Derivando o Curso momento do desembaraço glutamato com uma Análise de Deconvolução das correntes Transporter astrocitárias

O objetivo geral do experimento é estimar o curso do tempo de depuração do glutamato das membranas astrocíticas após sua liberação das sinapses excitatórias. O primeiro passo neste processo é registrar a ocorrência de transporte de glutamato ativado sinapticamente de astrócitos em fatias cerebrais agudas na ausência e presença de uma concentração subsaturante do antagonista transportador de glutamato de amplo espectro, TBOA. O segundo passo é analisar as gravações para isolar as correntes transportadoras de glutamato ativadas sinapticamente de todos os outros componentes da resposta evocada.

Em seguida, o curso do tempo do filtro é estimado analisando as correntes transportadoras registradas na presença de TBOA por meio do filtro da ocorrência de transporte registrada em condições controladas. O curso do tempo de depuração do glutamato das membranas astrocíticas é obtido. Os resultados mostram que, no hipocampo do camundongo, os astrócitos requerem apenas alguns milissegundos para remover o glutamato liberado sinapticamente da base espacial extracelular.

Essa abordagem fornece uma ferramenta sensível para detectar mudanças na capacidade de captação astrocítica em diferentes regiões do cérebro durante condições fisiológicas e patológicas. A principal vantagem dessa abordagem sobre outros métodos baseados, por exemplo, na análise de deslocamento de antagonistas do receptor de glutamato de rápida dissociação em indicadores fluorescentes de glutamato ou em simulações de computador de reação de difusão, é que ela fornece uma leitura experimental direta de alta resolução temporal da depuração do glutamato dos astrócitos. Este método nos permite entender a dinâmica espacial e temporal da transmissão sináptica no cérebro.

Pode nos ajudar a interpretar as alterações fisiopatológicas no glutamato, difusão e captação que podem ocorrer em certos distúrbios neurológicos, como a doença de Alzheimer. Comece este procedimento fazendo cinco cortes em um cérebro de camundongo dissecado com um bisturi. Primeiro, remova os bulbos olfatórios e o córtex frontal.

Em segundo lugar, remova o cerebelo. Em seguida, remova os lobos temporais esquerdo e direito. Em seguida, separe os dois hemisférios cerebrais com o corte sagital em meia.

Em seguida, cole a superfície lateral de cada seção do cérebro na placa de base vibram fria. O lado dorsal do cérebro deve estar voltado para a lâmina Vibram e o lado ventral do cérebro deve estar em contato com o bloco de ágar longe da lâmina vibrato. Em seguida, prenda a placa de base do vibrato na câmara de dissecação.

Defina a espessura da fatia para 250 micrômetros e ajuste a largura da lâmina antes de fatiar. Depois que a lâmina passar pelo córtex e pelo hipocampo, use um bisturi para cortar o hipocampo do córtex do mesencéfalo. Em seguida, coloque uma fatia na câmara de submersão a 34 graus Celsius depois de mantê-la a 34 graus Celsius por 30 minutos.

Deixe-os esfriar até a temperatura ambiente por 30 minutos antes de usá-los para os registros de eletrofisiologia neste procedimento, transfira uma fatia para a câmara de registro. Inspecione visualmente a fatia sob a iluminação de ponto ou IRDIC. Os astrócitos podem ser identificados por seu pequeno corpo celular e núcleo proeminente para estimulação sináptica.

Coloque um eletrodo bipolar de aço inoxidável a cerca de 100 micrômetros de distância do astrócito que você planeja corrigir. Remende o astrócito e quebre toda a configuração celular aplicando uma sucção muito suave. Em seguida, alterne estímulos únicos e emparelhados a cada 10 a 20 segundos para isolar as porções facilitadas da ocorrência de transporte ativado sinapticamente.

Primeiro, média de pelo menos 20 varreduras obtidas com estímulos pareados em condições controladas e na presença de 10 micromolares antagonistas do transportador de glutamato de amplo espectro. O TBOA então calcula a média de um número idêntico de varreduras obtidas com estímulos únicos em condições de controle e em 10 TBOA micromolares subtrai o traço médio obtido com estímulos únicos do traço médio obtido com estímulos pareados. Esta etapa permite isolar a STO geométrica e a corrente de potássio sustentada evocada pelo segundo estímulo.

No próximo turno, o traço médio obtido com estímulos únicos por um intervalo de tempo que corresponde ao intervalo PUL usado para fornecer pulsos emparelhados subtrai a resposta média deslocada no tempo obtida com estímulos únicos da resposta média ao segundo estímulo obtido anteriormente. Esta etapa isola uma porção facilitada da corrente transportadora evocada pelo segundo estímulo. Na maioria dos casos, esta etapa remove totalmente a corrente de potássio sustentada.

Se for esse o caso, o isolamento do FSTC está completo e você pode prosseguir com a análise de deconvolução e chegar ao curso do tempo de depuração do glutamato dos astrócitos. Em alguns casos, no entanto, uma pequena corrente de potássio sustentada ainda está presente e uma análise mais aprofundada é necessária. Meça a amplitude da corrente de potássio sustentada restante após a execução.

A análise descrita anteriormente dimensiona a amplitude da função monoexponencial para a amplitude da corrente de potássio sustentada residual, definindo a amplitude da corrente de potássio sustentada medida como a nesta equação. Mas a constante de tempo de subida representa o valor médio de subida estimado em experimentos separados nos quais uma corrente de potássio sustentada é isolada. Farmacologicamente, usando uma alta concentração de saturação de TBOA, subtraia a função monoexponencial resultante do FSTC e da corrente de potássio sustentada.

Para completar o isolamento do FSTC. Para isolar a ocorrência de transporte ativado por flash. Calcule a média de pelo menos 20 varreduras obtidas com o caminho da luz aberto em condições de controle e em 10 TBOA micromolares e, em seguida, calcule a média do mesmo número de varreduras obtidas com o caminho da luz fechado em condições de controle, e em 10 TBOA micromolares subtraia o traço médio obtido com o caminho da luz bloqueado do traço médio obtido com o caminho da luz aberto.

Esta etapa permite remover o artefato de estímulo e isolar os FTCs nesta etapa ajustar a corrente de transporte FSTC ou FTC registrada em condições de controle e em TBOA de 10 micromolares e ajustá-los com uma função multi exponencial, criar uma função instantaneamente ascendente que decai mono exponencialmente de acordo com esta função e que melhor descreve a fase de decaimento da corrente do transportador registrada em TBOA de 10 micromolares. Em seguida, devolva a função mono exponencial do ajuste da corrente do transportador registrada em 10 micromolares TBOA para derivar o filtro. Em seguida, devolva o filtro do ajuste da corrente do transportador em condições controladas.

Para obter uma estimativa quantitativa do curso de tempo total da depuração do glutamato, calcule o OID da forma de onda ao tentar este procedimento. É importante confirmar que a ocorrência de transporte é registrada em condições experimentais em que o filtro opera em regime linear e introduz apenas distorções lineares do transporte. A onda de corrente a partir deles pode ser feita verificando as manipulações que alteram o tamanho da corrente de transporte.

Não mude o curso do selo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar gravações astrocíticas para extrair informações sobre glutamato, difusão e absorção no cérebro.