Neurônios de imagem dentro de seções do cérebro grossas usando o método de Golgi-Cox

O objetivo geral deste procedimento é determinar o tratamento eficaz na morfologia dos neurônios dentro do cérebro de roedores. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como a morfologia normal e experimentalmente manipulada de neurônios em várias regiões do cérebro de roedores. Essa técnica tem a principal vantagem de aumentar a probabilidade de identificar e visualizar neurônios marcados que estão totalmente contidos em amostras histológicas únicas.

Comece a coloração de Golgi-Cox colocando um cérebro de camundongo fresco em um frasco de cintilação de vidro de 20 mililitros contendo 17 mililitros de solução de Golgi-Cox. Proteger da luz e incubar à temperatura ambiente durante 25 dias. Uma vez decorrido o período de incubação, o Cryo protege o cérebro colocando-o em 40 mililitros de crioprotetor de sacarose e incuba no escuro a 4 graus Celsius por 24 horas.

Após a incubação na sacarose, o cérebro pode ser congelado para armazenamento de longo prazo ou imediatamente bloqueado para seccionamento, conforme mostrado na próxima seção do vídeo. Se estiver congelando, mergulhe todo o cérebro em 200 mililitros de isopentano que foi pré-resfriado em gelo seco. Em seguida, coloque o cérebro congelado em um tubo cônico de 50 mililitros e armazene no escuro a 80 graus Celsius negativos.

Para começar, remova o cérebro da sacarose. E use uma lâmina de barbear para bloqueá-lo para seccionamento, cortando o cerebelo, deixando uma borda plana na extremidade caudal restante do cérebro. O cérebro deve ser bloqueado em um ângulo preciso para garantir que os neurônios de interesse estejam totalmente contidos nas seções resultantes.

Por exemplo, usamos um plano coronal perfeitamente perpendicular ao eixo caudal rostral para neurônios piramidais do córtex cerebral. Em seguida, aqueça o ágar até derreter. E deixe esfriar até que esteja um pouco acima do ponto de fusão.

Em seguida, coloque o cérebro em um pequeno prato de pesagem descartável com a extremidade caudal voltada para baixo. Adicione ágar derretido para cobrir o cérebro. Assim que o ágar solidificar, corte o excesso deixando aproximadamente dois a quatro mililitros ao redor do cérebro.

Em seguida, use uma pequena quantidade de cianoacrilato de etila para colar o cérebro ao estágio de um vibratomo com a extremidade caudal voltada para baixo. Preencha a área do palco do vibratomo com crioprotetor de sacarose suficiente para cobrir o cérebro. Em seguida, corte o cérebro em uma espessura de fatia de 400 a 500 mícrons, dependendo da região do cérebro a ser examinada.

Usando um pincel pequeno, coloque seções cerebrais em poços de uma placa de cultura de tecidos de seis poços contendo inserções de fundo de malha e pré-preenchidas com tampão fosfato de sacarose M. Proteja da luz durante o seccionamento. Quando terminar de seccionar, incube as seções no escuro a quatro graus Celsius durante a noite.

Usando as inserções de fundo de malha, transfira as seções cerebrais para um novo poço contendo cinco mililitros de paraformaldeído em tampão fosfato. Incube em um balancim movendo-se em baixa velocidade em temperatura ambiente no escuro por 15 minutos. Lave as seções duas vezes, transferindo-as para novos poços contendo cinco mililitros de água.

Proteger da luz e lavar em velocidade moderada à temperatura ambiente durante cinco minutos. Em seguida, transfira as seções para um novo poço contendo cinco mililitros de hidróxido de amônio. Balance lentamente no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos.

Lave as seções duas vezes, transferindo-as para novos poços contendo cinco mililitros de água. Lave em uma cadeira de balanço movendo-se em velocidade moderada no escuro em temperatura ambiente por cinco minutos. Transfira as seções para um novo poço contendo cinco mililitros de fixador diluído A.Incube em um balancim movendo-se em baixa velocidade no escuro à temperatura ambiente por 25 minutos.

Lave as seções em água duas vezes como antes. Use um pincel pequeno para colocar as seções em uma lâmina de microscópio e, em seguida, use uma pinça e um pequeno lenço de papel para remover o excesso de água e ágar. Certifique-se de que todo o ágar seja removido antes de prosseguir com as etapas de desidratação.

Deixe as seções secarem ao ar livre em temperatura ambiente protegida da luz. O tempo de secagem apropriado é crítico e deve ser determinado para cada laboratório. Um tempo muito curto pode resultar na queda de seções de slides durante as etapas de desidratação, e um tempo muito longo pode resultar em rachaduras nas seções.

Após a secagem, coloque primeiro as lâminas no agente de limpeza por cinco minutos. Coloque as lâminas em etanol 100% por cinco minutos. Em seguida, passe por uma série de concentrações decrescentes de etanol por dois minutos cada.

Após a série de álcool, coloque as lâminas na água por cinco minutos. Em seguida, core em violeta de cresil 0,5% em água por sete minutos. Após a coloração violeta cresil, coloque as lâminas na água por dois minutos.

Em seguida, desidrate as seções por meio de uma série de concentrações crescentes de álcool por dois minutos cada. Em seguida, duas lavagens em etanol 100% por cinco minutos. Coloque no agente de compensação por cinco minutos.

Por fim, adicione um meio de montagem anidro e coloque uma lamínula sobre as seções. Deixe as lâminas secarem horizontalmente no escuro em temperatura ambiente por pelo menos cinco dias. Para capturar pilhas de imagens de alta resolução da área que contém o neurônio de interesse, primeiro selecione uma objetiva de imersão em óleo de silicone 30X 1,05 NA no microscópio.

Em seguida, aplique três a quatro gotas de óleo de imersão de silicone na lâmina. Coloque a objetiva sobre a corrediça, garantindo o contato entre a objetiva e o óleo. Foque a imagem e ajuste as definições da câmara, incluindo a exposição e o balanço de brancos no software de imagem.

Em seguida, defina os limites superior e inferior da pilha de imagens concentrando-se na parte superior da seção e, em seguida, selecionando definir ao lado da parte superior da pilha na janela de aquisição de imagem. Em seguida, concentre-se na parte inferior da seção e selecione definir ao lado da parte inferior da pilha. Defina a distância do passo para um mícron inserindo um mícron ao lado da distância entre as imagens dentro da janela de aquisição de imagem.

Por fim, capture a pilha de imagens selecionando adquirir pilha de imagens na janela de aquisição de imagens. Repita as etapas anteriores para capturar toda a área de interesse, certificando-se de que todas as pilhas de imagens se sobreponham em pelo menos 10% nos eixos X e Y. Esta imagem do córtex cerebral é uma projeção Z mesclada de pilhas de imagens adquiridas de uma seção de 500 mícrons de espessura usando uma objetiva de 10X.

O tecido nesta imagem foi processado usando o protocolo principal all fresh. A área indicada pelo quadrado vermelho foi fotografada usando uma objetiva de imersão em óleo de silício 30X e uma pilha de imagens de projeção Z mesclada de alta resolução foi adquirida. A seta vermelha mostra a projeção Z bidimensional de um neurônio que foi rastreado a partir da pilha de imagens 30X de alta resolução.

Aqui foi utilizada a variante de protocolo fresco com coloração de violeta cresila. Esta imagem de alta resolução mostra a seção manchada de violeta cresila. E este é o rastreamento de neurônios obtido.

Finalmente, esse tecido foi processado usando a variante de protocolo na qual os cérebros são congelados após a impregnação de Golgi-Cox. Aqui, o tecido previamente congelado é visto em resolução mais alta. E mais uma vez uma projeção Z bidimensional de alta qualidade do rastreamento de neurônios é obtida.

Essa técnica pode ser concluída em um mês, com as etapas de processamento e imagem concluídas na última semana. Os cérebros podem, alternativamente, ser congelados após a impregnação de Golgi-Cox, permitindo que o processamento e a imagem sejam concluídos posteriormente. Após esse procedimento, os neurocientistas podem usar as imagens capturadas para realizar análises morfológicas detalhadas, como complexidade dendrítica ou densidade da coluna, a fim de determinar como uma manipulação experimental pode alterar a estrutura dos neurônios dentro do cérebro.