Análise de co-cultura da Relação de proteínas extracelulares que afetam secreção de insulina por células beta pancreáticas se
15 de junho de 2013
Interações de proteínas intracelulares são determinantes importantes da função das células beta no pâncreas. Detalhado aqui é um método adaptado a partir de um modelo de co-cultura de synaptogenesis-para investigar como as proteínas transmembrana específicos influenciar a secreção de insulina. As células HEK293 transfectadas expressam as proteínas de interesse, células beta não precisa ser transfectadas directamente ou de outro modo perturbado.
O objetivo geral deste procedimento é investigar como as interações transcelulares envolvendo os domínios extracelulares de proteínas transmembranares específicas afetam a função das células beta e, mais especificamente, a secreção de insulina. Isso é feito pela primeira transecção, uma linhagem celular de mamíferos com um plasmídeo contendo a proteína de interesse na segunda etapa. Uma linhagem de células beta é co-cultivada com as células de mamíferos.
Na etapa final, a co-cultura é incubada em meios com diferentes concentrações de glicose, a fim de permitir a avaliação da secreção de insulina estimulada por glicose. Em última análise, os radioimunoensaios de insulina ou Eliza são usados para avaliar os níveis de insulina secretados no meio pelas células beta cultivadas. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como superexpressão e knockdown de genes, é que ela evita a perturbação do mRNA e a expressão da proteína que potencialmente afetam a saúde das células beta e/ou funcionam de maneiras que podem confundir as análises da interação específica da proteína.
Comece transferindo as células HEC 2 93 para uma placa de 24 poços em 0,5 mililitros de HEC 2 93 por poço para garantir que as células estejam espalhadas uniformemente pelo fundo da placa. Agite a placa ao longo de um eixo de cada vez com velocidade síncrona à onda formada no poço. Quando as células HEC 2 93 atingirem 100% de fluência de co, transfectar as culturas com 0,8 microgramas do plasmídeo que codifica a proteína de interesse em dois microlitros de lipo 2000.
De acordo com o protocolo lipo, o esquema geral da co-cultura a ser demonstrada é descrito aqui usando um removedor de células não enzimáticas. Comece esta etapa colhendo células INS one em aproximadamente 70 a 80% de fluência do fundo de um frasco de cultura T 75. Depois de girar as células por três minutos a 150 Gs à temperatura ambiente, use uma pipeta P 1000 para ressuspender o pellet em um mililitro de metade INS um e meio.
Ele então usa uma pipeta de 10 mililitros para adicionar mais 24 mililitros de meio misto e resusa suspende as células aspirar o meio dos poços da placa de 24 poços contendo as células HEC 2 9 3. Em seguida, usando uma pipeta P 1000, adicione suavemente 500 microlitros da suspensão de uma célula INS na camada de células hexagonais ao longo das laterais do poço. A cada seis poços, use uma pipeta de 10 mililitros para ressuspender as células do INS.
Novamente para garantir a suspensão celular homogênea. Agora incube as células por 24 a 48 horas, dependendo do protocolo experimental. Depois que as células incubarem pelo período experimental desejado, um poço de cada vez, aspire o meio de co-cultura com uma mão e substitua imediatamente o meio por 250 microlitros de glicose 2,5 milimolar em tampão de bicarbonato de Krebs ringer com a outra.
Após a pré-incubação das coculturas por uma hora, troque o tampão KRB de baixa glicose por 250 microlitros de glicose 2,5 milimolar ou 20 milimolares de glicose. Após mais uma hora de incubação, transfira o tampão KRB para tubos de microfuga e gire o tampão por cinco minutos a 1500 Gs e quatro graus Celsius enquanto os tubos estão na centrífuga. Adicione imediatamente 100 microlitros de tampão de lise de células rippa com inibidores de protease à placa e incube a placa por 20 minutos a quatro graus Celsius.
Quando os tubos terminarem de girar, remova 200 microlitros do sobrenadante para posterior análise por radioimunoensaio de insulina ou Eliza. Finalmente, gire para baixo o que agora é lisado celular por 15 minutos a 10.000 gs e, em seguida, remova 50 microlitros do SNAT para análise por radioimunoensaio de insulina ou Eliza. Aqui, são mostrados os resultados obtidos da co-cultura de células INS one beta com células HC 2 93 transfectadas para expressar uma isoforma de neuro liggen aqui referida como NLX.
A expressão de NLX aumentou a secreção basal e estimulou a secreção de insulina por células I NS um cocultivadas. O domínio extracelular NX deve estar interagindo com outra proteína ou molécula na superfície celular I NS um para fazer com que as células INS um secretem mais insulina. Os resultados de outros tipos de análises usando o sistema de co-cultura são representados nos próximos dois gráficos.
Neste primeiro gráfico, é mostrado o aumento do conteúdo de insulina das células INS one cocultivadas por NLY. Já neste experimento, o RNA foi colhido da camada celular e analisado por R-T-Q-P-C-R. A co-cultura com NLY aumentou os níveis de insulina e PDX um mRNA.
Após este procedimento, métodos adicionais, como QPCR ou imuno-histoquímica quantitativa, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se as interações extracelulares da proteína transfectada podem causar alterações na estrutura celular ou na expressão gênica.
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Visão Geral
Este estudo investiga o papel das interações proteicas transcelulares na função das células beta pancreáticas, com foco particular na secreção de insulina. O método envolve o cultivo conjunto de células HEK293 transfectadas com células beta para avaliar a influência de proteínas transmembranares específicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Endocrinologia
Contexto
- As interações transcelulares são cruciais para a funcionalidade das células beta.
- A secreção de insulina é um processo chave influenciado por essas interações.
- Os métodos existentes podem perturbar a saúde das células beta, complicando as análises.
- Este estudo tem como objetivo fornecer uma abordagem mais refinada.
Objetivo do Estudo
- Investigar como proteínas transmembranares específicas afetam a secreção de insulina.
- Utilizar um modelo de co-cultura para minimizar a perturbação direta de células beta.
- Avaliar o impacto das concentrações de glicose na liberação de insulina.
Métodos Utilizados
- Transfectar células HEK293 com plasmídeos contendo proteínas de interesse.
- Cocultivar células HEK293 transfectadas com células beta.
- Incubar culturas em cocultura em meio com concentrações variáveis de glicose.
- Utilizar radioimunoensaios ou ELISAs de insulina para medir a secreção de insulina.
Resultados Principais
- Demonstrou a influência de proteínas transmembranares específicas na secreção de insulina.
- Mostrou que a concentração de glicose afeta a liberação de insulina em células co-cultivadas.
- Validou a eficácia do método em comparação com técnicas tradicionais de perturbação.
- Forneceram insights sobre os mecanismos da função das células beta.
Conclusões
- O método de co-cultivo permite o estudo de interações proteicas sem comprometer a saúde das células beta.
- Os conhecimentos obtidos podem orientar pesquisas futuras sobre diabetes e função das células beta.
- Essa abordagem pode levar a uma melhor compreensão dos mecanismos de secreção de insulina.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Compreender as interações proteicas transcelulares é essencial para reduzir os riscos na validação de alvos em células-beta na descoberta de medicamentos para o diabetes. Este método de co-cultivo permite a investigação mecanicista dos efeitos de proteínas extracelulares sobre a secreção de insulina sem comprometer a saúde das células-beta, reforçando a confiança preditiva na seleção de alvos. Ele aborda um desafio fundamental na fase de descoberta: distinguir a sinalização transcelular verdadeira de fatores de confusão intracelulares na análise de vias celulares.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a avaliação funcional de interações de proteínas transmembrana na secreção de insulina, preservando a integridade das células beta.
- Valor Operacional: Evita artefatos decorrentes da diminuição ou superexpressão de mRNA/proteína que dificultam estudos de validação de alvos.
- Valor Estratégico: Apoia a triagem orientada por hipóteses de interatores extracelulares para reduzir riscos nas vias de sinalização das células beta.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas da secreção de insulina sob estimulação controlada de glicose para padronização de ensaios.
- Valor Operacional: Utiliza células HEK293 como uma plataforma ajustável de apresentação de proteínas extracelulares para ensaios de cocultivo reprodutíveis.
- Valor Estratégico: Permite a avaliação escalonável de proteínas candidatas que influenciam a função das células beta em um formato fisiologicamente relevante.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona interações proteicas extracelulares com a maturação funcional de células beta e a liberação de insulina responsiva à glicose.
- Valor Operacional: Compatível com células beta dissociadas primárias e linhagens de células beta para validação cruzada entre modelos.
- Valor Estratégico: Oferece um sistema relevante para doenças, capaz de priorizar alvos com potencial de alinhamento a biomarcadores translacionais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta que vai do engajamento do alvo à validação funcional, apoiando especificamente a identificação de compostos ativos por meio da desvinculação mecanicista de vias celulares beta.
- Biologia da Descoberta: Testa como domínios extracelulares específicos de proteínas transmembranares modulam a secreção de insulina por células beta em um sistema de co-cultivo controlado.
- Triagem: Permite avaliação padronizada e reprodutível da secreção de insulina sob diferentes condições de glicose, utilizando radioimunoensaio ou ELISA.
- Análises: Fornece medidas quantitativas de variáveis dependentes (níveis de insulina) que permitem comparar os efeitos das interações proteicas em condições experimentais definidas.
- Pesquisa Translacional: Conecta fenótipos de interação extracelular a alterações no conteúdo de insulina e na expressão gênica (por exemplo, mRNA de insulina, PDX1) para continuidade pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de co-cultivo reutilizável para investigar múltiplas proteínas transmembranares sem reformular os procedimentos centrais de manipulação de células beta.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na sinalização de células beta ao isolar efeitos transcelulares de perturbações intracelulares.
- Valor Operacional: Padroniza o fluxo de trabalho de cultivo em co-cultura com etapas definidas de transfeção, incubação e ensaio de secreção, garantindo consistência entre diferentes equipes.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção na validação de alvos ao fornecer dados funcionais de secreção de insulina não confundidos por artefatos relacionados à saúde das células beta.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em efeitos validados sobre a secreção de insulina estimulada por glicose.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em transfeção de células de mamíferos, técnicas de co-cultivo e ensaios de secreção de insulina estimulada por glicose.
- Depende de controles de eficiência de transfeção e da formação adequada da camada de células HEK293 para apresentação consistente de proteínas.
- Necessita padronização dos protocolos de desafio com glicose e dos métodos de quantificação de insulina (radioimunoensaio ou ELISA) entre experimentos.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o método a células beta primárias ou linhagens alternativas de células beta além da INS-1.
- Limita-se à análise de interações proteicas extracelulares; não é capaz de investigar diretamente domínios de sinalização intracelular sem métodos complementares.
