Caracterização dos receptores acoplados à proteína por uma mobilização de cálcio Ensaio baseado em fluorescência

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar ligantes funcionalmente ativadores de receptores acoplados à proteína G órfãos ou G PCRs. Isso é obtido por transecção transitória, A-G-P-C-R de interesse e transecção cot uma construção G alfa 16 promíscua em um sistema de expressão celular para obter expressão heteróloga temporária de ambas as proteínas. Como segunda etapa, as células transfectadas são carregadas com o corante sensível ao cálcio flu oh four, que detecta a liberação de cálcio dos estoques intracelulares por meio de um aumento no sinal fluorescente após a interação do cálcio.

Em seguida, o ensaio de mobilização de cálcio baseado em fluorescência é realizado desafiando o receptor expresso heterólogo com uma biblioteca composta de ligantes candidatos para determinar compostos que ativam o receptor e provocam uma cascata de sinalização intracelular resultando na liberação de cálcio do retículo endoplasmático, que pode ser medido como um sinal fluorescente. São obtidos resultados que mostram uma curva de resposta de concentração com a metade da concentração efetiva máxima de um ligante ativador, que se baseia na detecção de diferentes sinais fluorescentes dependendo das concentrações de ligantes administradas ao sistema de expressão celular. A principal vantagem de realizar transfecção transitória para obter expressão temporária de seu GPCR sobre o uso de linhagens celulares clonais estáveis é que não requer o estabelecimento demorado de tais linhagens celulares transfectadas de forma estável.

A transfecção da subunidade G alfa 16 promíscua pode redirecionar a via de sinalização intracelular da maioria dos GPCRs para a liberação de cálcio, independentemente da via de sinalização nativa em ambientes endógenos. Como tal, esta configuração permite a triagem de rendimento médio de centenas de compostos em GPCRs de interesse em um curto espaço de tempo, demonstrando que o procedimento será gás amarelo, um estudante de doutorado e Nick Su, um técnico de nosso laboratório Cultive as células T HEK 2 93 em frascos T 75 três dias antes do ensaio real de mobilização de cálcio, passagem das células quando uma confluência de 80% é atingida. Preparar um balão T 75 para a transfecção com a construção do receptor e outro para a transfecção com um vector de expressão vazio como controlo negativo.

Incube os frascos a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 por 20 a 24 horas até que as culturas de células se aproximem de 50 a 70% de confluência, conforme mostrado aqui. Em seguida, adicione 3,9 microgramas da construção do receptor ou vetor vazio e 3,9 microgramas da construção de expressão G alfa 16 a um tubo de microfuga de 1,5 mililitro. Adicione 500 microlitros do tampão de escorva do jato.

Misture bem por vórtice do tubo seguido de uma rotação curta. Em seguida, adicione 37,5 microlitros do vórtice do reagente primário do jato e gire para baixo por um minuto na velocidade máxima. Incube a mistura de transfecção por 10 minutos.

À temperatura ambiente, rotular uma população de células como transfectada com o vetor de expressão, codificando o GPCR de interesse e a construção G alfa 16 e o segundo frasco com o vetor vazio e a construção G alfa 16. Após a incubação, adicione a mistura de transfecção gota a gota ao meio de cultura de células, certificando-se de pipetar diretamente no meio e evitar o contato com as paredes do frasco de cultura. Incubar os frascos a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 por 20 a 24 horas para o ensaio de mobilização de cálcio.

As células transfectadas são coletadas e semeadas em 96. Placas inferiores claras com paredes bem pretas. Primeiro cubra as placas com 60 microlitros por poço de temperatura ambiente.

Solução salina tamponada com fosfato com fibronectina. Incube as placas em temperatura ambiente por uma hora com a tampa colocada. Retire a solução dos poços e incube novamente as placas durante uma hora sem tampa à temperatura ambiente.

Enquanto isso, retire o meio de crescimento antigo das células. Enxágue as células mortas com três mililitros de PBS e remova o PBS. Em seguida, adicione três mililitros de PBS à temperatura ambiente tentando incubar EDTA por um minuto antes de remover a solução.

Neste ponto, a morfologia das células muda de forma de estrela para forma de esfera. Solte as células do fundo do frasco batendo suavemente e colete-as enxaguando várias vezes com 10 mililitros de temperatura ambiente. DM em meio de transferência.

Transfira as células para um tubo de falcão de 50 mililitros. Para contar o número de células por mililitro, adicione 100 microlitros da cultura de células a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de lise e misture batendo no tubo.

Por fim, adicione 100 microlitros de tampão estabilizador e misture batendo. Encha um de núcleo com a suspensão de células e conte as células com o contador. O software nucleo view multiplica automaticamente o número de células por três, pois as células foram diluídas por um fator de três.

Ao adicionar a lise e o tampão estabilizador, dilua as células até uma concentração final de 600.000 células por mililitro e semeie 150 microlitros das células por poço nas placas revestidas. Para obter uma densidade celular de cerca de 90.000 células por poço, evite bolhas de ar e bata na placa para espalhar as células uniformemente. Para obter uma camada de células contíguas, incube as placas a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 por 16 a 24 horas.

Descarte o meio das células. Lave as células com 200 microlitros de PBS por poço e remova o PBS. Observe que todas as etapas a seguir que envolvem operações com as células devem ser realizadas no escuro, pois a partir deste ponto, as células serão carregadas com o fluoro quatro.

Adicione 55 microlitros de tampão de carregamento por poço, embrulhe a placa em papel alumínio para evitar a exposição da placa à luz e incube por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, use tampão de lavagem para solubilizar os peptídeos secos em tubos de microcentrífuga siliconizados de 1,5 mililitro. Preparar uma série de diluições para efectuar uma análise concentração-resposta e determinar o valor EC 50 de um ligante.

Lembre-se de que 50 microlitros de um ligante da placa composta serão transferidos para um poço com 100 microlitros de tampão de lavagem na placa celular durante o ensaio, portanto, prepare os compostos em três vezes a concentração final desejada. Em seguida, adicione 70 microlitros do ligante no poço correspondente da placa composta em triplicata. Inclua controles positivos e negativos em cada placa.

Descarte o buffer de carregamento da placa celular e adicione 100 microlitros de buffer de lavagem a cada poço, evitando a exposição à luz. Incube a placa por 15 minutos em temperatura ambiente. Descarte o tampão de lavagem da placa celular e adicione 100 microlitros de novo tampão de lavagem a cada um.

Bem, incube a placa celular, a placa composta e um suporte de gorjetas por 15 minutos. A 37 graus Celsius, crie e carregue o protocolo desejado file com o software e ative a unidade de controle de temperatura para a câmara de leitura aqui. As respostas de cálcio são medidas a 37 graus Celsius por dois minutos, uma linha de cada vez, com um intervalo de 1,52 segundo entre leituras sucessivas a 525 nanômetros.

Defina a excitação da gripe oh quatro para 488 nanômetros e transfira um volume total de 50 microlitros de composto para a placa celular. 18 segundos após a leitura. Comece com a velocidade de dispensação definida para 26 microlitros por segundo e uma altura de pipeta de 135 microlitros.

Posicione o composto e a placa de célula e o suporte de pontas nas gavetas apropriadas do dispositivo da estação. Execute uma única leitura da placa celular no mesmo comprimento de onda de excitação e emissão no modo endpoint antes de iniciar a tela real no modo flex. Inicie o ensaio e prossiga para analisar os dados usando o software descrito.

Aqui estão os gráficos correspondentes a uma das três réplicas da série de concentração NPF curta doofus. O controle negativo não induziu sinal fluorescente. Enquanto o controle positivo provocou forte ativação da protease endógena ativou o receptor, levando a um alto sinal fluorescente.

O software permite a introdução de fórmulas para determinar a percentagem de ativação ou os erros padrão das diferentes concentrações, entre outros. Os dados resultantes são usados para compor curvas preliminares de resposta à concentração para estimar os valores de EC 50 mostrados para os quatro peptídeos NPF curtos do esôfago. As curvas também incluem os dados para o controle negativo, onde as séries de concentrações dos peptídeos NPF curtos da drosófila foram testadas em células transfectadas com um vetor vazio.

Os resultados indicam que a adição dos peptídeos a essas células não tem efeito sobre os receptores endógenos, mas sim ativa o receptor de interesse. Curvas preliminares de concentração-resposta do ensaio de mobilização de cálcio baseado em fluorescência foram realizadas e as concentrações testadas foram adaptadas para cobrir a faixa dinâmica da curva. Os valores EC 50 de drosophila short npf 1, 2, 3 e quatro são semelhantes, indicando que eles são igualmente potentes para ativar o receptor após este procedimento.

Outros métodos, como atividade estrutural, estudos de relacionamento podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais aminoácidos do peptídeo são cruciais para a ativação do receptor. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma mobilização de cálcio baseada no sentido fluer como uma identificação de ligantes funcionalmente ativadores de receptores acoplados à proteína G. Isso inclui a manutenção dos sistemas de expressão solar seguida pela transfecção transgênero do sistema celular pelo receptor de interesse.

Após a mobilização rígida de cálcio, o ensaio pode ocorrer.