Descelularização e recelularização pulmonar de primatas não humanos usando um biorreator especializado de órgãos grandes

O objetivo geral deste procedimento é isolar matrizes biológicas de órgãos inteiros dos pulmões de Reus Maccas e usar essas matrizes como andaimes para investigar aplicações de engenharia de tecidos pulmonares. Isso é feito primeiro descelularizando pulmões inteiros de Reuss Maca com detergentes, sais e enzimas. O segundo passo é instalar os andaimes pulmonares descelularizados em um biorreator capaz de ventilar as vias aéreas e perfundir a vasculatura pulmonar com meios de cultura de células líquidas.

Em seguida, os andaimes pulmonares são assentados com células-tronco pelas vias aéreas e células endoteliais pela vasculatura pulmonar. A etapa final é cultivar as células dentro do andaime pulmonar sob as condições de ventilação e perfusão fornecidas pelo biorreator pelo tempo desejado, seguido pela análise da morfologia celular e tecidual resultante. Em última análise, a reização de andaimes pulmonares de maca acelular com células-tronco e células endoteliais resulta em tecido projetado que imita as características anatômicas e histológicas dos tecidos pulmonares nativos.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos de engenharia de tecidos pulmonares, como se as células-tronco ou progenitoras podem ser usadas para regenerar o tecido pulmonar sozinhas ou em conjunto com células epiteliais e endoteliais pulmonares maduras. As implicações dessa técnica se estendem à terapia para doenças pulmonares em estágio terminal, pois a integração de matrizes pulmonares acelulares com células-tronco ou progenitoras derivadas de pacientes tem o potencial de aumentar o número de pulmões de doadores disponíveis para transplante pulmonar. Além disso, os pulmões resultantes projetados usando células-tronco do próprio paciente podem ser resistentes à rejeição imunológica.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando vimos um vídeo de Joe publicado anteriormente por membros do laboratório da Dra. Laura Nicholson na Universidade de Yale. Aqui apresentamos modificações de seu procedimento para roedores para atender às necessidades de nosso modelo Resus Meac de animais de grande porte. Deve-se tomar o máximo cuidado para evitar incidentes de exposição infecciosa ao trabalhar com tecidos de maca.

Antes de manusear tecidos de primatas não humanos, coloque equipamento de proteção individual, incluindo máscara cirúrgica, protetor facial, uma camada de luvas cirúrgicas, avental descartável e uma segunda camada de luvas cirúrgicas com os pulmões deitados em uma bandeja de dissecação, canule a artéria pulmonar usando um conector de isca fêmea com uma farpa de tamanho apropriado. Prenda a cânula no lugar com uma braçadeira esterilizada com álcool. Deslize uma braçadeira de plástico ao redor da traqueia.

Insira um conector de isca fêmea na abertura traqueal e aperte a braçadeira ao redor da farpa do conector para manter a traqueia no lugar ao redor da farpa. Remova o ar preso dos pulmões instilando solução salina tamponada com fosfato ou PBS contendo 30 unidades por mililitro de heparina e cinco microgramas por mililitro de nitroprensa de sódio lado. O SNP abreviado permite que a solução seja expelida por recuo natural antes de repetir.

Instalação mais duas vezes após a terceira instalação das vias aéreas com a solução PBS Heparin SNP. Tampe a cânula de isca traqueal com um tampão de isca. Corte o ápice do coração e irrigue os ventrículos internos com PBS Heparin SNP para remover o sangue residual lacerado ambos os átrios para facilitar a drenagem do circuito pulmonar após a perfusão.

Conecte uma seringa de 60 cc cheia de solução PBS Heparin SNP à cânula da artéria pulmonar e remova cuidadosamente o êmbolo para permitir que o líquido flua para a vasculatura. Remova o tampão da cânula traqueal e permita que o fluido nas vias aéreas seja expelido por recuo natural. Continue a perfusão até que o máximo de sangue possível seja removido da vasculatura pulmonar.

O aspecto mais difícil do procedimento é enxaguar e lavar efetivamente as vias aéreas pulmonares Com líquidos, o fluxo de líquido é inibido em relação aos gases, pois as vias aéreas não devem conduzir líquidos, o tempo e os pacientes são necessários para realizar essas etapas, aconselhamos continuar com o protocolo, apesar do líquido residual permanecer nas vias aéreas à medida que a descelularização progride e os detritos celulares são eliminados, a viscosidade do fluido permanecerá baixa e os pulmões serão capazes de expelir líquidos com eficiência no primeiro dia. Mergulhe o bloco coração-pulmão em água deionizada, infle e perfunda o pulmão com água deionizada usando seringas de 60 cc presas à cânula traqueal e arterial submersa, respectivamente. Repita efetivamente as lavagens das vias aéreas e vasculares com água deionizada.

Mais quatro vezes para um total de cinco enxágues de aproximadamente 0,5 a um litro cada após cinco lavagens, remova os pulmões da água e mergulhe o bloco na solução Triton. Infle e perfunda os pulmões com a solução Triton. Como antes, repita a instalação uma segunda vez e incube os órgãos submersos na solução Triton durante a noite a quatro graus Celsius.

Após uma incubação noturna, remova o bloco pulmonar da solução de Triton e lave externamente com água deionizada. Em seguida, submergiu o bloco em água fresca deionizada. Instilar a água deionizada na traqueia e na artéria pulmonar cinco vezes para lavar a solução de Triton e os detritos celulares.

Remova os pulmões da água deionizada e mergulhe em 2% de sódio desoxi coate ou solução SDC. Infle e perfunda com a solução SDC da mesma maneira. Mergulhe os pulmões em solução SDC durante a noite a quatro graus Celsius no terceiro dia.

Lave o tecido novamente com água deionizada externamente e através das vias aéreas e da vasculatura cinco vezes. Como antes, remova o tecido da água deionizada e mergulhe na solução de cloreto de sódio molar. Infle e perfunda com solução de cloreto de sódio como antes e mergulhe o tecido em solução de cloreto de sódio por uma hora em temperatura ambiente após lavar os pulmões com solução de cloreto de sódio com cinco enxágues de água deionizada.

Como antes, banhe-os em solução de DNA fresco e instile essa solução nas vias aéreas e na vasculatura. Incube os pulmões em solução de DNA por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, remova os pulmões da solução de DNA e lave externamente com solução de PBS.

Mergulhe os pulmões na solução de PBS e lave esta solução cinco vezes pelas vias aéreas e vasculatura. Como antes, armazene os pulmões em solução de PBS em um recipiente lacrado durante a noite a quatro graus Celsius no quarto dia. Lave os pulmões em solução fresca de PBS gelada cinco vezes através das vias aéreas e da vasculatura.

Em seguida, armazene-os em solução PBS em um recipiente selado estéril a quatro graus Celsius até o uso. Monte os componentes do biorreator sob uma capela de fluxo laminar de acordo com o esquema. No protocolo de texto, encha a câmara principal com meio de cultura que tenha sido equilibrado à atmosfera de 5% de CO2 de uma incubadora de cultura de células imediatamente antes do uso no biorreator, aplique os adaptadores de cânula traqueal e vascular na cânula pulmonar.

Instale os órgãos na câmara principal do biorreator banhando os pulmões no meio de cultura e conectando os adaptadores da cânula às portas apropriadas na tampa modificada. Uma vez conectado, fixe a tampa com firmeza e firmeza. A câmara não será aberta novamente durante a reação, aspirar o ar da tubulação usando as portas da seringa e uma seringa de 60 CCC equipada com uma agulha de calibre 18 movendo a direcionalidade das torneiras de parada de três vias para direcionar o fluxo de líquido para a seringa.

Mova as câmaras de biorreatores seladas conectadas de forma contígua com órgãos instalados para uma incubadora de cultura de tecidos para equilibrar temperatura e gás. Ventile os pulmões usando uma bomba de seringa conectada à câmara principal em aproximadamente uma respiração completa a cada dois minutos e perfunda a vasculatura através da bomba peristáltica a aproximadamente 10 mililitros por minuto Por um total de 30 minutos para assentos nas vias aéreas. Infle os pulmões com a suspensão celular injetando suavemente através da porta da seringa conectada à torneira de parada de três vias no circuito respiratório.

Mantenha os pulmões estaticamente a 37 graus Celsius, 5% de CO2 durante a noite, sem vias aéreas ou perfusão vascular para permitir que as células se liguem à matriz pulmonar descelularizada. Após a incubação durante a noite, reinicie o programa padrão de ventilação das vias aéreas e a cultura dos órgãos por três a sete dias para o assentamento vascular. A direcionalidade do caminho do fluxo pode ser alterada da câmara principal para um reservatório de assento endotelial girando a válvula na torneira de parada posicionada na tubulação que conecta esses dois compartimentos semeiam as células endoteliais gradualmente usando a bomba peristáltica enquanto agita suavemente usando a agitação magnética quando a semeadura estiver completa.

Perfusão de pisada e incubação estática por aproximadamente quatro a seis horas. Reinicie a perfusão vascular com meio de câmara principal a uma taxa de aproximadamente 10 mililitros por minuto. Cultura por três a sete dias com perfusão vascular contínua concomitantemente ao período de cultura de ventilação das vias aéreas.

Ao longo do processo de descelularização, os pulmões MCCA apresentaram clareamento progressivo culminando em uma aparência translúcida no final do processo. No entanto, os pulmões mantiveram suas características anatômicas macroscópicas e permaneceram em grande parte elásticos e capazes de produzir recuo natural após a inflação com líquido. No nível microscópico.

A ultraestrutura histológica permaneceu intacta após a descelularização. Ou seja, brônquios respiratórios, brônquios, sacos alveolares. Os vasos sanguíneos e capilares ainda eram distinguíveis claramente pela microscopia de baixa potência.

A microanatomia histológica, no entanto, demonstrou que, embora a anatomia macroscópica e a ultraestrutura do pulmão fossem levemente perturbadas pela descelularização, o tecido carecia completamente de células intactas, como visto aqui. Apenas vestígios de DNA permaneceram nos tecidos descelularizados. Além disso, o DNA traço, que foi concentrado por precipitação de álcool e visualizado em um gel de 0,8% AROS, era composto principalmente por fragmentos degradados de baixo peso molecular.

A eficiência da remoção de proteínas celulares foi avaliada por análises de western blot de proteínas pulmonares nativas e descelularizadas. Lisados usando um anticorpo para beta actina, beta actina foi facilmente detectado em lisados pulmonares nativos, mas não em lisados pulmonares descelularizados, sugerindo que a descelularização esgotou drasticamente as células e removeu o material proteico associado às células 14 dias após a semeadura das vias aéreas com células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea de maca ou BMCs e cultura de biorreator com aproximadamente um ciclo de expiração de inspiração a cada dois minutos. O parênquima dos pulmões da maca descelularizada foi efetivamente ampliado.

Os BMCs revestiram os septos alveolares, mantendo um lúmen alveolar claro e aberto. A matriz desnudada de grandes vias aéreas também foi izada por BMCs usando o biorreator, a superfície luminal de um brônquio do tronco principal foi revestida com uma monocamada de BMCs escamosos após 14 dias de cultivo. No biorreator mostrado aqui está um lobo pulmonar reus descelularizado cinco dias após a semeadura da vasculatura com células endoteliais microvasculares e fornecendo perfusão vascular constante com meio de cultura endotelial a cinco mililitros por minuto.

A análise histológica revelou células que revestem a pequena vasculatura no parênquima pulmonar. Em alguns casos, as células pareciam estar ligadas à matriz por meio de várias projeções celulares através do lúmen, enquanto outras seções transversais dos vasos mostravam células revestindo a superfície endotelial com lúmen claro. Seguindo este procedimento.

Outros métodos, como imuno-histoquímica, western blot e PCR quantitativo em tempo real, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se as células-tronco semeadas se diferenciam em células de linhagem pulmonar uma vez cultivadas na matriz pulmonar acelular ou com células epiteliais e endoteliais maduras dentro do biorreator. Depois de assistir a este vídeo, devemos ter uma boa compreensão de como descelularizar pulmões de primatas não humanos e, posteriormente, usar os pulmões acelulares resultantes como andaimes para a cultura de células-tronco, células epiteliais e células endoteliais em um sistema de biorreator. Não se esqueça de que trabalhar com tecidos de primatas não humanos pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de equipamento de proteção individual completo, incluindo um protetor facial e uma camada dupla de látex ou nitrilo Luvas devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.