Name: Visualizar os Efeitos de uma experiência precoce positiva, Tátil Estimulação, em dendríticas Morfologia e Synaptic conectividade com Golgi-Cox Coloração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-25T09:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprenda a técnica de coloração Golgi-Cox para visualizar mudanças morfológicas neuronais após estimulação tátil em filhotes de ratos. Este método permite analisar a complexidade dendrítica e conectividade sináptica em neurociência do desenvolvimento.

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Este trabalho é financiado por doações NSERC para BK e RG. Os autores também gostariam de agradecer Kehe Xie e Russell Hosain por seus conhecimentos coloração Golgi-Cox.

Todas as experiências foram realizadas em conformidade com o Conselho Canadiano de Tratamento Animal e aprovado pela Universidade de Lethbridge, Comité Animal Care. 1. Criação e Tátil Estimulação <ol><li> Encomende ratas prenhes de animais fornecedores comuns ou raça filhotes em casa usando os procedimentos de criação de laboratório padrão. </li><li> Casa todos os animais em uma sala com temperatura controlada de criação (21 ° C), mantida em uma luz 12:12 hr: ciclo escuro e fornecer acesso a comida e água ad libitum. </li><li> Quando os filhotes nascem, ratos casa, individualmente com os seus descendentes. </li><li> Para evitar estresse adicional relacionado com a manipulação imediatamente após o nascimento, começar a estimulação tátil dos filhotes ao P3. </li><li> Estimulação tátil deve ser realizado três vezes por dia (09:00, 01:00 e 16:00) a partir de P3-P21 e os filhotes devem ser desmamados de suas mães no P21. </li><li> Quando se utiliza um design ninhada cruz, metade dos filhotes from cada ninhada será submetido a estimulação tátil com a outra metade servindo como controle. Aleatoriamente atribuir um número igual de filhotes machos e fêmeas para cada grupo. Para diferenciar filhotes submetidas a estimulação e controles táteis, marcar um grupo de filhotes de cachorro com um marcador permanente sobre as patas traseiras e cauda. Marcação tem que ser reaplicado a cada dois dias. </li></ol> Tátil Estimulação <ol start="7"><li> Remover barragens de sua gaiola e colocá-los em uma gaiola temporária com comida e água. Mantenha a represa e gaiola temporária na sala de criação / habitação. </li><li> Pesar os filhotes de rato como um grupo, antes da sessão de estimulação táctil manhã (09:00). Para cada sessão, rato transporte filhotes suas gaiolas de casa para uma sala de ensaio separado para a estimulação tátil. Coloque a gaiola em uma almofada de aquecimento que está definido para 24 ° C. </li><li> Use uma placa rígida para dividir a gaiola em duas metades. Coloque filhotes de ratos nas táteis estimulação grupo um meio de controle e filhotes a outra metade.Definir um temporizador de 15 min. </li><li> Usando um espanador-like macio e escovar todos os filhotes do grupo estimulação tátil, ao mesmo tempo, durante 15 minutos consecutivos. Os filhotes de ratos jovens (~ P3-P12) usualmente se amontoam e parecem entrar em um ciclo de sono profundo que torna muito fácil para estimular todos os filhotes de uma só vez. Como a idade filhotes, eles se tornam mais ativas, com alguns filhotes andando e investigar durante a sessão. O experimentador deve se mover continuamente crias errantes no grupo para garantir que cada filhote recebe igual estimulação. </li><li> Uma vez que a 15 min de sessão é completa, transportar os filhotes de volta para a sala de reprodução e retornar a mãe para a jaula. </li><li> Repita este processo três vezes por dia, durante os 19 dias de estimulação tátil. Após a sessão de estimulação tátil final no P21, os filhotes devem ser desmamados de suas mães. Os filhotes devem ser alojados em gaiolas com 5 ou 6 outros animais desmamados do mesmo sexo. </li><li> Se os ratos são submetidos a nenhum teste adicional, que deve ser deixado unperturbada, na luz normal: ciclo escuro com acesso a comida e água ad libitm (além de limpeza gaiola regular e manipulação) até atingirem cerca de 100 dias de idade. Se passando por outras manipulações experimentais, os animais devem ser tratados ou testados de acordo com esses protocolos de laboratório. </li></ol> 2. Sacrifício e Golgi-Cox Coloração <ol><li> Em aproximadamente P100, administrar uma dose excessiva de pentobarbital de sódio através de injecção IP aos ratos e perfundir intracardial com aproximadamente 100 ml de solução salina 0,9%. </li><li> Extraia o cérebro quando a perfusão for concluída. Remover o cérebro do crânio, o corte do nervo óptico por baixo com um esforço para manter o cerebelo intactas; os pesquisadores podem optar por manter ou remover os bulbos olfatórios. Coloque cérebros extraídos em uma garrafa Nalgene opaco com 20 ml de solução de Golgi-Cox 14. </li><li> Mantenha o cérebro em solução de Golgi-Cox por 14 dias. Após 14 dias, substituir o Golgi-Cboi solução com uma solução de sacarose a 30%. Mantenha o cérebro na solução de sacarose por 2-5 dias antes do corte. </li></ol> Nota: Se o cérebro não pode ser seccionado dentro de 14 dias da transferência para a solução de sacarose, o pesquisador precisa substituir a sacarose com um novo estoque de 30% de sacarose. O pesquisador pode substituir a sacarose a cada duas semanas durante quatro meses, sem efeitos adversos sobre a coloração. <ol start="4"><li> A fim de secção do cérebro, o cérebro deve ser seco com papel absorvente e fixo para o palco seccionamento com cola cyanocacrylic. Para evitar a ruptura ou corte irregular, o pesquisador deve ser cauteloso e garantir que todo o cérebro está bem presa ao palco. </li><li> O reservatório vibratome deve ser preenchido com uma solução de sacarose a 6% para um nível que cobre a lâmina de corte. Defina os parâmetros vibratome a uma velocidade e amplitude a 5, (o ponto médio em ambas as escalas). Fatie o cérebro em 200 mM seções e coloque as seções em um micro gelatinizado 2%slides escopo. Certifique-se de manter as seções molhado durante o curso de corte. </li><li> Quando todas as seções de interesse foram coletadas, pressione as seções para os slides, aplicando pressão para as lâminas com papel absorvente umedecido. Armazenar os slides em uma porta-lâminas na câmara de umidade até que eles estejam prontos para ser manchada. Eles devem permanecer na câmara úmida por pelo menos 12 horas, mas não mais do que 4 dias. Os slides precisa ser úmido e não devem ser autorizados a secar. </li><li> Prepare o regimento coloração antes de iniciar o processo de coloração. Etiqueta doze pratos de coloração de vidro (10,7 x 8,5 x 6,8 centímetros) e de processo da seguinte forma: <ol><li> Água destilada - 1 min </li><li> Hidróxido de amónio - 30 min (no escuro) </li><li> Água destilada - 1 min </li><li> Kodak Correção para Film - 30 min (no escuro) </li><li> Água destilada - 1 min </li><li> 50% de álcool - 1 min </li><li> 70% de álcool - 1 min </li><li> 95% de álcool - 1 min </li><li> 100% Alcohol - 5 min </li><li> 100% de álcool - 5 min </li><li> Solução (1/3 do clorofórmio, 1/3 HemoDe, 1/3 100% de álcool) - 15 min </li><li> HemoDe - 15 min </li></ol></li></ol> * Xileno pode ser utilizado em substituição de HemoDe. A fim de garantir a qualidade da coloração consistente, soluções frescos devem ser utilizados para cada porta-lâminas processado. <ol start="8"><li> Após o último 15 min emersão em HemoDe, lamela as lâminas com Permount. </li><li> Permitir que as lâminas para o ar seco antes de examinar com um microscópio. </li></ol>

<ol><li>Mychasiuk, R., Ilnystkyy, S., Kovalchuk, O., Kolb, B., Gibb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensity+matters%3A+Brain%2C+behaviour%2C+and+the+epigenome+of+prenatally+stressed+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intensity matters: Brain, behaviour, and the epigenome of prenatally stressed rats.</a> Neuroscience. 180, 105-110 (2011).</li>
<li>Muhammad, A., Carroll, C., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+during+development+alters+dendritic+morphology+in+the+nucleus+accumbens+and+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stress during development alters dendritic morphology in the nucleus accumbens and prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 216, 103-109 (2012).</li>
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<li>Rodrigues, A., Artneni, N., Abel, C., Zylbersztejn, D., Chazan, R., Viola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tactile+stimulation+and+maternal+separation+prevent+hippocampal+damage+in+rats+submitted+to+neonatal+hypoxia-ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Tactile stimulation and maternal separation prevent hippocampal damage in rats submitted to neonatal hypoxia-ischemia.</a> Brain Research. 1002, 94-99 (2004).</li>
<li>Kolb, B., Gibb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tactile+stimulation+after+frontal+or+parietal+cortical+injury+in+infant+rats+facilitates+functional+recovery+and+produces+synaptic+changes+in+adjacent+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Tactile stimulation after frontal or parietal cortical injury in infant rats facilitates functional recovery and produces synaptic changes in adjacent cortex.</a> Behavioural Brain Research. 214, 115-120 (2010).</li>
<li>Muhammad, A., Hossain, S., Pellis, S., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tactile+stimulation+during+development+attenuates+amphetamine+sensitization+and+structurally+reorganizes+prefrontal+cortex+and+striatum+in+a+sex-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tactile stimulation during development attenuates amphetamine sensitization and structurally reorganizes prefrontal cortex and striatum in a sex-dependent manner.</a> Behavioral Neuroscience. 125 (2), 161-174 (2011).</li>
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<li>Glaser, E. M., van der Loos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thick+brain+sections+by+obverse-reverse+computer+microscopy%3A+Application+of+a+new%2C+high+clarity+Golgi-Nissl+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: Application of a new, high clarity Golgi-Nissl stain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4, 117-125 (1981).</li>
<li>Gibb, R., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+vibratome+sectioning+of+Golgi-Cox+stained+whole+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 79, 1-4 (1998).</li>
<li>Meaney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+care%2C+gene+expression%2C+and+the+transmission+of+individual+differences+in+stress+reactivity+across+generations%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Maternal care, gene expression, and the transmission of individual differences in stress reactivity across generations.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 1161-1192 (2001).</li>
<li>Robinson, T. E., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+associated+with+exposure+to+drugs+of+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse.</a> Neuropharmacology. 47, Suppl 1. 33-46 (2004).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Devido à plasticidade ostensiva do cérebro em desenvolvimento, é importante que os procedimentos experimentais envolvendo as primeiras experiências são analisadas e são feitas tentativas para controlar todas as variáveis ​​intervenientes. Por este motivo, uma concepção cruzada maca é utilizada durante o procedimento de estimulação táctil ao garantir que os filhotes são recebem experiências similares em todos os outros domínios de desenvolvimento. Além disso, é também importante que os vários filhotes de ninhadas múltiplas são seleccionadas para análise a fim de evitar a possibilidade de que os efeitos resultar de um desvio num cão ou maca. Estimulação táctil é acreditado para mimetizar o comportamento maternal que ocorre naturalmente, lamber e preparação, que se pensa ser benéfica para o desenvolvimento de descendência. Embora pesquisas anteriores tem enfatizado a primeira semana de vida (P0-P7) para ser um período crítico para lamber e aliciamento 16, a magnitude da mudança identificada de acordo com 18 dias de taestimulação ctile pode implicar que, apesar de existir momentos sensíveis, mais tempo de exposição é superior. Também é importante notar que os filhotes receberam estimulação táctil neste paradigma experimental também experimentar lambendo e preparação de suas mães, por conseguinte, a estimulação táctil é, para além da estimulação normal, administrados pela mãe. Finalmente, é preciso também estar ciente das mudanças depende de cada região. Embora a estimulação tátil durante o desenvolvimento do aumento da complexidade dendrítica no córtex pré-frontal, isso não garante que as mudanças estruturais desta natureza será evidente em todas as regiões do cérebro. É possível que a morfologia neuronal em outras regiões do cérebro tais como o córtex parietal, que respondem de uma maneira notavelmente diferente para a mesma experiência. No entanto, porque o procedimento de estimulação tátil é facilmente administrado e não representa qualquer risco para a prole ou barragens, que tem o potencial para servir como uma ferramenta valiosa para muitos estudos de investigação que visam melhorar o desenvolvimentoal resultados. No que diz respeito ao Golgi-Cox coloração de tecidos do cérebro, os passos críticos para visualização bem-sucedida de células neuronais são como se segue: 1) não tem de ser adequada a perfusão do cérebro com uma solução salina. Perfusão inadequada ou insuficiente dos tecidos cerebrais resultados em artefatos dos vasos sanguíneos que o tornam difícil de realmente visualizar células neuronais através do labirinto de vasos sanguíneos, além de complicar a capacidade de fotografar neurônios manchadas. 2) cérebros perfundido deve ser armazenado em solução de Golgi-Cox e a solução de sacarose no escuro. Armazenar o tecido cerebral no escuro reduz a coloração do tecido base, mais uma vez aumentando a oportunidade de visualizar com sucesso células neuronais qualidade. 3) O tecido cerebral é armazenado em solução de sacarose a seguir a 14 dias de armazenamento em solução de Golgi-Cox. Quando o tecido é imerso na solução de sacarose a 30% durante 2-5 dias, os cérebros são mais flexíveis que impede quebra e rasgamento das secções quandocorte. É importante evitar que o tecido cerebral de que permanece na solução de sacarose, por períodos de tempo aumentados (a não ser que a solução de sacarose é continuamente substituída com solução fresca), porque o armazenamento prolongado em sacarose, reduz a qualidade da coloração. 4) Finalmente, uma vez que as lâminas foram manchadas e tampa deslizado, eles devem ser dado tempo suficiente para secar antes de visualização com um microscópio. Se os slides não são permitidas para o ar seco adequadamente, o tecido pode escurecer, reduzindo a visualização bem-sucedida de neurônios corticais. Mudanças estáveis ​​no funcionamento psicológico e respostas comportamentais que ocorrem em resposta a experiências são acreditados para ser facilitada pela reorganização da morfologia neuronal e conectividade sináptica 17. Como estas alterações estruturais proporcionar um recurso para mensurável dependente da experiência plasticidade, a utilização de um procedimento de coloração de confiança é importante. Procedimento de coloração de Golgi-Cox baseado Este vibratome fornece mancha confiáveling de galhos finos e espinhas dendríticas que podem não ser evidentes com outros protocolos como celoidina-incorporação. A peculiaridade do processo de Golgi-Cox decorre de sua capacidade de manchar apenas uma pequena fração dos elementos neuronais (1-10%), o que permite o rastreamento de neurônios individuais para longas distâncias. Apesar do fato de que apenas uma pequena fração dos neurônios são impregnadas com a mancha, as células que são processados ​​visível, manter todos os recursos, incluindo corpo celular, dendritos, espinhas dendríticas e axônios. Além disso, quando o procedimento de coloração é realizado corretamente, as células marcadas destacam-se claramente e distintamente contra um fundo transparente, porque outras estruturas corticais permanecem unstained e transparente. Devido à constatação de que alterações persistentes no funcionamento exterior deve estar relacionada com a plasticidade do sistema nervoso, ou seja, a capacidade dos neurônios para modificar sua estrutura e conectividade, o procedimento de coloração de Golgi-Cox fornece aos pesquisadores umatécnica confiável para visualizar e quantificar essa plasticidade.

Embora existam muitas técnicas relatadas e utilizados para a análise das primeiras experiências negativas na maturação do cérebro, como o stress perinatal 1,2, privação sensorial 3 e toxicidade de drogas 4, há muito poucas metodologias empregadas para examinar os efeitos de experiências positivas em este período de tempo. Além de enriquecimento ambiental, estimulação táctil é um dos poucos cérebro, melhorando os tratamentos com efeitos demonstrados 5. A estimulação tátil é um método de estimulação sensorial para a pele que imita o comportamento de ratos materna, lambendo e aliciamento. Sua aceitação geral como uma manipulação positiva surge a partir de estudos que indicam que a estimulação tátil melhorado maturação de recém-nascidos prematuros e ratos recém-nascidos 6. Além disso, a pesquisa no laboratório Meaney 7 demonstrou que os níveis mais elevados de lamber materna e aliciamento estão ligados a resultados positivos na prole. Devido a tinfluências positivas stas, estimulação tátil evoluiu rapidamente em uma estratégia de remediação que visa reduzir a ansiedade 8, melhorando os resultados associados com lesão cerebral 9-11, e atenuação de sensibilização da droga 12. Como tal, a estimulação tátil é uma técnica valiosa para a promoção de primeiras experiências positivas, com uma capacidade comprovada para reorganizar drasticamente morfologia neuronal e conectividade sináptica do cérebro em desenvolvimento. De modo a examinar e quantificar as alterações na morfologia neuronal, é necessário visualizar os neurónios intactos. O procedimento de coloração de Golgi-Cox é uma modificação da técnica de Camillo Golgi publicado no final de 1800 que fornece coloração discreta de um pequeno número de neurônios completos 13. Embora o procedimento parece manchar os neurônios de forma aleatória e reprodutibilidade é comumente citado como grande falha, a visualização permite taxa de impregnação pequena de todo o elemento neuronal, incluindo cecorpos ll, dendritos, espinhas dendríticas e axônios. Da mesma forma, o tempo necessário para impregnar um dado cérebro com solução de Golgi, também tem sido citado como uma queda. No entanto, dado que uma vez que a coloração é tecido completo pode ser preservado indefinidamente, e o tempo entre a perfusão do cérebro e da visualização dos neurónios com um microscópio pode ser completado em menos de 21 dias, o período de tempo não é razoável. Além disso, com pequenas modificações no protocolo, a coloração de Golgi-Cox pode ser efetivamente usado para impregnar cérebros dos roedores de todas as faixas etárias. Como as mudanças no nível estrutural têm sido associados a modificações persistentes para funcionamento comportamental e psicológica, a técnica de coloração de Golgi-Cox fornece aos pesquisadores uma ferramenta valiosa para medir a neuroplasticidade.

<table><tbody><tr><td>Dicromato de potássio</td><td>Fisher</td><td>P188</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de mercúrio</td><td>Fisher</td><td>M1561</td><td></td></tr><tr><td>Cromato de potássio</td><td>Fisher</td><td>P220</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de amônio</td><td>Fisher</td><td>A669-500</td><td></td></tr><tr><td>Kodak Rapid Fix</td><td>Vistek</td><td>Kodak 146 4016</td><td></td></tr><tr><td>EtOH-95 & </td><td>Álcoois Comerciais Anidros</td><td>Sem Números de Gato</td><td>Todos os outros Et-OH são diluições</td></tr><tr><td>Swiffers- Soft Feather-Like dusters</td><td>Safeway</td><td></td><td>Pode ser encontrado na maioria dos supermercados</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9378</td><td></td></tr><tr><td>HemoDe</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>23410</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>Sp15</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>VWR</td><td>160004-365</td><td></td></tr><tr><td>lamínulas</td><td>VWR</td><td>062011-9</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizar os efeitos de uma experiência precoce positiva, tátil estimulação, em dendríticas morfologia e synaptic conectividade com golgi-cox coloração

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

Para gerar mudanças de longo prazo no comportamento, experiências devem ser estáveis ​​produzindo mudanças na morfologia neuronal e conectividade sináptica. A estimulação tátil é uma experiência inicial positiva que imita materna lambendo e aliciamento no rato. Expondo filhotes de ratos para esta experiência positiva pode ser concluída de forma fácil e econômica, utilizando materiais altamente acessíveis, tais como um espanador doméstico. Usando um projeto cross-ninhada, os filhotes são ou acariciou ou deixado em repouso, por 15 minutos, três vezes por dia durante o período perinatal. Para medir as mudanças de neuroplasticidade relacionados com esta experiência inicial positiva, é utilizado Golgi-Cox coloração do tecido cerebral. Devido ao facto de Golgi-Cox impregnação cora um número discreto de neurónios, em vez de todas as células, a coloração do cérebro de roedores com solução de Golgi-Cox permite a visualização de elementos neuronais inteiros, incluindo o corpo da célula, os dendritos, axónios e espinhas dendríticas. O procedimento i coloraçãos realizados ao longo de vários dias e exige que o pesquisador preste muita atenção aos detalhes. No entanto, uma vez que a coloração é concluído, a totalidade do cérebro foi impregnada e pode ser preservado indefinidamente para análise contínua. Portanto, a coloração de Golgi-Cox é um recurso valioso para o estudo de dependentes de experiência plasticidade.

Quando este processo de coloração foi seguido de forma adequada, a coloração consistente e uniforme de dendritos e espinhas é gerado. Ver Figura 1 para uma representação de coloração neuronal Golgi-Cox. Este procedimento produz coloração que é comparável à visualização dos campos dendríticas que são ininterrupta embutindo tecido seguinte recentemente desenvolvido métodos in vitro e podem permitir. A técnica baseada vibratome para a coloração de Golgi-Cox foi encontrado para produzir coloração mais generalizada de ramos terminais e neurônios piramidais, de coloração com ou incorporado-celoidina e tecido seccionado-criostato de 15. Além disso, porque este método de coloração impregna todo o cérebro, todas as seções podem ser analisados ​​imediatamente ou no futuro. Como o local da mudança morfológica é que nem sempre é óbvia ao gerar uma hipótese original, este processo permite a exploração de regiões cerebrais adicionais umd impede a eliminação de tecido que pode ser útil no futuro. Este método de coloração pode ser usado para a coloração confiável de quaisquer cérebros de ratos idosos (idade P0 de idade). No entanto, quando a coloração cérebros jovens (&lt;1 grama), o cérebro deve apenas permanecem na solução de Golgi-Cox durante 6 dias, em vez dos 14 dias recomendados para cérebros adultos, todos os outros procedimentos são mantidos constantes. A principal dificuldade que pode ser encontrada durante o processo de coloração de Golgi-Cox é a incapacidade de produzir a coloração de regiões cerebrais centrais, incluindo o tálamo de alta qualidade. Como todo o cérebro é impregnado, ao mesmo tempo, as regiões centrais pode não receber concentrações ideais de mancha. Apesar desta descoberta, a técnica de Golgi-Cox produz coloração excepcional das regiões subcorticais, tais como o hipocampo e estriado. Uma limitação final do processo decorre de incompleta remoção de sangue do cérebro durante o processo de perfusão. O sangue pode produzir artefatos no tecido cerebralque torna difícil para fotografar e rastrear os neurônios. Técnicas de coloração de Golgi-Cox fornecer uma medida confiável da morfologia dendrítica e neuroanatomia que é útil para uma extensa gama de estudos destinados a examinar as mudanças no nível neuronal. Ao examinar a estrutura neuronal no córtex pré-frontal após a estimulação tátil no período pós-natal precoce, coloração Golgi-Cox revelou um aumento dramático na complexidade dendrítica. Alterações anatômicas relacionadas com a estimulação tátil precoce pode ser demonstrada visualmente comparando densidade da coluna de neurônios piramidais de um rato controle para piramidal neurônios de um rato que passou por estimulação tátil (veja a Figura 1). Além disso, os parâmetros tais como a arborização dendrítica, dendrítica comprimento, e densidade de espinha podem ser calculadas e analisadas estatisticamente para gerar dados contínua, que podem ser comparados entre os animais. Para gerar resultados confiáveis, a análise deve ser realizada em amínima de três animais por grupo de tratamento e, aproximadamente, cinco neurónios por hemisfério deve ser seleccionado aleatoriamente para cada região do cérebro em análise. Figura 2 demonstra a complexidade dendrítica (espinhas / mM x mM de dendrite) dos animais que receberam estimulação e animais que não táctil . Em ambos os campos apicais e basilar dos neurônios analisados ​​a partir da mPFC (CG3), estimulação tátil resultou na proliferação de parâmetros neuronais. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50694/50694fig1.jpg" /> Figura 1. A. Representante fotografia de um Golgi-Cox manchado neurônio piramidal da camada III da área CG3 em um rato que recebeu estimulação tátil durante o desenvolvimento. B. Representante ampliada (1.000 X) fotografia de espinhas dendríticas nos dendritos terminais na área basilar da CG3 , a imagem mais clara da esquerda é para um rato no grupo de controle ea imagem mais escuro no right é de um rato que receberam estimulação tátil. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50694/50694fig2.jpg" /> Figura 2. Representação ilustrativa da complexidade dendrítica apical e basilar média (espinhas / mM x mm) para os neurónios na área de CG3 de ratos adultos que receberam estimulação táctil ou durante o desenvolvimento ou não (* p &lt;0,01).

Este documento descreve os procedimentos para a estimulação tátil de filhotes de ratos e posterior coloração de Golgi-Cox da morfologia neuronal. A estimulação tátil é uma experiência positiva que é administrada no período perinatal por acariciar filhotes com um espanador doméstico. Coloração de Golgi-cox é um processo fiável que permite a visualização dos neurónios inteiras.

Visualizar os Efeitos de uma experiência precoce positiva, Tátil Estimulação, em dendríticas Morfologia e Synaptic conectividade com Golgi-Cox Coloração

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar técnicas de coloração com Goldy G Cox para visualizar as alterações morfológicas nos neurônios que ocorrem após estimulação tátil no início da vida. Isso é realizado primeiramente administrando a estimulação tátil três vezes ao dia, do terceiro ao 21º dia pós-natal. O segundo passo consiste em perfundir os animais quando atingem a idade de investigação e armazenar seus cérebros em solução de Goldy Cox.Em seguida, os cérebros são cortados com o Aome. O passo final é impregnar os cérebros com a técnica de contramarcagem GOGI. Em última análise, o procedimento GOGI é usado para visualizar neurônios individuais, o que permite a análise de alterações morfológicas.A beleza da técnica de Goy Cox é que ela nos permite quantificar a estrutura dos neurônios e correlacionar isso com resultados comportamentais. As implicações dessa técnica estendem-se aos transtornos do desenvolvimento, já que a estimulação tátil tem demonstrado ser eficaz tanto na recuperação comportamental quanto anatômica desses transtornos. Embora este método possa fornecer informações sobre a neuroanatomia de ratos, ele também pode ser aplicado a outros organismos modelo e ao tecido cerebral humano.Para ajudar a aprofundar o entendimento sobre a plasticidade dependente da experiência, os animais são mantidos em um ciclo claro-escuro de 12 horas com livre acesso a alimento e água após o nascimento. Cada rata fêmea é alojada individualmente com sua prole. Para evitar estresse adicional relacionado ao manejo, as crias recebem estimulação tátil a partir do P3.Após pesar as crias antes da sessão matinal de estimulação tátil, transporte-as em suas gaiolas de origem para uma sala de testes separada. Coloque a gaiola de origem sobre uma placa aquecida regulada em 24 graus Celsius. Quando estiver pronto para a estimulação tátil, remova as mães da sua gaiola de origem e coloque-as em uma gaiola temporária com comida e água.Mantenha a matriz e a gaiola temporária na sala de reprodução. Em seguida, use uma placa rígida para dividir a gaiola principal em duas metades. Depois, atribua aleatoriamente metade dos filhotes de cada ninhada para receber estimulação tátil, enquanto a outra metade servirá como controle.Marque as patas traseiras e a cauda com marcador permanente para diferenciar os grupos e coloque os filhotes do grupo de estimulação tátil em um lado da gaiola e os filhotes controle no outro. Acerte o temporizador para 15 minutos usando uma pena macia como um espanador. Escove todos os filhotes do grupo de estimulação tátil ao mesmo tempo, durante 15 minutos consecutivos.Os filhotes jovens de rato geralmente se agrupam e parecem entrar em um ciclo de sono profundo, facilitando muito a estimulação de todos os filhotes ao mesmo tempo. À medida que envelhecem, tornam-se mais ativos, com alguns filhotes andando e explorando. Durante a sessão, mova qualquer filhote que se afaste de volta ao grupo para garantir que cada um receba estímulo igual.Após 15 minutos de estimulação tátil, devolva a mãe à gaiola e transporte a gaiola de volta à sala de reprodução. Esse processo é repetido três vezes ao dia, durante 19 dias. Após a sessão final de estimulação tátil, retire os filhotes de suas mães. Os filhotes são alojados em gaiolas com outros cinco ou seis animais desmamados do mesmo sexo e deixe as ratas indisturbadas em condições padrão de alojamento até atingirem a idade de investigação.As amostras são coletadas quando os animais atingem 100 dias de idade. Após eutanásia e perfusão intracardíaca, o cérebro é extraído, tomando cuidado para manter o cerebelo intacto.Coloque os cérebros em um frasco Nalgene opaco contendo 20 mililitros de solução Goldy Cox, onde permanecerão por 14 dias. Após 14 dias, substitua a solução por uma solução de 30% de sacarose. Mantenha os cérebros na solução de sacarose por dois a cinco dias antes do corte.Seque o cérebro antes de fixá-lo em uma plataforma de corte com cola acrílica Sano para evitar rasgos ou cortes irregulares; certifique-se de que todo o cérebro esteja firmemente preso à plataforma. Em seguida, encha o reservatório do Vibram com solução de sacarose a 6% até cobrir a lâmina de corte. Ajuste a velocidade e a amplitude do Vibram para cinco.Corte o cérebro em seções de 200 mícrons e coloque as seções em uma lâmina de microscópio gelatinizada a 2%. Certifique-se de manter as seções úmidas durante todo o processo de corte, até que todas as seções de interesse tenham sido coletadas. Pressione as seções sobre as lâminas aplicando pressão com papel filtro umedecido.Coloque as lâminas em uma grade para lâminas e armazene-as em uma câmara de umidade por pelo menos 12 horas, mas não por mais de quatro dias. Para iniciar o procedimento de coloração, rotule e prepare 12 recipientes de vidro para coloração. Primeiro, imerja as lâminas em água destilada por um minuto.Em seguida, coloque as lâminas em hidróxido de amônio e mantenha-as no escuro por 30 minutos. Após um minuto adicional em água destilada, coloque as lâminas em revelador Kodak por 30 minutos com proteção contra a luz. Coloque as lâminas em água destilada mais uma vez antes de desidratar em uma série de soluções alcoólicas graduadas.Após a última lavagem com álcool, coloque as lâminas em uma solução de um terço por 15 minutos. Por fim, coloque as lâminas em hemo D por 15 minutos. Quando estiver pronto, use paramount para colocar as lamínulas sobre as lâminas e deixe as lâminas secarem ao ar antes de examiná-las ao microscópio.Aqui está uma fotografia representativa de um neurônio parametal corado pela técnica de Golgi-Cox em um rato que recebeu estimulação tátil durante o desenvolvimento. Uma fotografia ampliada mostra espinhos dendríticos nos dendritos terminais. A imagem mais clara à esquerda é de um rato do grupo controle e a imagem mais escura é de um rato que recebeu estimulação tátil.Este gráfico representa a complexidade dendrítica apical e basal média para neurônios na área CG três de ratos adultos que receberam ou não estimulação tátil durante o desenvolvimento. Ao seguir este procedimento, temos a vantagem de que, se desejarmos fazer perguntas adicionais, já coramos todo o cérebro e, portanto, podemos retornar e usar o mesmo tecido cerebral para responder essas questões. Ao desenvolver essas técnicas, abrimos caminho para que pesquisadores explorem a utilidade da estimulação tátil como terapia para o tratamento de traumatismos cranianos ou outras formas de lesão neurológica após seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para que pesquisadores da neurociência explorem seu potencial na remediação de traumas cerebrais e distúrbios do desenvolvimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fornecer aos filhotes um envolvimento com a estimulação tátil enriquecedora, bem como de um método para visualizar neurônios e sinapses individuais.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Numerosos estudos recentes identificaram mutações em proteínas sinápticas associada a patologias cerebrais. Primários cultivados neurônios corticais oferecem grande flexibilidade para examinar os efeitos destas proteínas doenças associadas na morfologia e motilidade espinha dendrítica.

Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS

Descrevemos dois métodos para visualização e quantificação da arborização dendrítica no hipocampo de modelos de camundongos: imagens em tempo real e de profundidade de campo estendida. Enquanto o primeiro método permite um rastreamento topográfico sofisticado e a quantificação da extensão da ramificação, o último permite a visualização rápida da árvore dendrítica.

Avaliação de dendríticas Arborização no giro dentado do hipocampo em Ratos Região

Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite imagens crônicas de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos usando microscopia in vivo de dois fótons na linha transgênica Thy1-GFP. Essa abordagem é combinada com a injeção de vírus adeno-associado que expressa mCherry no hipocampo dorsal. Essas técnicas permitem o monitoramento de longo prazo da plasticidade estrutural dependente da experiência em RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

Apresenta-se um protocolo para a utilização do método de coloração de Golgi-Cox em secções do cérebro de espessura, a fim de visualizar os neurónios com árvores dendriticas longos contidos dentro de amostras de tecidos individuais. Duas variantes deste protocolo são também apresentados que envolvem cresilo contracoloração violeta, e a congelação dos cérebros não transformadas, para o armazenamento a longo prazo.

Neurônios de imagem dentro de seções do cérebro grossas usando o método de Golgi-Cox

Aqui apresentamos um protocolo Golgi-Cox com detalhes detalhados. Este método de mancha de tecido confiável permite uma avaliação de alta qualidade da citoarquitetura no hipocampo e em todo o cérebro, com solução de problemas mínima.

Avaliação da complexidade dendrítica do hipocampo em ratos idosos usando o método de Golgi-Cox

Este protocolo descreve um método para tratamento de imagens simultâneo de thalamocortical axônio ramificação e sinapse formação em cocultures de organotypic do tálamo e córtex cerebral. Axônios de thalamocortical individuais e seus terminais pré-sináptica são visualizados pela técnica de eletroporação única célula com DsRed e Sinaptofisina GFP-etiquetado.

Visualização do axônio Thalamocortical ramificação e sinapse formação em Organotypic Cocultures

Aqui descrevemos um método para visualizar a sinaptogênese de neurônios de grânulos no cerebelo do rato ao longo do curso de tempo do desenvolvimento cerebral pós-natal, quando essas células refinam suas estruturas sinápticas e formam sinapses para se integrarem ao circuito cerebral geral.

Utilizando a eletroporação pós-natal in vivo para estudar a morfologia do neurônio do grânulo cerebelar e o desenvolvimento da sinapse

O protocolo descreve uma modificação do método golgi rápido, que pode ser adaptado a qualquer parte do sistema nervoso, para colorir neurônios no hipocampo e córtex pré-frontal medial do rato.

Mancha rápida de Golgi para Visualização da Coluna Dendrítica no Hipocampo e Córtex Pré-Frontal

Descrevemos aqui métodos para induzir e analisar a remodelação olfativa dependente da experiência dos glomérulos sinápticos do lobo antenal no cérebro juvenil de Drosophila .

Remodelação dependente da experiência da conectividade sináptica do neurônio sensorial olfativo do cérebro juvenil em um período crítico no início da vida

O protocolo apresentado descreve o uso de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para quantificar as mudanças circadianas no córtex do barril de camundongos, focando principalmente no número de sinapses e na morfologia da coluna dendrítica.

Microscopia eletrônica de transmissão como técnica de visualização para análise da plasticidade sináptica circadiana no córtex de barril de camundongo

Aprenda a técnica de coloração Golgi-Cox para visualizar mudanças morfológicas neuronais após estimulação tátil em filhotes de ratos. Este método permite analisar a complexidade dendrítica e conectividade sináptica em neurociência do desenvolvimento.

Visualizar os Efeitos de uma experiência precoce positiva, Tátil Estimulação, em dendríticas Morfologia e Synaptic conectividade com Golgi-Cox Coloração (Vídeo) | JoVE Journal

Visualizar os Efeitos de uma experiência precoce positiva, Tátil Estimulação, em dendríticas Morfologia e Synaptic conectividade com Golgi-Cox Coloração

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