Medição Span vida replicativa na levedura de brotamento

A levedura brotante Croce Visi tem sido amplamente utilizada para estudar a biologia do envelhecimento. Neste artigo, apresentamos um protocolo geral para medir a longevidade replicativa de células-mãe de levedura. Olá, sou Kristen Steffen do laboratório de Brian Kennedy, do Departamento de Bioquímica da Universidade de Washington.

Hoje vamos mostrar um procedimento para medir a longevidade replicativa de células-mãe de levedura. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar genes que influenciam a longevidade de células de levedura. Então, vamos começar.

Para o experimento de longevidade replicativa e para o preparo de células de levedura para análise de longevidade, é necessário preparar placas sólidas de YEPD. Utilize técnica estéril apropriada para preparar essas placas de ágar YEPD. Prepare pelo menos duas placas para cada grupo de quatro a cinco cepas a serem analisadas no experimento de longevidade.

Essas placas devem ser preparadas pelo menos dois dias antes do experimento de longevidade e devem ser deixadas secar antes de iniciar o ensaio de longevidade. Se o experimento não for realizado entre quatro e cinco dias após o preparo das placas, elas devem ser envolvidas em filme plástico aderente ou plástico e colocadas em uma incubadora refrigerada para evitar dessecação. Retire as linhagens de levedura de estoques congelados e faça estrias para obtenção de colônias isoladas.

Nas placas de ágar YEPD. Até seis cepas podem ser facilmente estriadas na mesma placa YEPD dividindo a placa em setores iguais com formato de fatias de torta. Incubar as células a 30 graus Celsius por dois dias.

Após a incubação, remova as células do incubador e replique células de uma única colônia em uma placa YEPD fresca. Neste momento, as linhagens a serem analisadas devem ser revestidas para garantir que o experimento de longevidade replicativa seja realizado de forma cega, onde os disseccionadores não conheçam a identidade das linhagens individuais.

Em seguida, incubar as células revestidas e repicadas a 30 graus Celsius até a noite seguinte. Remover as células e repicar levemente células de cada linhagem revestida em placas YEPD frescas. Estas servirão como as placas experimentais utilizadas para a determinação da longevidade replicativa.

As células para análise devem ser estriadas ao longo de uma linha vertical no lado esquerdo da placa YEPD. Não transfira muitas células para uma única placa YEPD fresca. Isso causará um crescimento denso das células durante a incubação noturna e afetará seu tempo de vida replicativo; portanto, de três a cinco estrias por placa é ideal.

Assumindo que a análise do tempo de vida replicativo será realizada em 20 células de cada grupo, o experimento de longevidade agora está completamente montado e tudo o que resta é incubar durante a noite sobre a bancada. Então, amanhã, podemos iniciar a microdissecação para posicionar as células de levedura na placa e obter células filhas virgens. Para análise do tempo de vida replicativo.

Utilize um microscópio equipado com um aparato de microdissecação apropriado para leveduras. Transfira aproximadamente 50 células da primeira linhagem em patch para uma posição na placa distante das células em patch. Se a platina do seu microscópio for graduada, essas marcações podem ser usadas para garantir que as células sejam fáceis de localizar durante iterações subsequentes.

Às vezes, as células podem ficar presas na agulha, o que pode ser um problema se saírem no momento errado. Para garantir que a agulha esteja limpa e livre de células, toque-a repetidamente na superfície do ágar. Em seguida, crie um orifício no ágar forçando a agulha a atravessar a superfície do ágar.

Este orifício servirá como marcador para orientá-lo na placa durante as iterações subsequentes da dissecação e remoção de células dotter. Tenha cuidado para não introduzir células de levedura no orifício, pois elas crescerão e formarão uma colônia diretamente acima do orifício. Alinhe verticalmente células individuais de levedura em 20 posições igualmente espaçadas, com um a três diâmetros de agulha entre cada posição celular.

Para cada poucas células, posicione duas células lado a lado na mesma posição da linha, em vez de apenas uma. Isso permite redundância durante a seleção de células filhas virgens. Se uma das células transferidas não se dividir entre as posições 10 e 11 da linha, crie uma série horizontal de sete a oito orifícios no ágar.

Isso servirá como marcador para orientá-lo na placa durante as dissecações subsequentes e remoções de células-filhas. Novamente, tenha cuidado para não introduzir células de levedura nos orifícios, pois elas crescerão e formarão uma colônia. Repita este procedimento para cada setor da placa, continuando a dispor as células verticalmente ao longo do mesmo eixo.

É importante lembrar que, ao criar o orifício na ERA, o número de orifícios feitos deve corresponder ao número do fragmento, de modo que haja um orifício para o primeiro fragmento e dois orifícios para o segundo. Após as células terem sido dispostas para cada fragmento, vedar a placa com filme plástico e incubá-la a 30 graus Celsius por aproximadamente duas horas. Lembre-se de que, a partir deste ponto, todas as placas devem permanecer vedadas com filme plástico, exceto durante a dissecação.

Para evitar a dessecação, repita este procedimento para cada placa no experimento. Para a análise de longevidade, é importante garantir que cada célula comece como uma célula filha virgem.

Para fazer isso primeiro, remova as placas do incubador e verifique se a maioria das células do arranjo sofreu uma divisão celular. O que temos aqui são células que foram alinhadas previamente, e você pode observar que, após duas horas no incubador, elas começaram a se dividir. Agora temos uma célula mãe, a maior, ligada ao seu corpo, a célula filha virgem, e essa célula filha virgem é a célula que será usada para iniciar a vida útil.

Se for necessário mais tempo para permitir que as divisões celulares sejam concluídas, devolva a placa ao incubador. Começando com a primeira célula da matriz, use a agulha para destacar as células filhas da célula mãe colocando suavemente a agulha sobre as células aderidas.

Às vezes é útil tocar levemente o lado da base do microscópio enquanto a agulha está apoiada sobre as células. Em seguida, posicione a célula filha destacada na linha vertical de células, substituindo a célula mãe e quaisquer outras células filhas, movendo temporariamente estas para o lado. Repita esses passos para cada uma das células da matriz.

Se uma célula não se dividir, retire uma célula filha de uma das células redundantes posicionadas ao lado da célula-teste. Ao final, você deverá ter 20 células filhas para cada retalo, alinhadas verticalmente na placa de vida útil. Colete todas as células-mãe e as células filhas extras em um monte e transfira-as de volta para uma área próxima aos retalos chamada cemitério.

É importante manter as células indesejadas longe das células em análise de longevidade para evitar a formação de microcolônias e o esgotamento de nutrientes locais. Após a separação das células, retire o para do meio e incube a 30 graus Celsius por aproximadamente duas horas. Repita essas etapas para cada placa no experimento.

Para medir a capacidade replicativa de células individuais, você precisará preparar fichas de dados de longevidade. Uma ficha de dados de longevidade pode ser uma grade simples em que cada linha corresponde a uma célula mãe individual e cada coluna corresponde a um ponto de idade. Certifique-se de rotular cada ficha de dados de acordo com o número de cepas a serem analisadas.

Para começar, primeiramente, retire as placas do incubador e verifique se a maioria das células do arranjo sofreu pelo menos uma divisão celular. Se for necessário mais tempo para que a divisão celular seja concluída, devolva a placa ao incubador. Comece com a primeira célula do arranjo na primeira placa e observe visualmente a célula mãe e a(s) filha(s) para determinar o número de divisões celulares que ocorreram.

É geralmente fácil determinar quantas células-filhas uma célula-mãe produziu com base em padrões característicos de arranjos celulares. Este caso é realmente simples para verificar quantas células foram produzidas, pois há duas células presentes, ambas do mesmo tamanho e menores que a célula-mãe. Registre o número de células-filhas produzidas pela célula-mãe no campo apropriado da folha de pontuação de longevidade.

Em seguida, use a agulha para destacar as células filhas da célula mãe conforme descrito anteriormente, colocando suavemente a agulha sobre as células aderidas e batendo levemente no lado da base do microscópio enquanto a agulha está apoiada sobre as células. Mantenha a célula mãe em sua posição na linha vertical e mova temporariamente a célula ou células filhas para o lado. Repita esses passos para cada uma das células do arranjo.

Por fim, colete todas as células filhas descartadas e transfira-as para o cemitério localizado próximo aos filelos originais. Sobreponha uma película plástica à placa e incube a 30 graus Celsius por duas a três horas. Repita o descarte das células filhas e a incubação.

Etapa para cada placa no experimento. Repita todo este procedimento até que todas as células-mãe tenham parado de se dividir. Tenha em mente que, à medida que as células-mãe envelhecem, a progressão do ciclo celular se torna mais lenta e será desejável incubá-las por períodos mais longos entre os pontos de idade; posteriormente, as placas podem ser mantidas a quatro graus Celsius durante a noite.

Os dados brutos produzidos por um experimento de longevidade replicativa consistem em uma lista de números correspondentes às células-filhas produzidas por cada célula-mãe em cada ponto de idade. Como visto aqui. Ao somar cada linha da planilha de pontuação, obtém-se a longevidade replicativa de cada célula-mãe.

Os dados de outras células do mesmo grupo experimental podem ser agrupados para gerar uma curva de sobrevivência e realizar cálculos estatísticos. A curva deve ser aproximadamente consistente com a cinética de Gompertz-Makeham, apresentando um formato sigmoide com baixa mortalidade inicial, seguida por uma diminuição relativamente rápida na sobrevivência e um achatamento da curva em idades mais avançadas. Acabamos de mostrar como realizar um experimento de longevidade replicativa em levedura.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que as células continuarão a se dividir sempre que não estiverem sob refrigeração. Portanto, lembre-se de colocar as placas a quatro graus durante a noite para que você não acabe com um número excessivo de células-filhas para contar pela manhã. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.