamento Croce Visi tem sido amplamente utilizada para estudar a biologia do envelhecimento. Neste artigo, apresentamos um protocolo geral para medir a vida útil replicativa de células-mãe de leveduras. Olá, sou Kristen Steffen, do laboratório de Brian Kennedy no Departamento de Bioquímica da Universidade de Washington.

Hoje mostraremos um procedimento para medir a vida útil replicativa das células-mãe de levedura. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar genes que influenciam a vida útil das células de levedura. Então vamos começar.

Para o experimento de vida útil replicativa e a preparação de células de levedura para análise de vida útil, placas YEPD sólidas precisam ser preparadas para fazer isso. Use a técnica estéril apropriada para preparar essas placas de ágar YEPD. Prepare pelo menos duas placas para cada quatro a cinco cepas a serem analisadas no experimento de vida útil.

Essas placas devem ser preparadas pelo menos dois dias antes do experimento de vida útil e deixadas secar antes de iniciar o ensaio de vida útil. Se o experimento não ocorrer dentro de quatro a cinco dias após o vazamento das placas, elas devem ser embrulhadas em filme ou plástico e colocadas em uma incubadora refrigerada para evitar a dessecação. Remova as cepas de levedura dos estoques congelados e retire para colônias únicas.

Nas placas de ágar YEPD. Até seis cepas podem ser facilmente listradas na mesma placa YEPD, particionando a placa em fatias em forma de torta de tamanhos iguais. Incube as células a 30 graus Celsius por dois dias.

Após a incubação, remova as células da incubadora e as células de patch de uma única colônia para uma nova placa YEPD. Neste momento, as cepas a serem analisadas devem ser revestidas para garantir que o experimento de vida útil replicativa seja realizado às cegas. Onde os dissectores não conhecem a identidade de cepas individuais. Correntes.

Em seguida, incube as células revestidas remendadas a 30 graus Celsius até a noite seguinte. Remova as células e remende levemente as células de cada cepa revestida em placas YEPD frescas. Estes servirão como placas experimentais usadas para a vida útil replicativa.

As células de análise devem ser corrigidas ao longo de uma linha vertical no lado esquerdo da placa YEPD. Não transfira muitas células para uma única placa YEPD nova. Como isso causará um crescimento espesso das células durante a incubação durante a noite e afetará sua vida útil replicativa, aproximadamente três a cinco manchas por placa é o ideal.

Supondo que a análise de vida útil replicativa seja realizada em 20 células de cada patch, agora o experimento de vida útil está configurado e tudo o que eles precisam fazer é incubar durante a noite na bancada. E então amanhã podemos começar o micro dissecação Para posicionar as células de levedura na placa e obter células filhas virgens. Para análise replicativa da vida útil.

Use um microscópio equipado com um aparelho de micro dissecação adequado para leveduras. Transfira aproximadamente 50 células da primeira cepa de remendo para uma posição na placa distal às células remendadas. Se o estágio do seu microscópio for classificado, essas gradações podem ser usadas para garantir que as células sejam fáceis de encontrar durante as iterações subsequentes.

Às vezes, as células podem ficar presas na agulha, o que pode ser um problema se saírem na hora errada. Para se certificar de que a agulha está limpa e livre de células, toque-a repetidamente na superfície do ágar-ágar. Em seguida, crie um orifício no ágar forçando a agulha através da superfície do ágar.

Este orifício servirá como um marcador para orientá-lo na placa durante as iterações subsequentes de dissecção e remoção de células pontilhadas. Tenha cuidado para não colocar células de levedura no buraco, ou elas crescerão e formarão uma colônia logo acima do buraco. Células de levedura individuais alinhadas verticalmente em 20 posições uniformemente espaçadas com um a três diâmetros de agulha entre cada posição da célula.

Para cada poucas células, coloque duas células uma ao lado da outra na mesma posição na linha, em vez de uma. Isso permite redundância durante a seleção de células-filhas virgens. Se uma das células transferidas não se dividir entre a 10ª e a 11ª posições na linha, crie uma série horizontal de sete a oito orifícios no ágar.

Isso servirá como um marcador para orientá-lo na placa durante dissecações subsequentes e remoções de células-filhas. Novamente, tome cuidado para não colocar células de levedura nos buracos ou elas crescerão e formarão uma colônia. Repita esse procedimento para cada adesivo na placa, continuando a organizar as células verticalmente ao longo do mesmo eixo.

É importante lembrar que, ao criar o furo no AER, o número de furos criados corresponda ao número do remendo, de modo que haja um furo para o primeiro remendo e dois furos para o segundo. Uma vez que as células tenham sido dispostas para cada adesivo, paraforme a placa e incube a 30 graus Celsius por aproximadamente duas horas. Lembre-se, a partir deste ponto, todas as placas devem ser para filmadas, exceto quando submetidas à dissecação.

Para evitar a dessecação, repita este procedimento para cada placa. No experimento. Para a análise da vida útil, é importante ter certeza de que cada célula começa como uma célula-filha virgem.

Para fazer isso primeiro, remova as placas da incubadora e verifique se a maioria das células da matriz passou por uma divisão celular. Então, o que temos aqui são células que foram alinhadas anteriormente, e você pode ver que depois de duas horas na incubadora, elas começaram a se dividir. E agora temos uma célula-mãe, a maior ligada ao seu corpo, a célula-filha virgem, e essa célula-filha virgem é uma célula que será usada para começar a vida.

Se for necessário mais tempo para permitir que as divisões celulares sejam concluídas, retorne a placa à incubadora. Começando com a primeira célula da matriz. Use a agulha para separar as células-filhas da célula-mãe, colocando suavemente a agulha em cima das células anexadas.

Às vezes, é útil bater na lateral da base do microscópio enquanto a agulha está apoiada nas células. Em seguida, coloque a célula-filha separada na linha vertical de células, substituindo a célula-mãe e quaisquer células-filhas adicionais e movendo-as temporariamente para o lado. Repita essas etapas para cada uma das células da matriz.

Se uma célula não se dividir, pegue uma célula-filha de uma das células redundantes posicionadas ao lado da célula de teste. Quando terminar, você deve ter 20 células-filhas para cada adesivo alinhadas verticalmente na placa de vida útil. Colete todas as células-mãe e células-filhas extras em uma pilha e transfira-as de volta para uma área perto dos canteiros chamada cemitério.

É importante manter as células indesejadas longe das células submetidas à análise de vida útil para evitar a formação de microcolônias e o esgotamento de nutrientes locais. Uma vez que as células tenham sido separadas, para fora da placa e incube a 30 graus Celsius por aproximadamente duas horas. Repita essas etapas para cada placa no experimento.

Para medir a capacidade replicativa de células individuais, você precisará preparar folhas de dados de vida útil. Uma folha de dados de vida útil pode ser uma grade simples em que cada linha corresponde a uma célula-mãe individual e cada coluna corresponde a um ponto de idade. Certifique-se de rotular cada folha de dados de acordo com o número de cepas a serem analisadas.

Para começar, primeiro, remova as placas da incubadora e verifique se a maioria das células da matriz sofreu pelo menos uma divisão celular. Se for necessário mais tempo para permitir que a divisão celular seja concluída, devolva a placa à incubadora. Comece com a primeira célula da matriz na primeira placa e observe visualmente a mãe e a filha, a célula ou as células para determinar o número de divisões celulares que ocorreram.

Geralmente é fácil determinar quantas células-filhas uma mãe produziu com base em padrões característicos de arranjos celulares. Este é muito simples de ver quantas células ele produziu porque há duas lá e elas são do mesmo tamanho e ambas são menores que a mãe. Registar o número de células-filhas produzidas pela célula-mãe na casa apropriada da folha de pontuação do tempo de vida.

Em seguida, use a agulha para separar as células-filhas da célula-mãe, conforme descrito anteriormente, colocando suavemente a agulha em cima das células anexadas e batendo na lateral da base do microscópio enquanto a agulha está apoiada nas células. Mantenha a célula-mãe em sua posição na linha vertical e mova a célula-filha ou células temporariamente para o lado. Repita essas etapas para cada uma das células da matriz.

Por fim, colete todas as células-filhas descartadas e mova-as para o cemitério localizado perto dos patches originais. Para filme a placa e incube a 30 graus Celsius por duas a três horas. Repita o descarte das células-filhas e a incubação.

Etapa para cada placa no experimento. Repita todo o procedimento até que todas as células-mãe parem de se dividir. Lembre-se de que, à medida que as células-mãe envelhecem, a progressão do ciclo celular se torna mais lenta e será desejável incubar a placa por períodos mais longos entre os pontos de idade, as placas podem ser colocadas a quatro graus Celsius durante a noite.

Os dados brutos produzidos por um experimento de vida útil replicativa são uma lista de números correspondentes às células-filhas produzidas por cada célula-mãe em cada faixa etária. Como visto aqui. Ao somar cada linha da folha de pontuação, obtém-se o tempo de vida replicativo de cada célula-mãe.

Os dados de outras células do mesmo grupo experimental podem ser agrupados para gerar uma curva de sobrevivência e realizar cálculos estatísticos. A curva deve ser aproximadamente consistente com a cinética de Macam de Gomperts, mostrando uma forma sigmoidal com baixa mortalidade precoce, seguida por um declínio relativamente rápido na sobrevida e um achatamento da curva em idades posteriores. Acabamos de mostrar como realizar um experimento de vida útil replicativa de levedura.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar que as células continuarão a se dividir sempre que não estiverem no frio. Portanto, lembre-se de colocar as placas a quatro graus durante a noite para não acabar com muitas células-filhas para contar pela manhã. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.