Name: Derivando o Curso momento do desembaraço glutamato com uma Análise de Deconvolução das correntes Transporter astrocitárias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Aprenda a estimar a cinética de remoção de glutamato em membranas astrocitárias usando análise de deconvolução de correntes de transportador. Este método eletrofisiológico revela a rápida captação de glutamato no hipocampo de camundongo.

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Doenças Neurológicas e programa de pesquisa intramuros Curso (NS002986). AS escreveu o manuscrito e implementada a análise de deconvolução. JSD desenvolveu a versão inicial da análise de deconvolução e comentou sobre o texto.

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<li>Diamond, J. S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+glutamate+does+not+overwhelm+transporters+on+hippocampal+astrocytes+during+high-frequency+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation.</a> J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).</li>
<li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+glutamate+transporter+dynamics+in+developing+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes.</a> Glia. 60, 175-188 (2012).</li>
<li>Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+synaptic+glutamate+spillover+and+reuptake+by+linker+optimized+glutamate-sensitive+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não há conflito de interesse.

Descrevemos aqui uma abordagem experimental para obter registos electrofisiolicos de astrócitos, um protocolo de análise para isolar as correntes do transportador de glutamato em astrócitos e um método matemático para derivar o curso de tempo de depuração a partir das correntes do transportador de glutamato astrocíticos. O sucesso da análise baseia-se na capacidade de obter alta qualidade gravações de patch clamp de astrócitos e na precisão dos algoritmos de montagem utilizadas para descreve...

Os astrócitos são um dos tipos de célula mais abundante no cérebro com uma morfologia em forma de estrela e as saliências de membranas finas que se estendem ao longo do neuropil e alcançar vizinha contactos sinápticos 1,2. Membrana celular dos astrócitos é densamente embalado com moléculas transportador de glutamato 3. Sob condições fisiológicas, os transportadores de glutamato rapidamente ligar glutamato no lado extracelular da membrana e transferi-lo para o citoplasma da célula. Ao fazer isso, os transportadores mantêm a concentração basal baixa de glutamato no espaço extracelular 4. Transportadores de glutamato em finas processos astrocitários adjacentes sinapses excitatórias são idealmente posicionado para ligar glutamato liberado durante eventos sinápticos, pois difunde para longe da fenda sináptica. Ao fazer isso, os transportadores também limitar spillover glutamato para peri e regiões extra-sinápticos e em sinapses vizinhas, reduzindo a propagação espacial do sinal excitatórios no cérebro 5-7. Transporte do glutamato é um processo eletrogênica estequiometricamente acoplado ao movimento de 3 Na + e H + 1 ao longo do seu gradiente electroquimico e ao contra-transporte de K + 1 8. Transporte de glutamato está associado (mas não estequiometricamente acoplado a) uma condutância aniônica permeável ao SCN - (tiocianato)&gt; NO 3 - (nitrato) ≈ ClO 4 - (perclorato)&gt; I -&gt; Br -&gt; Cl -&gt; F -, não a CH 3 SO 3 - (metano-sulfonato), C 6 H 11 O 7 - (gluconato) 9-11. Ambas as correntes (estequiométrica e não-estequiométrico) podem ser gravados pela obtenção de gravações de patch-clamp de célula inteira de astrócitos, identificados visualmente sob iluminação Dodt ou infra-vermelho contraste de interferência diferencial (IR-DIC), em Agudode e fatias de cérebro 12. O componente estequiométrica da corrente associado com o transporte do glutamato através da membrana pode ser isolado utilizando CH 3 SO 3 - ou C 6 H 11 O 7 - soluções intracelulares base e pode ser evocada por glutamato flash uncaging em astrócitos 13,14, ou ativando a liberação de glutamato de sinapses vizinhas, tanto eletricamente 12 ou com um controle optogenetic alvo. O decurso de tempo do componente estequiométrica do transportador de corrente é formada por toda a vida do perfil de concentração de glutamato na astrocíticos membranas (isto é, passe glutamato), a cinética de transportadores de glutamato, as propriedades de astrócitos membrana passiva, e durante estimulações sinápticos, pela sincronia de liberação de glutamato através das sinapses ativadas 13. Aqui vamos descrever em detalhes: (1) uma aprox experimentaloach para isolar o componente estequiométrica de correntes de transportador de glutamato a partir de células inteiras gravações de patch-clamp de astrócitos de rato utilizando fatias de hipocampo agudas como por exemplo a preparação experimental, (2) uma abordagem analítica para derivar o tempo de curso do apuramento glutamato destas gravações 13, 14. Estes métodos podem ser usados ​​para registar e analisar as correntes do transportador de glutamato a partir de astrócitos em qualquer região do sistema nervoso central.

<table><tbody><tr><td>CGP52432</td><td>Tocris</td><td>1246</td><td></td></tr><tr><td>(R,S)-CPP</td><td>Tocris</td><td>173</td><td></td></tr><tr><td>DPCPX</td><td>Tocris</td><td>439</td><td></td></tr><tr><td>LY341495 sal dissódico</td><td>Tocris</td><td>4062</td><td></td></tr><tr><td>MSOP</td><td>Tocris</td><td>803</td><td></td></tr><tr><td>NBQX sal dissódico</td><td>Tocris</td><td>1044</td><td></td></tr><tr><td>D,L-TBOA</td><td>Tocis</td><td>1223</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxina</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>MNI-L-glutamato</td><td>Tocris</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A10438</td><td>Eletrodos de</td></tr><tr><td>matriz</td> opcionais <td>Frederick Haer Company</td><td>MX21AES(JD3)</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato</td><td>World Precision Instruments</td><td>PG10165-4</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta de vidro de duplo estágio</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 404 adesivo instantâneo</td><td>Ted Pella</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada Xe</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>FlashMic</td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

derivando o curso momento do desembaraço glutamato com uma análise de deconvolução das correntes transporter astrocitárias

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

A maior densidade de transportadores de glutamato no cérebro é encontrada em astrócitos. O glutamato transportadores acoplar o movimento de glutamato através da membrana com o co-transporte de Na + e 3 1 de H + e a contra-transporte de K + 1. A corrente estequiométrica gerado pelo processo de transporte pode ser monitorizado com gravações de célula inteira de patch-clamp de astrócitos. O curso de tempo da corrente registada é moldada por o curso de tempo do perfil de concentração de glutamato que astrócitos são expostas, a cinética de transportadores de glutamato, e as propriedades das membranas passivas electrotonic astrocíticos. Aqui, descrevemos os métodos experimentais e analíticos que podem ser utilizados para registar as correntes do transportador de glutamato em astrócitos e isolar o curso de tempo de recarga glutamato de todos os outros factores que moldam a forma de onda das correntes de transportador astrocíticos. Os métodos descritos aqui podem ser usados ​​para estimar o tempo de vida of flash-uncaged e glutamato sinapticamente lançado em membranas astrocitários em qualquer região do sistema nervoso central durante a saúde ea doença.

O êxito da abordagem analítica descrita aqui criticamente dependente da obtenção de registos electrofisiolicos de alta qualidade a partir de correntes de transportador astrócitos em qualquer região do sistema nervoso central. Em fatias do hipocampo do rato agudas, os astrócitos podem ser prontamente identificados em Dodt iluminação ou IR-DIC, pois o corpo de célula pequena (Ø = 10 mm) e núcleo proeminente (Figura 1). A sua morfologia distinta em forma de estrela podem ser apreciados com epifluorescência...

Nós descrevemos um método analítico para estimar o tempo de vida de glutamato em membranas astrocitários de registros eletrofisiológicos de correntes transportador de glutamato em astrócitos.

Derivando o Curso momento do desembaraço glutamato com uma Análise de Deconvolução das correntes Transporter astrocitárias

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

O objetivo geral do experimento é estimar o curso temporal da eliminação de glutamato das membranas astrocíticas após sua liberação a partir de sinapses excitatórias. O primeiro passo neste processo é registrar a ocorrência de transporte de glutamato ativado sinapticamente a partir de astrócitos em fatias cerebrais agudas na ausência e na presença de uma concentração sub-saturante do antagonista de amplo espectro de transportadores de glutamato, TBOA. O segundo passo é analisar os registros para isolar as correntes de transportadores de glutamato ativadas sinapticamente de todos os outros componentes da resposta evocada.Em seguida, a cinética do filtro é estimada analisando as correntes do transportador registradas na presença de TBOA, desconvolvendo o filtro a partir da ocorrência de transporte registrada em condições controladas. Obtém-se a cinética da remoção de glutamato das membranas astrocitárias. Os resultados mostram que, no hipocampo de camundongo, os astrócitos precisam de apenas alguns milissegundos para remover o glutamato liberado sinapticamente do espaço extracelular.Essa abordagem fornece uma ferramenta sensível para detectar alterações na capacidade de captação de astrócitos em diferentes regiões cerebrais durante condições fisiológicas e patológicas. A principal vantagem desse método em relação a outras técnicas, por exemplo, baseadas na análise de deslocamento de antagonistas de receptores de glutamato de dissociação rápida em indicadores fluorescentes de glutamato ou em simulações computacionais de reação-difusão, é que ele oferece uma alta resolução temporal e uma leitura experimental direta da eliminação de glutamato pelos astrócitos. Este método nos permite compreender a dinâmica espacial e temporal da transmissão sináptica no cérebro.Isso pode nos ajudar a interpretar alterações fisiopatológicas no glutamato, na difusão e na captação que podem ocorrer em certos distúrbios neurológicos, como a doença de Alzheimer. Inicie este procedimento fazendo cinco cortes em um cérebro de camundongo dissecado com um bisturi. Primeiro, remova os bulbos olfatórios e o córtex frontal.Em segundo lugar, remova o cerebelo. Em seguida, remova os lobos temporais esquerdo e direito. Depois, separe os dois hemisférios cerebrais com um corte sagital mediano.Em seguida, cole a superfície lateral de cada seção cerebral à placa-base fria do vibram. O lado dorsal do cérebro deve ficar voltado para a lâmina do Vibram e o lado ventral do cérebro deve estar em contato com o bloco de ágar, afastado da lâmina do vibratomo. Em seguida, fixe a placa-base do vibratomo à câmara de dissecação.Defina a espessura da fatia como 250 micrômetros e ajuste a largura da lâmina antes do corte. Após a lâmina atravessar o córtex e o hipocampo, use um bisturi para separar o córtex-hipocampo do mesencéfalo. Posteriormente, coloque uma fatia na câmara de submersão a 34 graus Celsius, após manter as fatias a 34 graus Celsius por 30 minutos.Deixe-os esfriar até a temperatura ambiente por 30 minutos antes de utilizá-los para os registros de eletrofisiologia neste procedimento, transfira uma fatia para a câmara de registro. Inspeccione visualmente a fatia sob iluminação pontual ou I-R-D-I-C. Os astrócitos podem ser identificados pelo seu pequeno corpo celular e núcleo proeminente para estimulação sináptica.Posicione um eletrodo bipolar de aço inoxidável a cerca de 100 micrômetros de distância do astrócito que você pretende realizar o patch. Realize o patch no astrócito e estabeleça a configuração de célula inteira aplicando uma sucção muito suave. Em seguida, alterne estímulos únicos e pareados a cada 10 a 20 segundos para isolar as porções facilitadas da ocorrência de transporte ativado sinapticamente.Primeiro, faça a média de pelo menos 20 varreduras obtidas com estimulações pareadas em condições controladas e na presença de 10 micromolar do antagonista de amplo espectro do transportador de glutamato. TBOA, em seguida, faça a média de um número idêntico de varreduras obtidas com estimulações únicas em condições controle e em 10 micromolar de TBOA. Subtraia a trajetória média obtida com estimulações únicas da trajetória média obtida com estimulações pareadas. Este passo permite isolar o STO geométrico e a corrente sustentada de potássio evocada pelo segundo estímulo.No próximo deslocamento, subtraia do traço médio obtido com estimulações únicas por um intervalo de tempo que corresponde ao intervalo PUL usado para entregar pulsos emparelhados, o tempo deslocado, a resposta média obtida com estimulações únicas da resposta média ao segundo estímulo obtida anteriormente. Este passo isola uma porção facilitada da corrente do transportador evocada pelo segundo estímulo. Na maioria dos casos, este passo remove completamente a corrente de potássio sustentada.Se este for o caso, o isolamento do FSTC está completo e você pode prosseguir com a análise de desconvolução e obter o curso temporal da remoção de glutamato pelos astrócitos. Em alguns casos, no entanto, uma pequena corrente sustentada de potássio ainda está presente e é necessária uma análise adicional. Meça a amplitude da corrente sustentada de potássio remanescente após a realização.A análise descrita anteriormente ajusta a amplitude da função monoexponencial à amplitude da corrente residual sustentada de potássio, definindo a amplitude da corrente sustentada de potássio medida como a nesta equação. No entanto, a constante de tempo de ascensão representa o valor médio da ascensão estimado em experimentos separados nos quais uma corrente sustentada de potássio é isolada. Farmacologicamente, utilizando uma concentração saturante elevada de TBOA, subtrai-se então a função monoexponencial resultante da FSTC e da corrente sustentada de potássio.Para concluir o isolamento do FSTC. Para isolar a ocorrência de transporte ativada por flash. Obtenha em média pelo menos 20 varreduras com o caminho óptico aberto em condições controle e em 10 micromolar de TBOA, em seguida, obtenha em média o mesmo número de varreduras com o caminho óptico fechado em condições controle e em 10 micromolar de TBOA; subtraia a trajetória média obtida com o caminho óptico bloqueado da trajetória média obtida com o caminho óptico aberto.Este passo permite remover o artefato do estímulo e isolar os FTCs. Neste passo, ajuste a corrente de transporte, seja FSTC ou FTC registrada em condições controle e em 10 micromolar de TBOA, utilizando uma função multiexponencial. Crie uma função que aumente instantaneamente e decaia monoexponencialmente de acordo com essa função e que melhor descreva a fase de decaimento da corrente do transportador registrada em 10 micromolar de TBOA. Em seguida, desdobre a função monoexponencial do ajuste da corrente do transportador registrada em 10 micromolar de TBOA para derivar o filtro. Depois, desdobre o filtro do ajuste da corrente do transportador em condições controle.Para obter uma estimativa quantitativa do curso temporal geral da eliminação de glutamato, calcule o OID da forma de onda enquanto realiza este procedimento. É importante confirmar que as ocorrências de transporte são registradas sob condições experimentais nas quais o filtro opera em um regime linear e introduz apenas distorções lineares do transporte. A forma da corrente a partir destes pode ser verificada mediante manipulações que alteram o tamanho da corrente de transporte.Não altere seu curso de carimbo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar gravações astrocíticas para extrair informações sobre glutamato, difusão e captação no cérebro.

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