Visualizar os Efeitos de uma experiência precoce positiva, Tátil Estimulação, em dendríticas Morfologia e Synaptic conectividade com Golgi-Cox Coloração

O objetivo geral deste procedimento é usar técnicas de coloração de ouro G Cox para visualizar as mudanças morfológicas nos neurônios que seguem a estimulação tátil no início da vida. Isso é feito administrando primeiro a estimulação tátil três vezes ao dia, desde o terceiro dia pós-natal até o 21º dia pós-natal. O segundo passo é perfundir os animais quando atingirem a idade da investigação e armazenar seus cérebros na solução Goldy cos.

Em seguida, os cérebros são cortados com Aome. A etapa final é impregnar os cérebros com a técnica de coloração GOGI co. Em última análise, o procedimento GOGI co é usado para visualizar neurônios individuais, o que permite a análise de mudanças morfológicas.

A beleza da técnica de Goy Cox é que ela nos permite quantificar a estrutura dos neurônios e correlacioná-la com os resultados comportamentais. As implicações dessa técnica se estendem aos distúrbios do desenvolvimento, pois a estimulação tátil demonstrou ser eficaz na recuperação comportamental e anatômica desses distúrbios. Embora esse método possa fornecer informações sobre a neuroanatomia de ratos, ele também pode ser aplicado a outros organismos modelo e tecido cerebral humano.

Para nos ajudar a aprofundar nossa compreensão da plasticidade dependente experimentada, os animais são mantidos em um ciclo claro e escuro de 12 horas com livre acesso a comida e água após o nascimento. Cada rato fêmea é alojado individualmente com seus filhotes. Para evitar estresse adicional relacionado ao manuseio, os filhotes recebem estimulação tátil a partir de P três.

Depois de pesar os filhotes antes da sessão matinal de estimulação tátil, transporte os filhotes em suas gaiolas domésticas para uma sala de testes separada. Coloque a gaiola doméstica em uma almofada de aquecimento ajustada para 24 graus Celsius. Quando estiver pronto para a estimulação tátil, remova as barragens de sua gaiola doméstica e coloque-as em uma gaiola temporária com comida e água.

Mantenha a barragem e a gaiola temporária na sala de reprodução. Em seguida, use uma tábua rígida para dividir a gaiola doméstica em duas metades. Em seguida, designe aleatoriamente metade dos filhotes de cada ninhada para serem submetidos a estimulação tátil com a outra metade servindo como controle.

Marque as patas traseiras e a cauda com marcador permanente para diferenciar os grupos e coloque os filhotes no grupo de estimulação tátil em um lado da gaiola e os filhotes de controle no outro. Defina um cronômetro para 15 minutos usando um espanador macio como uma pena. Escove todos os filhotes do grupo de estimulação tátil ao mesmo tempo por 15 minutos consecutivos.

Os filhotes de ratos jovens geralmente se amontoam e parecem entrar em um ciclo de sono profundo, tornando muito fácil estimular todos os filhotes de uma só vez. À medida que os filhotes envelhecem, eles se tornam mais ativos com alguns filhotes andando e investigando. Durante a sessão, mova todos os filhotes errantes para o grupo para garantir que cada filhote receba estimulação igual.

Após 15 minutos de estimulação tátil, retorne a mãe à gaiola e transporte a gaiola de volta para a sala de reprodução. Este processo é repetido três vezes ao dia. Por 19 dias Após a sessão final de estimulação tátil, desmame os filhotes de suas mães Os filhotes são alojados em gaiolas com cinco ou seis outros animais desmamados do mesmo sexo, deixando os ratos intactos em condições de alojamento padrão até atingirem a idade de investigação.

As amostras são coletadas quando os animais atingem 100 dias de idade. Após a eutanásia e a perfusão intracardíaca, o cérebro é extraído. Tomando cuidado para manter o cerebelo intacto.

Coloque os cérebros em um frasco opaco de Nalgene cheio de 20 mililitros de solução Goldy Cox, onde são mantidos por 14 dias. Após 14 dias, substitua a solução por uma solução de sacarose a 30%. Mantenha os cérebros em solução de sacarose por dois a cinco dias antes de seccionar para seccionamento.

Seque o cérebro antes de fixar em um estágio de corte com cola acrílica Sano para evitar rasgos ou cortes irregulares, certifique-se de que todo o cérebro esteja firmemente preso ao estágio. Em seguida, encha o reservatório Vibram com solução de sacarose a 6% até cobrir a lâmina de corte. Defina a velocidade e a amplitude do Vibram para cinco.

Corte o cérebro em seções de 200 mícrons e coloque as seções em uma lâmina de microscópio gelatinizada a 2%. Certifique-se de manter as seções molhadas durante o seccionamento quando todas as seções de interesse tiverem sido coletadas. Pressione as mechas nas corrediças aplicando pressão com papel umedecido.

Coloque as lâminas em um suporte de lâminas e guarde-as em uma câmara de umidade por pelo menos 12 horas, mas não mais do que quatro dias. Para iniciar o procedimento de coloração, rotule e prepare 12 placas de coloração de vidro. Primeiro, mergulhe as lâminas em água destilada por um minuto.

Em seguida, coloque as lâminas em hidróxido de amônio e mantenha-as no escuro por 30 minutos. Após mais um minuto em água destilada, coloque as lâminas no Kodak Fix por 30 minutos com proteção contra luz. Coloque as lâminas em água destilada mais uma vez antes de desidratar em uma série de soluções de álcool graduadas.

Após a última lavagem com álcool, coloque as lâminas em um terço da solução por 15 minutos. Por fim, coloque as lâminas no hemo D por 15 minutos. Quando estiver pronto, use o papel primordial para colocar as lamínulas nas lâminas e deixá-las secar ao ar antes de examiná-las com um microscópio

Aqui está uma fotografia representativa de um neurônio parametálico corado com Golgi Cox em um rato que recebeu estimulação tátil durante o desenvolvimento. Uma fotografia ampliada mostra espinhos dendríticos nos dendritos terminais. A imagem mais clara à esquerda é de um rato do grupo de controle e a imagem mais escura é de um rato que recebeu estimulação tátil.

Este gráfico representa a complexidade dendrítica apical e basler média para neurônios na área do GC três de ratos adultos que receberam estimulação tátil durante o desenvolvimento ou não. Seguindo esse procedimento, temos a vantagem de que, se quisermos fazer perguntas adicionais, coramos todo o cérebro e, portanto, podemos voltar e usar o mesmo tecido cerebral para responder a essas perguntas. Ao desenvolver essas técnicas, abrimos caminho para os pesquisadores explorarem a utilidade da estimulação tátil como terapia para o tratamento de traumatismo craniano ou outras formas de lesão neurológica após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para os pesquisadores de neurociência explorarem seu potencial na remediação de traumas cerebrais e distúrbios do desenvolvimento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fornecer aos filhotes de embrulho a experiência enriquecedora da estimulação tátil, bem como um meio de visualizar neurônios e sinapses individuais.