Name: Medição Span vida replicativa na levedura de brotamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Aprenda a medir o tempo de vida replicativo em células-mãe de levedura Saccharomyces cerevisiae. Este protocolo permite estudar genes que influenciam o envelhecimento celular em organismos eucariotos.

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Este trabalho foi financiado por uma doação para MK e BKK da Medical Foundation Ellison. MK é um Ellison Medical Foundation Scholar novo no Envelhecimento. Gostaríamos de agradecer Soumya Kotireddy para a assistência durante as filmagens.

Parte 1: Prepare cepas e placas para replicativa análise expectativa de vida Esta seção descreve a preparação das placas sólido YEPD para uso no experimento período replicativo vida e da preparação de células de levedura para a análise de ciclo de vida. <ol><li> Utilizando uma técnica estéril apropriado, preparar placas de ágar YEPD (extrato de levedura 1%, 2% Bacto-peptona, agar 2%, 2% de glicose) que será utilizada para células de levedura de cultura e para a análise replicativa vida. Você deve preparar, pelo menos, duas placas para cada 4-5 cepas a serem analisadas no experimento vida. As placas devem ser preparadas pelo menos 2 dias antes do experimento tempo de vida e deixa-se secar antes de iniciar o ensaio de vida. Se a experiência não será iniciado dentro de 4-5 dias de despejar as placas, eles devem ser colocados em uma incubadora refrigerada e envolto em parafilme ou plástico para evitar dessecação. </li><li> Remover cepas de leveduras das existências de congelados e raia para colônias única em ágar YEPD. Até 6 cepas podem ser facilmente riscado no mesmo prato YEPD dividindo a placa em tamanho igual torta em forma de cunhas. </li><li> Incubar as células a 30 ° C por 2 dias. </li><li> Remover as células da incubadora e células correção de uma única colônia em um prato doce YEPD. Duas manchas de duas diferentes colônias deve ser gerado para cada cepa. Neste momento, as cepas a serem analisadas devem ser codificadas para garantir a replicação experimento vida é feita &quot;às cegas&quot;, onde o dissectors não sabe a identidade das cepas individuais. </li><li> Incubar o patch, as células codificadas a 30 ° C até a noite seguinte. </li><li> Remover as células e células de ânimo leve correção de cada linhagem codificada para novas placas YEPD, que servirá como as placas experimental utilizado para a análise período replicativo vida. As células devem ser corrigidos ao longo de uma linha vertical no lado esquerdo da placa de YEPD (Figura 1). Cerca de 3-5 amostras por placa é ótima, assumindo replicativa análise expectativa de vida em 20 células de cada patch. Não é necessário (nem desejável) para transferir um grande número de células para a placa de YEPD fresco, pois isso fará com que as células a crescer grossa durante a incubação overnight, o que pode limitar a sua vida útil subseqüente replicação. </li><li> Incubar as placas recém-corrigida durante a noite no topo do banco. </li></ol> Parte 2: células de posição para análise replicativa vida. Nesta seção descrevemos como posicionar as células de levedura na placa e como obter células-filhas virgens para análise replicativa vida. Deste ponto em diante, todas as placas devem ser parafilmed, exceto quando submetidos a dissecação, a fim de prevenir dessecação. <ol><li> Usando um microscópio equipado com um aparelho de microdissecção adequado para levedura, a transferência de cerca de 50 células da cepa primeiro patch para uma posição na placa distal para as células corrigidas. Se o seu estágio do microscópio é graduado, essas gradações podem ser usados ​​para garantir as células serão fáceis de encontrar, durante as iterações subseqüentes. No Axioscope Zeiss 40, as células da cepa primeiro patch pode ser colocada nas coordenadas 90 x 10 e vestiu verticalmente a partir daí. </li><li> Limpe a agulha de células repetidamente tocando a superfície do ágar, em seguida, criar um buraco no agar, forçando a agulha através da superfície do ágar. Esse buraco vai servir como um marcador para orientá-lo sobre o prato durante as iterações subseqüentes de dissecção e remoção das células filha. Tenha cuidado para não obter células de levedura no buraco, ou eles vão crescer e formar uma colônia. </li><li> Diretamente acima do buraco, alinhar verticalmente células de levedura individuais em 20 posições uniformemente espaçadas, com diâmetros de agulhas 1-3 (~ 100 M) entre cada posição da célula (Figura 1). Cada poucas células, coloque duas células adjacentes uns aos outros na mesma posição na linha, em vez de um. Isto permite a redundância durante a virgem filha de seleção de célula, se uma das células transferidas não se divide. </li><li> Entre os dias 10 e 11 º posições na linha, criar uma série horizontal de 7-8 furos no agar. Isto irá servir como um marcador para orientá-lo sobre a placa durante as iterações subseqüentes de dissecção e remoção das células filha. Tenha cuidado para não obter células de levedura nos buracos, ou eles vão crescer e formar uma colônia. </li><li> Repita os passos de 2,1-2,4 para cada patch no prato, continuando a série de células verticalmente ao longo do mesmo eixo. Para o passo 2.2, o número de buracos criados deve corresponder ao número de patch (um furo para o primeiro patch, dois furos para o segundo, etc.) </li><li> Uma vez que as células já foram preparados para cada patch, parafilme a placa e incubar a 30 ° C por aproximadamente 2 horas. </li><li> Repita os passos de 2,1-2,6 para cada placa no experimento. </li></ol> Obter células virgem filha para a análise de ciclo de vida: parte 3 Nesta seção, vamos iniciar a análise de ciclo de vida, assegurando que cada célula começa como uma virgem filhacélula. <ol><li> Remova as placas da incubadora e verificar que a maioria das células dispostas foram submetidos a uma divisão celular. Se o tempo adicional é necessário para permitir a divisão celular para ser concluída, voltar a placa para a incubadora. </li><li> Começando com a primeira célula vestida, use a agulha para retirar células-filhas a partir da célula-mãe colocando delicadamente a agulha em cima das células em anexo. Às vezes é útil para explorar o lado da base do microscópio, enquanto a agulha está descansando sobre as células. </li><li> Coloque a célula-filha destacada na linha vertical, substituindo a célula-mãe e todas as células filhas adicionais e movê-los temporariamente de lado. </li><li> Repita o passo 3.2 e 3.3 para cada uma das células dispostas. Se uma célula não se divide, dê uma célula-filha de uma das células redundantes posicionado no passo 2.3. Quando terminar, você deve ter 20 células-filhas para cada patch alinhados verticalmente sobre a placa de vida. </li><li> Colete todas as células mãe e filha células extra em uma pilha e transferi-los de volta para uma área perto da patches (&quot;cemitério&quot;). É importante manter as células indesejadas longe de células em fase de análise expectativa de vida para prevenir a formação de microcolônias e esgotamento de nutrientes local. </li><li> Parafilm a placa e incubar a 30 ° C por aproximadamente 2 horas. </li><li> Repita os passos de 3,2-3,6 para cada placa no experimento. </li></ol> Parte 4: Medição da capacidade de replicação das células individuais <ol><li> Preparar os dados de vida folhas span. A vida útil folha de dados pode ser uma grade simples, onde cada linha corresponde a uma célula-mãe individual e cada coluna corresponde a uma idade-ponto (Figura 2). Etiqueta de cada folha de dados de acordo com o número de cepas a serem analisadas. </li><li> Remova as placas da incubadora e verificar que a maioria das células dispostas passaram por pelo menos uma divisão celular. Se o tempo adicional é necessário para permitir a divisão celular para ser concluída, voltar a placa para a incubadora. </li><li> Começando com a primeira célula formou na primeira placa, observar visualmente a célula mãe e filha (s) e determinar o número de divisões celulares que tenham ocorrido. Em geral, é fácil determinar quantas células-filhas de uma mãe produziu, com base em padrões característicos de arranjos celulares. Registrar o número de células filhas produzidas pela célula-mãe na caixa apropriada na súmula tempo de vida. </li><li> Use a agulha para retirar células-filhas a partir da célula-mãe, como descrito no passo 3.2. </li><li> Manter a célula-mãe na sua posição na vertical e mova a célula-filha (s) para temporariamente de lado. </li><li> Repita os passos de 4,3-4,5 para cada uma das células dispostas. </li><li> Coletar todas as células filhas descartados e movê-los para o &#39;cemitério&#39;, localizado próximo as manchas original. </li><li> Parafilm a placa e incubar a 30 ° C por 2-3 horas. </li><li> Repita os passos de 4,3-4,8 para cada placa no experimento. </li><li> Repita os passos até que todas as células 4,2-4,9 mãe pararam de se dividir. Como a idade células mãe, a progressão do ciclo celular se torna mais lenta e será desejável para incubar a placa por longos períodos de tempo entre a idade-points. As placas podem ser colocadas a 4 ° C durante a noite. </li></ol> Parte 5: Resultados Representante. Os dados brutos produzidos por um período de experiência de vida é um replicativa números lista correspondente às células produzidas por cada célula-mãe em cada idade-ponto (Figura 2). Somando-se cada linha da folha de pontuação, o tempo de vida replicativa para cada célula-mãe é obtido. Dados para células-mãe do mesmo grupo experimental podem ser agrupados para gerar uma curva de sobrevida (Figura 3A) e para realizar cálculos estatísticos, tais como expectativa de vida média, tempo de vida mediana e desvio padrão. Um teste não-paramétrico, como o teste de Wilcoxon Rank-Sum, pode ser realizada para determinar se diferenças significativas no tempo de vida foram detectados entre os grupos experimentais. Quando o experimento funciona corretamente, a curva de sobrevivência deve ser consistente com cerca de Gompertz-Makeham mostrando uma cinética sigmoidal shap com baixa mortalidade precoce seguido um declínio relativamente rápido na sobrevivência e um achatamento da curva de uma idade mais avançada. A maioria das linhagens selvagens têm valores replicativa tempo de vida na faixa de geração de 20-30, embora fora variação desta faixa tem sido relatada. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig1.jpg" alt="figura 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1209/fig1.2.jpg" alt="Figura 1.5" /> Figura 1. Diagrama de um típico prato período replicativo vida. À noite, antes de começar microdissecção de células de levedura, 3-5 cepas são levemente corrigido para a superfície de uma placa de YEPD (caixas vermelhas) em uma linha vertical ao longo de um lado da placa. Depois de um crescimento durante a noite, aproximadamente 30 células individuais de cada linhagem estão dispostas verticalmente em uma linha contendo 20 posições. Tempo de vida Analysis será realizada em células v virgem filha obtidos a partir dessas células iniciais. Células extra obtido a partir de microdissecção durante o experimento (por exemplo, células-filhas indesejadas) são colocados em &quot;cemitério do&quot; (oval cinza), que está localizado longe das células experimentais, a fim de evitar o esgotamento local de nutrientes como colônias são formadas. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig3.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. A vida replicativa folha de registro span. Dados brutos de um experimento de tempo de vida replicativa é mostrado. Cada linha corresponde a uma única célula de levedura mãe e cada coluna corresponde a uma idade ponto. O número inserido em cada caixa é o número de células filhas produzidas por essa célula-mãe nessa idade ponto. Cada cepa é rotulado com um número codificado de tal forma que o indivíduo dissecar as células de levedura não tem conhecimento da identidade das cepas sendo analisado. Vinte células são analisadas para cada estirpe. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig2.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3. Sobrevivência representante e curvas de crescimento a partir de um experimento de tempo de vida replicativa. (A) As curvas de sobrevida são obtidos através da plotagem da fração de células mãe ainda está viva em função da idade replicativa (número de divisões celulares. (B) As curvas de crescimento são obtidos traçando a número médio de células-filhas produzidas por uma cepa dada em função da idade ponto. Neste exemplo, a tensão # 2 é de vida mais longa, mas é um crescimento mais lento, como evidenciado pela inclinação reduzida inicial da trama de crescimento.

<ol><li>Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+yeast+aging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Recent developments in yeast aging.</a> PLoS Genet. 3, (2007).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaeberlein%2C+M+%22Handbook+of+models+for+human+aging%22">Handbook of models for human aging</a>. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109-120 (2006).</li>
<li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evidence+for+conserved+longevity+pathways+between+divergent+eukaryotic+species%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative evidence for conserved longevity pathways between divergent eukaryotic species.</a> Genome Res. 18, 564-570 (2008).</li>
<li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+in+yeast%3A+the+means+to+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29-54 (2008).</li>
<li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 113-121 (2008).</li>
<li>Jiang, J. C., Jaruga, E., Repnevskaya, M. V., Jazwinski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intervention+resembling+caloric+restriction+prolongs+life+span+and+retards+aging+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">An intervention resembling caloric restriction prolongs life span and retards aging in yeast.</a> Faseb J. 14, 2135-2137 (2000).</li>
<li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sir2-independent+life+span+extension+by+calorie+restriction+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Sir2-independent life span extension by calorie restriction in yeast.</a> PLoS Biol. 2, E296-E296 (2004).</li>
<li>Lin, S. J., Defossez, P. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+NAD+and+SIR2+for+life-span+extension+by+calorie+restriction+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 289, 2126-2128 (2000).</li>
<li>Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+in+yeast+of+conserved+ageing+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes.</a> Mech Ageing Dev. 126, 17-21 (2005).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+yeast+replicative+life+span+by+TOR+and+Sch9+in+response+to+nutrients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients.</a> Science. 310, 1193-1196 (2005).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ágar</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0 (214530)</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptona</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0 (211677)</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0 (288620)</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

medição span vida replicativa na levedura de brotamento

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

O envelhecimento é um processo degenerativo caracterizado por uma deterioração progressiva de componentes celulares e organelas, resultando em mortalidade. A levedura de brotamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Tem sido amplamente utilizado para estudar a biologia do envelhecimento, e diversos determinantes da longevidade de leveduras foram mostrados para ser conservada em eucariotos multicelulares, incluindo vermes, moscas e ratos<sup&gt; 1</sup&gt;. Devido à falta de facilmente quantificado associado à idade fenótipos, o envelhecimento em leveduras foi ensaiada quase exclusivamente através da medição do tempo de vida das células em diferentes contextos, com dois paradigmas de vida diferentes extensão de uso comum<sup&gt; 2</sup&gt;. Esperança de vida cronológica refere-se ao período de tempo que uma célula mãe pode sobreviver em uma não-divisão, o estado de quiescência-like, e se propõe a servir de modelo para o envelhecimento de células pós-mitóticas em eucariontes multicelulares. Tempo de vida replicativa, em contrapartida, refere-se o número de células filhas produzidas por uma célula-mãe antes de senescência, e é pensado para proporcionar um modelo de envelhecimento nas células mitoticamente ativo. Aqui apresentamos um protocolo generalizada para medir o tempo de vida replicativa das células-mãe de brotamento de leveduras. O objetivo do ensaio período replicativo vida é determinar quantas vezes cada buds célula-mãe. As células mãe e filha podem ser facilmente diferenciadas por um pesquisador experiente, usando um microscópio de luz standard (ampliação total 160X), como o Axioscope Zeiss 40 ou outro modelo comparável. Separação física das células-filhas a partir de células mãe é conseguido usando um micromanipulador manuais equipada com uma agulha de fibra óptica. Cepas de leveduras típicas de laboratório 20-30 produzir células-filhas por mãe e um experimento de tempo de vida exige de 2-3 semanas.

Neste artigo apresentamos um protocolo geral para medir o tempo de vida replicativa das células-mãe do fermento.

Medição Span vida replicativa na levedura de brotamento

O envelhecimento é um processo degenerativo caracterizado por uma deterioração progressiva de componentes celulares e organelas, resultando em mortalidade. O brotamento...

A levedura brotante Croce Visi tem sido amplamente utilizada para estudar a biologia do envelhecimento. Neste artigo, apresentamos um protocolo geral para medir a longevidade replicativa de células-mãe de levedura. Olá, sou Kristen Steffen do laboratório de Brian Kennedy, do Departamento de Bioquímica da Universidade de Washington.Hoje vamos mostrar um procedimento para medir a longevidade replicativa de células-mãe de levedura. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar genes que influenciam a longevidade de células de levedura. Então, vamos começar.Para o experimento de longevidade replicativa e para o preparo de células de levedura para análise de longevidade, é necessário preparar placas sólidas de YEPD. Utilize técnica estéril apropriada para preparar essas placas de ágar YEPD. Prepare pelo menos duas placas para cada grupo de quatro a cinco cepas a serem analisadas no experimento de longevidade.Essas placas devem ser preparadas pelo menos dois dias antes do experimento de longevidade e devem ser deixadas secar antes de iniciar o ensaio de longevidade. Se o experimento não for realizado entre quatro e cinco dias após o preparo das placas, elas devem ser envolvidas em filme plástico aderente ou plástico e colocadas em uma incubadora refrigerada para evitar dessecação. Retire as linhagens de levedura de estoques congelados e faça estrias para obtenção de colônias isoladas.Nas placas de ágar YEPD. Até seis cepas podem ser facilmente estriadas na mesma placa YEPD dividindo a placa em setores iguais com formato de fatias de torta. Incubar as células a 30 graus Celsius por dois dias.Após a incubação, remova as células do incubador e replique células de uma única colônia em uma placa YEPD fresca. Neste momento, as linhagens a serem analisadas devem ser revestidas para garantir que o experimento de longevidade replicativa seja realizado de forma cega, onde os disseccionadores não conheçam a identidade das linhagens individuais.Em seguida, incubar as células revestidas e repicadas a 30 graus Celsius até a noite seguinte. Remover as células e repicar levemente células de cada linhagem revestida em placas YEPD frescas. Estas servirão como as placas experimentais utilizadas para a determinação da longevidade replicativa.As células para análise devem ser estriadas ao longo de uma linha vertical no lado esquerdo da placa YEPD. Não transfira muitas células para uma única placa YEPD fresca. Isso causará um crescimento denso das células durante a incubação noturna e afetará seu tempo de vida replicativo; portanto, de três a cinco estrias por placa é ideal.Assumindo que a análise do tempo de vida replicativo será realizada em 20 células de cada grupo, o experimento de longevidade agora está completamente montado e tudo o que resta é incubar durante a noite sobre a bancada. Então, amanhã, podemos iniciar a microdissecação para posicionar as células de levedura na placa e obter células filhas virgens. Para análise do tempo de vida replicativo.Utilize um microscópio equipado com um aparato de microdissecação apropriado para leveduras. Transfira aproximadamente 50 células da primeira linhagem em patch para uma posição na placa distante das células em patch. Se a platina do seu microscópio for graduada, essas marcações podem ser usadas para garantir que as células sejam fáceis de localizar durante iterações subsequentes.Às vezes, as células podem ficar presas na agulha, o que pode ser um problema se saírem no momento errado. Para garantir que a agulha esteja limpa e livre de células, toque-a repetidamente na superfície do ágar. Em seguida, crie um orifício no ágar forçando a agulha a atravessar a superfície do ágar.Este orifício servirá como marcador para orientá-lo na placa durante as iterações subsequentes da dissecação e remoção de células dotter. Tenha cuidado para não introduzir células de levedura no orifício, pois elas crescerão e formarão uma colônia diretamente acima do orifício. Alinhe verticalmente células individuais de levedura em 20 posições igualmente espaçadas, com um a três diâmetros de agulha entre cada posição celular.Para cada poucas células, posicione duas células lado a lado na mesma posição da linha, em vez de apenas uma. Isso permite redundância durante a seleção de células filhas virgens. Se uma das células transferidas não se dividir entre as posições 10 e 11 da linha, crie uma série horizontal de sete a oito orifícios no ágar.Isso servirá como marcador para orientá-lo na placa durante as dissecações subsequentes e remoções de células-filhas. Novamente, tenha cuidado para não introduzir células de levedura nos orifícios, pois elas crescerão e formarão uma colônia. Repita este procedimento para cada setor da placa, continuando a dispor as células verticalmente ao longo do mesmo eixo.É importante lembrar que, ao criar o orifício na ERA, o número de orifícios feitos deve corresponder ao número do fragmento, de modo que haja um orifício para o primeiro fragmento e dois orifícios para o segundo. Após as células terem sido dispostas para cada fragmento, vedar a placa com filme plástico e incubá-la a 30 graus Celsius por aproximadamente duas horas. Lembre-se de que, a partir deste ponto, todas as placas devem permanecer vedadas com filme plástico, exceto durante a dissecação.Para evitar a dessecação, repita este procedimento para cada placa no experimento. Para a análise de longevidade, é importante garantir que cada célula comece como uma célula filha virgem.Para fazer isso primeiro, remova as placas do incubador e verifique se a maioria das células do arranjo sofreu uma divisão celular. O que temos aqui são células que foram alinhadas previamente, e você pode observar que, após duas horas no incubador, elas começaram a se dividir. Agora temos uma célula mãe, a maior, ligada ao seu corpo, a célula filha virgem, e essa célula filha virgem é a célula que será usada para iniciar a vida útil.Se for necessário mais tempo para permitir que as divisões celulares sejam concluídas, devolva a placa ao incubador. Começando com a primeira célula da matriz, use a agulha para destacar as células filhas da célula mãe colocando suavemente a agulha sobre as células aderidas.Às vezes é útil tocar levemente o lado da base do microscópio enquanto a agulha está apoiada sobre as células. Em seguida, posicione a célula filha destacada na linha vertical de células, substituindo a célula mãe e quaisquer outras células filhas, movendo temporariamente estas para o lado. Repita esses passos para cada uma das células da matriz.Se uma célula não se dividir, retire uma célula filha de uma das células redundantes posicionadas ao lado da célula-teste. Ao final, você deverá ter 20 células filhas para cada retalo, alinhadas verticalmente na placa de vida útil. Colete todas as células-mãe e as células filhas extras em um monte e transfira-as de volta para uma área próxima aos retalos chamada cemitério.É importante manter as células indesejadas longe das células em análise de longevidade para evitar a formação de microcolônias e o esgotamento de nutrientes locais. Após a separação das células, retire o para do meio e incube a 30 graus Celsius por aproximadamente duas horas. Repita essas etapas para cada placa no experimento.Para medir a capacidade replicativa de células individuais, você precisará preparar fichas de dados de longevidade. Uma ficha de dados de longevidade pode ser uma grade simples em que cada linha corresponde a uma célula mãe individual e cada coluna corresponde a um ponto de idade. Certifique-se de rotular cada ficha de dados de acordo com o número de cepas a serem analisadas.Para começar, primeiramente, retire as placas do incubador e verifique se a maioria das células do arranjo sofreu pelo menos uma divisão celular. Se for necessário mais tempo para que a divisão celular seja concluída, devolva a placa ao incubador. Comece com a primeira célula do arranjo na primeira placa e observe visualmente a célula mãe e a(s) filha(s) para determinar o número de divisões celulares que ocorreram.É geralmente fácil determinar quantas células-filhas uma célula-mãe produziu com base em padrões característicos de arranjos celulares. Este caso é realmente simples para verificar quantas células foram produzidas, pois há duas células presentes, ambas do mesmo tamanho e menores que a célula-mãe. Registre o número de células-filhas produzidas pela célula-mãe no campo apropriado da folha de pontuação de longevidade.Em seguida, use a agulha para destacar as células filhas da célula mãe conforme descrito anteriormente, colocando suavemente a agulha sobre as células aderidas e batendo levemente no lado da base do microscópio enquanto a agulha está apoiada sobre as células. Mantenha a célula mãe em sua posição na linha vertical e mova temporariamente a célula ou células filhas para o lado. Repita esses passos para cada uma das células do arranjo.Por fim, colete todas as células filhas descartadas e transfira-as para o cemitério localizado próximo aos filelos originais. Sobreponha uma película plástica à placa e incube a 30 graus Celsius por duas a três horas. Repita o descarte das células filhas e a incubação.Etapa para cada placa no experimento. Repita todo este procedimento até que todas as células-mãe tenham parado de se dividir. Tenha em mente que, à medida que as células-mãe envelhecem, a progressão do ciclo celular se torna mais lenta e será desejável incubá-las por períodos mais longos entre os pontos de idade; posteriormente, as placas podem ser mantidas a quatro graus Celsius durante a noite.Os dados brutos produzidos por um experimento de longevidade replicativa consistem em uma lista de números correspondentes às células-filhas produzidas por cada célula-mãe em cada ponto de idade. Como visto aqui. Ao somar cada linha da planilha de pontuação, obtém-se a longevidade replicativa de cada célula-mãe.Os dados de outras células do mesmo grupo experimental podem ser agrupados para gerar uma curva de sobrevivência e realizar cálculos estatísticos. A curva deve ser aproximadamente consistente com a cinética de Gompertz-Makeham, apresentando um formato sigmoide com baixa mortalidade inicial, seguida por uma diminuição relativamente rápida na sobrevivência e um achatamento da curva em idades mais avançadas. Acabamos de mostrar como realizar um experimento de longevidade replicativa em levedura.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que as células continuarão a se dividir sempre que não estiverem sob refrigeração. Portanto, lembre-se de colocar as placas a quatro graus durante a noite para que você não acabe com um número excessivo de células-filhas para contar pela manhã. Assim sendo, é isso.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biologia

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Este vídeo descreve um método tradicional baseado em placas para medir a vida útil de C. elegans. O protocolo de exemplo mede a vida útil de vermes tratados com RNAi.

Análise de vida útil: medindo a longevidade de C. elegans

Nós descrevemos aqui a operação de um dispositivo de microfluidos, que permite contínua e de elevada resolução de imagem microscópica de células de levedura de brotamento individuais durante a sua replicativo completo e / ou o tempo de vida cronológica.

Contínua observação microscópica de alta resolução de replicativa envelhecimento em leveduras de brotamento

Este artigo apresenta um protocolo optimizado para a produção de batatas fritas de microfluidos e a configuração de experiências de microfluidos para medir o tempo de vida e fenótipos celulares de células de levedura individuais.

Usando dispositivos microfluídicos medir Longevidade e Celular fenótipos em células individuais levedura de brotamento

Aqui descrevemos o método conjunto de réplicas, uma abordagem quantitativamente medida de expectativa de vida/sobrevivência de c. elegans e healthspan de forma robusta e de alta produtividade, permitindo assim a seleção de muitas condições sem sacrificar a qualidade dos dados. Este protocolo detalha a estratégia e fornece uma ferramenta de software para análise de dados do conjunto de réplicas.

O método de conjunto de réplica: Uma abordagem de alto rendimento para quantitativamente medida Caenorhabditis elegans expectativa de vida

Aqui está um protocolo para identificar interações genéticas através de uma tela supressora de número de cópia aumentada em Saccharomyces cerevisiae. Este método permite que os pesquisadores identifiquem, clonem e testem supressores em mutantes de levedura de curta duração. Testamos o efeito do aumento do número de cópias de SIR2 na vida útil em um mutante nulo autofagia.

Uma tela supressora para a caracterização de links genéticos regulando a vida cronológica em Saccharomyces cerevisiae

Descrevemos dois protocolos complementares para determinar com precisão a duração da fase S em S. cerevisiae usando EdU, um análogo da timidina, que é incorporado in vivo e detectado usando a química Click por microscopia e citometria de fluxo. Ele permite a fácil caracterização da duração da replicação do DNA e defeitos de replicação negligenciados em mutantes.

Determinação da Duração da Fase S Usando a Incorporação de 5-Etil-2'-desoxiuridina em Saccharomyces cerevisiae

Aprenda a medir o tempo de vida replicativo em células-mãe de levedura Saccharomyces cerevisiae. Este protocolo permite estudar genes que influenciam o envelhecimento celular em organismos eucariotos.

Medição Span vida replicativa na levedura de brotamento

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