Análise de co-cultura da Relação de proteínas extracelulares que afetam secreção de insulina por células beta pancreáticas se

O objetivo geral deste procedimento é investigar como as interações transcelulares envolvendo os domínios extracelulares de proteínas transmembranares específicas afetam a função das células beta e, mais especificamente, a secreção de insulina. Isso é feito pela primeira transecção, uma linhagem celular de mamíferos com um plasmídeo contendo a proteína de interesse na segunda etapa. Uma linhagem de células beta é co-cultivada com as células de mamíferos.

Na etapa final, a co-cultura é incubada em meios com diferentes concentrações de glicose, a fim de permitir a avaliação da secreção de insulina estimulada por glicose. Em última análise, os radioimunoensaios de insulina ou Eliza são usados para avaliar os níveis de insulina secretados no meio pelas células beta cultivadas. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como superexpressão e knockdown de genes, é que ela evita a perturbação do mRNA e a expressão da proteína que potencialmente afetam a saúde das células beta e/ou funcionam de maneiras que podem confundir as análises da interação específica da proteína.

Comece transferindo as células HEC 2 93 para uma placa de 24 poços em 0,5 mililitros de HEC 2 93 por poço para garantir que as células estejam espalhadas uniformemente pelo fundo da placa. Agite a placa ao longo de um eixo de cada vez com velocidade síncrona à onda formada no poço. Quando as células HEC 2 93 atingirem 100% de fluência de co, transfectar as culturas com 0,8 microgramas do plasmídeo que codifica a proteína de interesse em dois microlitros de lipo 2000.

De acordo com o protocolo lipo, o esquema geral da co-cultura a ser demonstrada é descrito aqui usando um removedor de células não enzimáticas. Comece esta etapa colhendo células INS one em aproximadamente 70 a 80% de fluência do fundo de um frasco de cultura T 75. Depois de girar as células por três minutos a 150 Gs à temperatura ambiente, use uma pipeta P 1000 para ressuspender o pellet em um mililitro de metade INS um e meio.

Ele então usa uma pipeta de 10 mililitros para adicionar mais 24 mililitros de meio misto e resusa suspende as células aspirar o meio dos poços da placa de 24 poços contendo as células HEC 2 9 3. Em seguida, usando uma pipeta P 1000, adicione suavemente 500 microlitros da suspensão de uma célula INS na camada de células hexagonais ao longo das laterais do poço. A cada seis poços, use uma pipeta de 10 mililitros para ressuspender as células do INS.

Novamente para garantir a suspensão celular homogênea. Agora incube as células por 24 a 48 horas, dependendo do protocolo experimental. Depois que as células incubarem pelo período experimental desejado, um poço de cada vez, aspire o meio de co-cultura com uma mão e substitua imediatamente o meio por 250 microlitros de glicose 2,5 milimolar em tampão de bicarbonato de Krebs ringer com a outra.

Após a pré-incubação das coculturas por uma hora, troque o tampão KRB de baixa glicose por 250 microlitros de glicose 2,5 milimolar ou 20 milimolares de glicose. Após mais uma hora de incubação, transfira o tampão KRB para tubos de microfuga e gire o tampão por cinco minutos a 1500 Gs e quatro graus Celsius enquanto os tubos estão na centrífuga. Adicione imediatamente 100 microlitros de tampão de lise de células rippa com inibidores de protease à placa e incube a placa por 20 minutos a quatro graus Celsius.

Quando os tubos terminarem de girar, remova 200 microlitros do sobrenadante para posterior análise por radioimunoensaio de insulina ou Eliza. Finalmente, gire para baixo o que agora é lisado celular por 15 minutos a 10.000 gs e, em seguida, remova 50 microlitros do SNAT para análise por radioimunoensaio de insulina ou Eliza. Aqui, são mostrados os resultados obtidos da co-cultura de células INS one beta com células HC 2 93 transfectadas para expressar uma isoforma de neuro liggen aqui referida como NLX.

A expressão de NLX aumentou a secreção basal e estimulou a secreção de insulina por células I NS um cocultivadas. O domínio extracelular NX deve estar interagindo com outra proteína ou molécula na superfície celular I NS um para fazer com que as células INS um secretem mais insulina. Os resultados de outros tipos de análises usando o sistema de co-cultura são representados nos próximos dois gráficos.

Neste primeiro gráfico, é mostrado o aumento do conteúdo de insulina das células INS one cocultivadas por NLY. Já neste experimento, o RNA foi colhido da camada celular e analisado por R-T-Q-P-C-R. A co-cultura com NLY aumentou os níveis de insulina e PDX um mRNA.

Após este procedimento, métodos adicionais, como QPCR ou imuno-histoquímica quantitativa, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se as interações extracelulares da proteína transfectada podem causar alterações na estrutura celular ou na expressão gênica.