Name: Um método eficiente para Quantitativa, Análise de células Único de cromatina Modificação e Arquitetura Nuclear em Todo-mount óvulos em Arabidopsis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprenda imunomarcação e FISH em óvulos de Arabidopsis thaliana para análise de modificações de cromatina e arquitetura nuclear. Este método permite imagem confocal de alta resolução e quantificação em nível de célula única.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Ueli Grossniklaus (Universidade de Zurique) pelo apoio técnico e financeiro. Agradecemos a Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolaños e Peter Kopf pelo apoio geral do laboratório. Esta pesquisa foi financiada pela Universidade de Zurique, bolsas da Fundação Nacional Suíça para CB (31003A_130722) e Ueli Grossniklaus (31003A_141245 e 31003AB-126006), e da Agence Nationale de la Recherche para DG (Programa ANR-BLANC-2012).

O procedimento é descrito no fluxo de trabalho na Figura 1, e a configuração para a dissecção e a incorporação de tecidos são apresentados na Figura 2. 1. Fixação do tecido <ol><li> Recolher 20-30 carpelos em um tubo de microcentrífuga contendo feita recentemente tampão fixador BVO em gelo. </li><li> Fixar o tecido 30 min com agitação suave à temperatura ambiente. </li><li> Girar os tubos contendo as carpelos em fixador em uma microcentrífuga de bancada 1 min a 400 x g. </li><li> Retire cuidadosamente o tampão fixador e adicionar 1 ml de PBT, colocar os tubos no gelo. </li></ol> 2. Dissection and Embedding <ol><li> Preparar cinco tubos de Eppendorf com 200 ul de cada uma feita recentemente, 5% de mistura de acrilamida. </li><li> Prepare cinco lâminas Superfrost pré-limpos com etanol 70% e marcadas com um lápis. </li><li> Descongelar uma alíquota de 20% de EPA e 20% NaPS cada, em gelo. </li><li> Toma 4-5 carpelos com uma ponta de corte-end, lugarlos numa lâmina de limpeza, remover o excesso de líquido. </li><li> Faça cortes longitudinais com uma agulha fina e retire as paredes carpelo para liberar fileiras de óvulos como mostra a Figura 2, evitar a secagem cobrindo com PBS (não mais de 10 mL). </li><li> Adicione rapidamente e misturar 12 ml, 12 NaPS APS ul com uma alíquota de 200 mL da mistura de acrilamida. </li><li> Adicionar 30 ul da acrilamida activado para os óvulos dissecados. </li><li> Cubra com uma lamela mm 20 x 20, vamos polimerização à temperatura ambiente, 45-60 min. </li><li> Retirar as lamelas usando uma lâmina de barbear. Nesta fase, as amostras podem ser mantidas durante a noite a 4 ° C num frasco Coplin contendo PBS. </li></ol> 3. Processamento de Tecidos NOTA: Todas as etapas, exceto 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 e 3.4.3 são realizadas em frascos Coplin com 80 ml da solução sob o capô química à temperatura ambiente. Slides são transferidos com um de ponta plana fórceps. <ol><li> Clarificação tecido efixação: <ol><li> Incubar 5 min em metanol. </li><li> Incubar 5 min em etanol. </li><li> Incubar 30 minutos em etanol: xileno (1:1). </li><li> Incubar 5 min em etanol. </li><li> Incubar 5 min em metanol. </li><li> Incubar 15 minutos em metanol e PBT (1:1), complementado com 2,5% de formaldeído. </li><li> Lavar 2 x 10 minutos em PBT. Neste estágio, os slides podem ser mantidas durante a noite a 4 ° C. </li></ol></li><li> Digestão da parede celular: <ol><li> Descongelar uma aliquota da mistura de digestão da parede celular em gelo. </li><li> Tome um slide da jarra de Coplin, drenar o excesso de líquido, colocando-o verticalmente sobre uma toalha de papel. </li><li> Adicione 100 ml de mistura de digestão da parede celular sobre a almofada de acrilamida e cobrir com uma lamela mm 23 x 46. Repita o procedimento para os demais slides. Incubar durante 2 horas a 37 ° C numa câmara húmida (descrito em Materiais). </li><li> Lavar as lâminas 2 x 5 minutos em PBT. </li></ol></li><li> RNase A de tratamento: <ol><li> Tome um slide da jarra de Coplin, escorra ªe o excesso de líquido, como antes. </li><li> Incubar cada lâmina com 100 ul de ARNase A a 100 ng / mL em PBS com 1% de Tween-20 durante 1 hora a 37 ° C numa câmara húmida. </li><li> Lavar as lâminas durante 2 x 5 minutos em PBT. </li></ol></li><li> Pós-fixação e permeabilização: <ol><li> Post-correção para 20 min no recentemente feito PBT-F. </li><li> Lavar as lâminas por 10 minutos em PBT. </li><li> Permeabilizar durante 2 horas em PBS com 2% de Tween-20 a 4 ° C. </li><li> Lavar as lâminas por 2 x 5 minutos em PBT. </li></ol></li></ol> 4. Imunocoloração NOTA: Para este passo, a concentração óptima do anticorpo primário tem de ser testada por meio de diferentes diluições (1:200, 1:500, 1:1000) dos anticorpos. <ol><li> Incubar cada lâmina com 100 uL de anticorpo primário diluído em PBS com 0,2% de Tween-20 durante 12-24 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar as lâminas em PBT durante 2-4 horas à temperatura ambiente, sob agitação suave. </li><li> Aplique o1:200 de anticorpo secundário em PBS + 0,2% de Tween-20 durante 24 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar as lâminas em PBT durante uma hora à temperatura ambiente, sob agitação suave. </li><li> Contracoloração com 10 ug / ml de iodeto de propidio em PBS durante 15 minutos, depois enxaguar 15 min em PBS, sob agitação suave, à temperatura ambiente. </li><li> Monte em anti-desbotamento montagem líquido suplementado com 10 mg / ml de iodeto de propídio. Deixe o meio de montagem endurecer por 1 hora antes de adquirir imagens por CLSM. </li></ol> 5. Imagens quantitativas <ol><li> A aquisição de imagens: <ol><li> Adquirir imagens de alta resolução usando CLSM, o ideal é usar um modo de digitalização de ressonância, o que permite uma melhor preservação dos sinais fluorescentes sobre imagem prolongada 23, e uma lente de imersão 63X de glicerol. </li><li> Teste os parâmetros de aquisição, como a intensidade do laser, o ganho, pinhole, tamanho voxel e fator de zoom no início do experimento para definir um procedimento de aquisição padrão a seguir rigorosamente todotodos os slides para medições quantitativas consistentes. </li><li> Determinar a ausência de cross-talk entre fluorocromos. Se estiver presente, configurar uma verificação seqüencial. Adquirir imagens de transmissão separadamente e não simultaneamente. </li><li> Realize serial, aquisição de imagem tridimensional com resolução mais alta possível nos dimensões X e Y e com oversampling 2x na dimensão z (regra de Nyquist). </li></ol></li><li> Processamento de imagem: <ol><li> Reconstruir imagens de série em três dimensões usando o software de fonte comercial ou aberto. </li><li> Definir superfícies de contorno ao redor de cada núcleo (ou célula) de interesse em 3D. </li><li> Quantificar a fluorescência em cada canal, como a soma da intensidade dos pixels de cada objecto. </li><li> Exportar os dados para o Excel para análises estatísticas. Normalizar sinais de anticorpos contra os sinais de coloração, por exemplo DNA. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaheshwari%2C+P+%22An+introduction+to+the+embryology+of+angiosperms%22">An introduction to the embryology of angiosperms</a>. , McGraw-Hill. New York. (1950).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development.</a> PLoS Biol. 9 (9), (2011).</li>
<li>Schmidt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes%3A+laser-assisted+microdissection+and+RNA+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing.</a> PLoS One. 7 (1), (2012).</li>
<li>Wuest, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+female+gametophyte+gene+expression+map+reveals+similarities+between+plant+and+animal+gametes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes.</a> Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).</li>
<li>Koornneef, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+tools+for+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana.</a> Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).</li>
<li>Oliver, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+histone+H3+modifications+is+species-specific+in+plant+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis.</a> Planta. 238 (1), 23-33 (2013).</li>
<li>Ravi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis-specific+loading+of+the+centromere-specific+histone+CENH3+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Genet. 7 (6), (2011).</li>
<li>Borges, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+the+epigenome+in+Arabidopsis+pollen%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming the epigenome in Arabidopsis pollen.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 77, 1-5 (2012).</li>
<li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+alterations+during+pollen+development+in+Hordeum+vulgare%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare.</a> Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).</li>
<li>Schoft, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+RNA-directed+DNA+methylation+upon+decondensation+of+constitutive+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin.</a> EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).</li>
<li>Barrell, P. J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+of+whole+ovules+for+analysis+of+reproductive+development%3A+the+elongate1+mutant+affects+meiosis+II%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II.</a> Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).</li>
<li>Braselton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feulgen+staining+of+intact+plant+tissues+for+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy.</a> Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).</li>
<li>Scott, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parent-of-origin+effects+on+seed+development+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 125, 3329-3341 (1998).</li>
<li>Armstrong, S. J., Jones, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+meiosis+in+wild-type+Arabidopsis+thaliana+and+in+two+meiotic+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Sex+Plant+Reprod%22%5BJournal%5D)">Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants.</a> Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).</li>
<li>Grimanelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochronic+expression+of+sexual+reproductive+programs+during+apomictic+development+in+Tripsacum%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum.</a> Genetics. 165, 1521-1531 (2003).</li>
<li>Gutierrez-Marcos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+gametophytic+baseless1+is+required+for+development+of+the+central+cell+and+early+endosperm+patterning+in+maize+%28Zea+mays%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays).</a> Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).</li>
<li>Niedojadło, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+RNA+of+Hyacinthus+orientalis+L.+female+gametophyte+cells+before+and+after+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization.</a> Planta. 236, 171-184 (2012).</li>
<li>Williams, J. H., Friedman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four-celled+female+gametophyte+of+Illicium+%28Illiciaceae%3B+Austrobaileyales%29%3A+Implications+for+understanding+the+origin+and+early+evolution+of+monocots%2C+eumagnoliids%2C+and+eudicots%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots.</a> Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).</li>
<li>Bass, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+cluster+de+novo+before+the+initiation+of+synapsis%3A+a+three-dimensional+spatial+analysis+of+telomere+positions+before+and+during+meiotic+prophase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase.</a> J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).</li>
<li>Howe, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+acrylamide+fluorescence+in+situ+hybridization+for+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells.</a> Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).</li>
<li>She, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+reprogramming+during+the+somatic-to-reproductive+cell+fate+transition+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants.</a> Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).</li>
<li>Pillot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+and+endosperm+inherit+distinct+chromatin+and+transcriptional+states+from+the+female+gametes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).</li>
<li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRT+letter%3A+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching.</a> Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li>
<li>Autran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+epigenetic+pathways+control+parental+contributions+to+Arabidopsis+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis.</a> Cell. 145 (5), 707-719 (2011).</li>
<li>Fransz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).</li>
<li>Cox, W. G., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+DNA+hybridization+probe+preparation+using+amine+modification+and+reactive+dye+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling.</a> BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).</li>
<li>Lysak, M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLysak%2C+M+%22Cytogenetic+analyses+of+Arabidopsis+In+Arabidopsis+Protocols%3A+Methods+in+Molecular+Biology%2C+2nd+ed%22">Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed</a>. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 173-186 (2006).</li>
<li>Chieco, P., Derenzini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Feulgen+reaction+75+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Feulgen reaction 75 years on.</a> Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+staining+for+fluorescence+and+laser+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy.</a> J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Bauwens, S., Oostveldt, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+of+repetitive+DNA+sequences+on+interphase+nuclei+of+the+small+cruciferous+plant+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Procedures+for+In+Situ+Hybridization+to+Chromosomes%2C+Cells%2C+and+Tissue+Sections.+Nonradioactive+in+situ+hybridization+application+manual%22%5BJournal%5D)">Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana.</a> Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Em plantas com flores, a linhagem reprodutor feminino é cercado por várias camadas de células, incluindo o nucelo e os tegumentos óvulo, tornando assim a coloração citológica em toda montagem tecnicamente desafiador. Aqui apresentamos um protocolo eficiente que permite a preparação e processamento de um grande número de óvulos adequados para a coloração citológica como imunomarcação, a coloração do DNA e hibridização fluorescente in situ no todo-mount. Foi utilizado com sucesso para a análise da linhag...

Em plantas com flores, o estabelecimento de linhagens de reprodução inicia-se com a diferenciação de células musculares lisas, MMC feminino e célula-mãe microspore masculino. A MMC desenvolve a partir de uma célula nucelar sub-epidérmica na ponta distal do primórdio óvulo, e a célula mãe micrósporos se desenvolve a partir de tecido esporogênico na antera lóculo, que estão localizados no fundo dos órgãos florais 1. SMCs sofrer meiose para produzir esporos haplóides, que depois dão origem aos gametófitos sobre mitose. O gametófito feminino ou saco embrionário, consiste de uma célula-ovo, uma célula central, dois sinérgides e três antípodas. O gametófito masculino, ou o pólen, é composto de uma célula vegetativa e duas células espermáticas. Enquanto o gametófito masculino continua a ser um objeto de estudo-de-relativamente acessível, o gametófito feminino é incorporado dentro do óvulo, por sua vez incluído no carpelo flor, e, assim, coloca desafios específicos para análises moleculares e citológicas. Recentemente, no entanto, de laser assistidamicrodissection ofereceu uma solução elegante que permite análises transcriptomic no MMC e células gametófitos femininos 2-4. Em adição à expressão do gene candidato analisa, por exemplo, utilizando ARN de hibridação in situ ou ensaios de gene repórter, análises citológicas permite investigar a dinâmica de componentes celulares endógenas utilizando coloração celular directa específica ou imunocoloração indirecta. Particularmente, coloração citogenética utilizando FISH e coloração do DNA, juntamente com imunocoloração de modificações da cromatina ou componentes de cromatina são abordagens centrais para elucidar a dinâmica da cromatina e organização nuclear em Arabidopsis 5. Normalmente, a meiose implica dinâmica cromossômicas específicas que tem sido bem investigados em planta macho meiócitos 6,7; ainda em grande escala, específico de célula cromatina reorganização, provavelmente refletindo a reprogramação epigenética dinâmica foi descrito durante o desenvolvimento do pólen 8-10. Por outro lado, devidoà relativa inacessibilidade do meiocyte fêmea e gametófito, estas investigações continuam tecnicamente difíceis de aplicar, e exigem muitas vezes a dissecção de corte ou manual e digestão enzimática (ver abaixo). Além disso, o prevalente falta de clareza óptica em todo o monte é um obstáculo para imagens de alta resolução de células reprodutivas em óvulos intactas. Um método clássico para a análise citológica da organização cromossômica em óvulos inteiros de montagem usa coloração de Feulgen 11-13. Trata-se hidrólise ácida (utilizando um ácido hipocloroso) do ADN o que resulta em desnaturação das proteínas e, assim, causa a destruição da estrutura da cromatina. Alternativamente, organização cromossomo em meiócitos femininos e células gametófitos podem ser observados por meio da coloração DAPI e imunocoloração em seções semi-finas ou sacos de embriões dissecados e MMC (por exemplo ver 14-18). Claramente, no entanto, a dissecção manual e corte pode ser de trabalho intensivo eimpede a análise qualitativa e quantitativa de um grande número de epítopos de cromatina. Aqui nós fornecemos um protocolo eficiente para preparar um grande número de óvulos Arabidopsis adequados para uma variedade de coloração citológica jusante em todo-mount. Em breve, botões de flores são incubadas numa solução fixadora, linhas de óvulos são dissecados do carpelo e incorporado em acrilamida na corrediça, como feito para meiócitos pólen 19,20. Os óvulos são incorporados mais afastada e fixadas em metanol, etanol, e xileno, antes da digestão da parede celular e permeabilização. São discutidas possíveis variações destes passos. As amostras podem em seguida ser utilizado para a coloração de ADN, a imunocoloração, e FISH. O modo de preparação é eficiente e permite a paralela conjunto experimental (até 16 lâminas pode ser preparado de um dia para análise a jusante diferente). Os tratamentos descritos permitem sinais homogêneas em todo-mount e bem preservado histológico, celular,e organização nuclear em células reprodutivas e células nucelares vizinhas que beneficiam comparações qualitativas e quantitativas entre os tipos de células. Calibrado, imagens de alta resolução baseado em CLSM seguido de reconstrução em 3 dimensões permite medições quantitativas significativas de sinais fluorescentes. Temos utilizado com sucesso este procedimento para analisar a dinâmica da cromatina no MMC diferenciando 21 e desenvolvendo gametófito feminino 22; Apresentamos aqui resultados representativos de análise heterochromatin, immunostaining cromatina, GFP imunocoloração e peixes em todo-montagem óvulos. Além disso, acreditamos que o nosso protocolo irá ser adequado para outros tecidos e espécies vegetais.

<table><tbody><tr><td>Soluções</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampão de fixação BVO (à base de32)</td><td></td><td></td><td>2 mM EGTA, pH 7,5, 1% (v/v) formaldeído, 10% DMSO, 1x PBS, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>PBT-F</td><td></td><td></td><td>1x PBT, 2,5% (v/v) formaldeído</td></tr><tr><td>30% acrilamida:bisacrilamida</td><td></td><td></td><td>3 g de acrilamida, 0,33 g de bisacrilamida, 1x PBS (prepare 10 ml, armazene a 4 &deg; C)</td></tr> <tr><td>200 ml de mistura de acrilamida a 5% em PBS</td><td></td><td></td><td>34 ml de acrilamida a 30%: bisacrilamida, 166 ml 1x PBS (fazer fresco a partir de 30% do estoque)</td></tr> <tr><td>20% de persulfato</td><td></td><td></td> de <td>amônio 0,2 g de persulfato de amônio, 1 ml de água estéril (prepare alíquotas com 1 ml e armazene a -20 &deg; C)</td></tr> <tr>sulfito <td></td><td></td><td>de sódio a 20%</td><td>0,2 g de sulfito de sódio, 1 ml de água estéril (prepare alíquotas com 1 ml e armazene a -20 & C)</td></tr> <tr>Mistura <td></td><td></td><td>enzimática da parede celular</td><td>0,5% (p / v) de celulase, 1% (p / v) de driselase, 0,5% (p / v) de pectolyase</td></tr><tr><td>Reagentes e materiais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amaresco</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Schaurlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Schaurlau</td><td>ME03062500</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>ROTH</td><td>4436.1</td><td></td></tr><tr><td>Celulase</td><td>Sigma</td><td>1794</td><td></td></tr><tr><td>Driselase</td><td>Sigma</td><td>D8037</td><td></td></tr><tr><td>pectolyase</td><td>Sigma</td><td>P5936</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck</td><td>8.22184.0500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>acrilamida</td><td>Sigma</td><td>A-3553</td><td></td></tr><tr><td>bissacrilamida</td><td>Sigma</td><td>M2022</td><td></td></tr><tr><td>persulfato de amônio</td> tóxico <td>Sigma</td><td>A9164</td><td></td></tr><tr><td>Sulfito de sódio</td><td>Fluka</td><td>71988</td><td></td></tr><tr><td>Anti-trimetil-histona H3 (Lys4)</td><td>Upstate</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Anti-monometil-histona H3 (Lys27)</td><td>Upstate</td><td>07-448</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ~ cabra ~ anti ~ coelho (H + L)</td> <td>Sonda Molecular</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>ProlongGold</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>tóxico</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>RNAse tóxico A</td><td>Roche</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>Huber & CO</td><td>10.055</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>DUMONT BIOLOGY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Heidolph</td><td>543-12310-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Câmara</td><td></td><td></td> úmida <td>Uma caixa de plástico com toalha de papel úmida dentro, um suporte de plástico é colocado na caixa para apoiar as lâminas e manter as lâminas longe da água.</td></tr><tr><td>Slide Superfrost Plus</td><td>Thermo Fisher</td><td>J1800AMNZ</td><td>Menzel-Gl&auml; Kit de DNA de etiqueta de</td></tr> peixe <tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>F32947</td><td></td></tr><tr><td>GFP booster</td><td>Chromotek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um método eficiente para quantitativa, análise de células Único de cromatina modificação e arquitetura nuclear em todo-mount óvulos em<em&gt; arabidopsis</em

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

Em plantas com flores, a transição destino de células somáticas-to-reprodutiva é marcada pela especificação de células-mãe de esporos (PMEs) em órgãos florais da planta adulta. O SMC feminino (célula mãe de megásporo, MMC) diferencia no primórdio óvulo e sofre meiose. O megásporo haplóide selecionado então sofre mitose para formar o gametófito multicelular feminino, o que dará origem aos gametas, o óvulo ea célula central, juntamente com células acessórias. A acessibilidade limitada do MMC, meiocyte e gametófito feminino no interior do óvulo é tecnicamente desafiador para citológico e análises citogenéticas em nível de célula única. Particularmente, imunodetecção directa ou indirecta de epítopos celulares ou nucleares é prejudicada pela falta de penetração dos reagentes no interior da célula vegetal e de uma única célula de imagem é demised pela falta de claridade óptica em todo-montagem tecidos. Assim, desenvolvemos um método eficiente para analisar os nuclorganização orelha e modificação da cromatina em alta resolução de uma única célula em Todo-mount óvulos Arabidopsis incorporados. Ele baseia-se na incorporação de dissecção e óvulos fixos em uma fina camada de gel de acrilamida a uma lâmina de microscópio. Os óvulos embarcados são submetidos a tratamentos químicos e enzimáticos com o objetivo de melhorar a clareza do tecido e permeabilidade aos reagentes de positividade. Esses tratamentos preservar organização, DNA e proteínas epítopos celulares e cromatina. As amostras podem ser utilizadas para diferentes análises citológicas a jusante, incluindo a imunocoloração da cromatina, hibridação in situ fluorescente (FISH), e a coloração de ADN para análise de heterocromatina. Microscopia confocal a laser (CLSM) de imagem, com alta resolução, seguido de reconstrução 3D permite medições quantitativas na resolução de uma única célula.

Nós fornecemos um protocolo robusto para a preparação em grande escala e de processamento de óvulos Arabidopsis adequados para exames citológicos em todo-mount. Graças à incorporação, os óvulos manter uma estrutura 3-dimensional (Figura 3). Além disso, o processamento de tecidos, incluindo esclarecimento de imagem óptico permite estruturas subcelulares em alta resolução. Figura 4 mostra a coloração de DNA em todo primórdios óvulo de montagem onde heterochromatin aparece como br...

Nós fornecemos aqui um protocolo eficiente e confiável para a imunocoloração, hibridação in situ fluorescente, a coloração do DNA seguido de quantitativo, imagem de alta resolução em Arabidopsis thaliana óvulos inteiros de montagem. Este método foi utilizado com sucesso para analisar as modificações da cromatina e arquitectura nuclear.

Um método eficiente para Quantitativa, Análise de células Único de cromatina Modificação e Arquitetura Nuclear em Todo-mount óvulos em<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar vues de Arabidopsis para hibridização e imunomarcação em preparação de montagem inteira. Isso é realizado fixando primeiro botões florais frescos na solução fixadora. O segundo passo consiste em dissecar cuidadosamente e embutir os vues em placas miniatura de acrilamida diretamente em lâminas de microscopia.O próximo processamento do tecido permite a clareamento e permeação tecidual. O passo final consiste em incubação das amostras tratadas com uma solução de anticorpo para coloração imunológica ou com uma sonda marcada para hibridização fluorescente em duas dimensões. Em última análise, a imagem confocal de alta resolução seguida de reconstrução tridimensional permite a análise quantitativa em preparações inteiras ao nível de célula única.Este método foi inicialmente empregado para fornecer informações sobre a organização do CT na visualização, mas também pode ser aplicado para analisar outros compartimentos celulares em outros tecidos do mergulho e em outros organismos modelo. Em tubos microfuga preenchidos com tampão BBO recém-preparado e resfriado em gelo, coloque de 20 a 30 carpais por tubo e deixe os tubos agitarem suavemente à temperatura ambiente por meia hora. Em seguida, centrifugue os tubos por um minuto a 400 Gs. Então, aspire cuidadosamente os sobrenadantes, descarte-os e adicione um mililitro de PBT aos carpais. Coloque os tubos no gelo para cada tubo de carpais a ser montado.Prepare previamente em gelo. Cinco tubos contendo 200 microlitros. Uma mistura recém-preparada de acrilamida 5%.Cinco lâminas super frost limpas, etiquetadas com lápis, uma solução Eloqua de 20% de PS e uma solução Eloqua de 20% de NAPS a partir de um tubo de carpais. Pegue quatro ou cinco com a ponta cortada e coloque cada uma sobre uma lâmina. Remova o líquido em excesso pipetando cuidadosamente com agulhas finas.Realize cortes longitudinais nos carpais e remova as paredes carpais para liberar as fileiras de vues. Esta etapa exigirá prática. Evite que os vues sequem adicionando até 10 microlitros de PBS, seguido de transferência para um tubo de microcentrífuga contendo a mistura de acrilamida.Adicione rapidamente 12 microlitros de NAPS e 12 microlitros de uma PS. Misture bem a solução com pipetagem e adicione rapidamente 30 microlitros desta acrilamida ativada. Misture sobre uma lâmina com vues dissecados. Coloque suavemente uma pequena lamínula sobre a preparação e deixe a solução polimerizar à temperatura ambiente por cerca de uma hora.Prepare cada lâmina desta maneira posteriormente. Use uma lâmina de barbear para remover as lamínulas. As amostras podem ser armazenadas durante a noite a quatro graus Celsius em um frasco coplano com PBS ou podem ser processadas diretamente.Em geral, o processamento deve ser realizado em frascos coplan com 80 mililitros de solução e sob capela de exaustão. Inicie pela clarificação dos tecidos mediante incubação em uma série de soluções de metanol-etanol, uma solução de etanol-xilol na proporção de um para um, e novamente em etanol e depois em metanol.Cada banho dura cinco ou 30 minutos. Consulte o protocolo no texto. Em seguida, utilize uma solução de PBT com metanol na proporção de um para um e 2,5% de formaldeído por 15 minutos.Em seguida, lave o tecido em PBT duas vezes, durante 10 minutos por banho. Após isso, as lâminas podem ser armazenadas durante a noite a quatro graus Celsius, se necessário. A seguir, retire até seis lâminas do frasco e remova o líquido em excesso.Coloque-os sobre um papel-toalha e adicione rapidamente 100 microlitros de uma enzima digestiva de parede celular resfriada. Misture sobre as lâminas. Em seguida, cubra as lâminas com lamínulas grandes.Incube os lâminas por duas horas a 37 graus Celsius em uma câmara úmida. É importante otimizar a temperatura de digestão com CO para cada nova solução enzimática, pois esta etapa é crítica para uma coloração homogênea posteriormente. Lave os lâminas duas vezes com PBT durante cinco minutos por lavagem.Em seguida, drenar as lâminas e adicionar agora a cada lâmina 100 microlitros de RNAs A em PBS complementado com 1% de tween. Incubar as lâminas por uma hora a 37 graus Celsius em uma câmara úmida. Após a incubação, lavar as lâminas duas vezes com PBT como anteriormente e, então, fixar novamente o tecido incubando as lâminas em um banho de PBTF recém-preparado por 20 minutos. Remover o PBTF com uma lavagem em PBT por 10 minutos.Em seguida, prossiga com a permeabilização do tecido incubando as lâminas em PBS com 2% de tween por duas horas a quatro graus Celsius. Utilize duas lavagens em PBT, cada uma de cinco minutos, para remover a solução permeabilizante. Em seguida, prossiga com a imunomarcação.Inicie incubando as lâminas no anticorpo primário de interesse. Aplique alíquotas de 100 microlitros do anticorpo diluído em PBS e com 0,2% entre cada lâmina. Transfira as lâminas para uma câmara úmida e incube-as a quatro graus Celsius por 12 a 24 horas.Lave as lâminas em um banho de PBT por duas a quatro horas com agitação suave à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 100 microlitros de anticorpo secundário diluído na proporção de 1:200 em PBS com 0,2% entre 20 e incube as lâminas por 24 horas a quatro graus Celsius. Um banho de uma hora em PBT com agitação suave é suficiente para lavar as lâminas do anticorpo secundário não ligado.Em seguida, contra-estaine o DNA com uma solução de 10 microgramas por mililitro de iodeto de propídio em PBS. Deixe a coloração prosseguir por 15 minutos e, então, lave as lâminas com PBT usando agitação suave por 15 minutos à temperatura ambiente. Agora, monte as lâminas com um meio antidesvanecimento suplementado com 10 microgramas por mililitro de iodeto de propídio.Após deixar repousar por uma hora, realize a imagem dos lâminas em um microscópio confocal utilizando uma objetiva de imersão em glicerol de 63 x. Durante a aquisição de imagens, é fundamental manter as configurações de varredura idênticas entre as amostras para permitir a quantificação comparativa e utilizar um modo de detecção linear. Posteriormente, reconstrua as imagens em série em estruturas tridimensionais, segmente cada núcleo de interesse e utilize um software de processamento de imagens 3D para quantificar os sinais.Utilizando este protocolo robusto de preparação em larga escala, as preparações em montagem inteira manterão sua estrutura tridimensional. Estruturas subcelulares tornam-se visíveis com alto nível de detalhe, como no caso da cromatina. Ao corar o DNA, a heterocromatina aparece como focos brilhantes e bem definidos, sem a necessidade de aplicar deconvolução.Este protocolo permite a imunomarcação paralela com diversos anticorpos em uma única rodada. Por exemplo, o marcador permissivo associado à cromatina U, a lisina 4 trimetilada da histona H3, e o marcador associado à heterocromatina, a lisina 27 monometilada da histona H3, foram ambos detectados em um único experimento em lâminas replicadas distintas para analisar a dinâmica da cromatina. Outra técnica compatível é a hibridização fluorescente in situ ou FISH para o RNA ribossômico 45S.Repetições de DNA foram usadas para definir regiões de organização nuclear. A sonda foi diretamente marcada com Alexa 488 e o DNA foi contra-colorido para análise de ificação. É muito importante testar diferentes diluições do anticorpo e tempos de incubação para identificar as condições que fornecem um sinal robusto e homogêneo com o menor nível possível de contrição do anticorpo.Como este método alcança uma excelente preservação do tecido e permeação ideal para análise de única célula da organização da cromatina, ele abre caminho para cientistas na área de biologia celular vegetal ou epigenética vegetal investigarem a organização nuclear ou subcelular em nível de única célula e no contexto completo do organismo.

an-efficient-method-for-quantitative-single-cell-analysis-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós relatamos um método eficiente e simples para isolar os embriões em estágios iniciais de desenvolvimento...

Isolamento eficiente e rápida de embriões em início de carreira a partir de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sementes

Cromatina imunoprecipitação é uma técnica poderosa para a identificação de locais de Arabidopsis proteínas de ligação ao ADN in vivo. Este procedimento inclui a ligação cruzada da cromatina e fragmentação, imunoprecipitação com anticorpos selectivos contra a proteína de interesse, e análise de qPCR de DNA ligado. Nós descrevemos um ensaio ChIP simples otimizado para plantas de Arabidopsis.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina a identificação de Arabidopsis interações proteína-ADN<em&gt; In Vivo</em

Este protocolo descreve um método para observar a embriogênese em Arabidopsis através do apuramento ovule, seguido de inspeção de formação padrão de embrião sob um microscópio.

Um método para caracterizar a embriogênese em Arabidopsis

Este manuscrito descreve um in vitro ovule cultivo método que permite que a imagem latente da viver-pilha de Arabidopsis zigotos e embriões. Este método é utilizado para visualizar a dinâmica intracelular durante a polarização de zigoto e a especificação do destino de célula no desenvolvimento de embriões.

In Vitro Ovule cultivo para viver-pilha de imagem do zigoto polarização e padronização do embrião em Arabidopsis thaliana

Neste protocolo, descrevemos técnicas para a adequada dissecção da Arabidopsis flores e siliques, algumas técnicas básicas de compensação e selecionados coloração procedimentos para observações de toda a montagem de estruturas reprodutivas.

Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis

Nós demonstramos um método para determinar a fecundação bem sucedida ou falhada com base na morfologia nuclear do esperma na fertilização dobro de Arabidopsis usando um microscópio da epifluorescência.

Avaliação do estado de fertilização por rastreamento da morfologia nuclear de espermatozóides na adubação dupla de Arabidopsis

Este protocolo descreve a preparação de amostras intactas da camada de células do endosperma em sementes de Arabidopsis thaliana . O método requer apenas equipamentos de laboratório comuns, como agulha de injeção e pinça de precisão, e permite imagens fluorescentes de células vivas de alta resolução de células do endosperma em sementes em desenvolvimento e maduras.

Preparação de tecido intacto para análise microscópica da camada de células do endosperma em sementes de Arabidopsis em desenvolvimento e maduras

O movimento cromossômico durante a prófase meiótica é um fenômeno pouco compreendido que é fundamental para a formação de esporos. Este protocolo descreve um método para adquirir, analisar e quantificar os movimentos do centrômero durante a prófase meiótica em meiócitos masculinos de Arabidopsis thaliana .

Caracterização por imagem ao vivo dos movimentos do centrômero durante a prófase meiótica masculina em Arabidopsis thaliana

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho eficiente para microscopia de localização de molécula única em núcleos isolados de Arabidopsis, utilizando isolamento, fixação e marcagem otimizados para alcançar visualização confiável em nanoescala da cromatina e da RNA Polimerase II. Essa abordagem pode ser facilmente adaptada a outras proteínas associadas à cromatina ou modificações de histonas para imagens de alta resolução.

Um Protocolo Simplificado para Microscopia de Localização de Molécula Única em Núcleos de Arabidopsis

Esse protocolo de imunolocalização nos meiócitos machos do milho mantém a integridade tridimensional das células durante a meiose. Ele permite o rastreamento dinâmico da localização intracelular de até três anticorpos independentes em material preservado fixado com paraformaldeído, além do DAPI, que tinge o DNA.

Imunolocalização Tridimensional em Meiocitos de Milho

Esse processo utiliza microscopia confocal em conjunto com um núcleo e linha marcadora de cromatina marcados fluorescentemente em Arabidopsis thaliana para registrar simultaneamente a dinâmica do núcleo e da cromatina nas raízes de Arabidopsis e investigar mudanças nessas dinâmicas em resposta a sinais de desenvolvimento e ambientais.

Imagem quantitativa de células vivas da forma nuclear e dinâmica da cromatina durante o desenvolvimento e estresse ambiental na raiz de Arabidopsis thaliana

Aprenda imunomarcação e FISH em óvulos de Arabidopsis thaliana para análise de modificações de cromatina e arquitetura nuclear. Este método permite imagem confocal de alta resolução e quantificação em nível de célula única.

Um método eficiente para Quantitativa, Análise de células Único de cromatina Modificação e Arquitetura Nuclear em Todo-mount óvulos em Arabidopsis (Vídeo) | JoVE Journal

Um método eficiente para Quantitativa, Análise de células Único de cromatina Modificação e Arquitetura Nuclear em Todo-mount óvulos em

Explorar mais vídeos