Um método eficiente para Quantitativa, Análise de células Único de cromatina Modificação e Arquitetura Nuclear em Todo-mount óvulos em Arabidopsis

Nós fornecemos aqui um protocolo eficiente e confiável para a imunocoloração, hibridação in situ fluorescente, a coloração do DNA seguido de quantitativo, imagem de alta resolução em Arabidopsis thaliana óvulos inteiros de montagem. Este método foi utilizado com sucesso para analisar as modificações da cromatina e arquitectura nuclear.

O objetivo geral deste procedimento é preparar Arabidopsis Vues para hibridização de montagem inteira e imunocoloração. Isso é feito fixando primeiro os botões de flores frescas na solução fixadora. O segundo passo é dissecar e incorporar cuidadosamente os vues em almofadas de acrilamida em miniatura diretamente nas lâminas de microscopia.

Em seguida, o processamento de tecidos permite a clarificação e permeação do tecido. A etapa final é incubar as amostras tratadas com uma solução de anticorpos para imunocoloração ou uma sonda marcada para fluorescente em hibridização C dois. Em última análise, a imagem confocal de alta resolução seguida de reconstrução tridimensional permite a análise quantitativa em toda a montagem no nível de célula única.

Este método foi inicialmente empregado para fornecer informações sobre a organização da TC na visão, mas também pode ser aplicado para analisar outros compartimentos celulares em outros tecidos do mergulho e em outros organismos modelo Em tubos de microfuga cheios de tampão BBO recém-feito resfriado em gelo a 20 a 30 carpos por tubo, defina os tubos para balançar suavemente à temperatura ambiente por meia hora. Em seguida, gire os tubos por um minuto a 400 Gs.Em seguida, aspire cuidadosamente os sobrenadantes, descarte-os e adicione um mililitro de PBT aos carpos. Coloque os tubos no gelo para cada tubo de carpos a ser montado.

Preparei no gelo. Cinco tubos contendo 200 microlitros. Uma mistura de 5% de acrilamida recém-feita.

Cinco lâminas super frost limpas rotuladas com um lápis, um pensamento Eloqua de 20% a PS e um pensamento Eloqua de 20% NAPS de um tubo de carpos. Pegue quatro ou cinco com uma ponta cortada e coloque-os cada um em uma lâmina. Remova o excesso de líquido pipetando cuidadosamente com agulhas finas.

Faça cortes longitudinais nos carpos e retire as paredes do carpo para liberar as fileiras de vues. Esta etapa exigirá prática. Evite que os vues sequem adicionando até 10 microlitros de PBS e, em seguida, a um tubo de micro fuga contendo a mistura de acrilamida.

Adicione rapidamente 12 microlitros de NAPS e 12 microlitros de PS. Misture bem a solução com pipetagem e adicione rapidamente 30 microlitros desta acrilamida ativada. Misture em uma lâmina com vues dissecados. Coloque delicadamente uma pequena lamínula na preparação e deixe a solução polimerizar em temperatura ambiente por cerca de uma hora.

Prepare cada slide dessa maneira mais tarde. Use uma lâmina de barbear para lascar as lamínulas. As amostras podem ser armazenadas durante a noite a quatro graus Celsius em um frasco de coplan com PBS ou prosseguir diretamente com o processamento.

Geralmente o processamento deve ser realizado em potes de coplan com 80 mililitros de solução. E sob a hotte. Comece clareando os tecidos por meio da incubação em uma série de soluções de etanol de metanol, uma solução de xileno de etanol um-para-um e novamente em etanol e depois em metanol.

Cada banho dura cinco ou 30 minutos. Veja o protocolo de texto. Em seguida, use uma solução de PBT de metanol um para um com 2,5% de formaldeído por 15 minutos.

Em seguida, enxágue o tecido em PBT duas vezes por 10 minutos por banho. Depois disso, as lâminas podem ser armazenadas durante a noite a quatro graus Celsius, se necessário. Em seguida, retire até seis lâminas do frasco e escorra o excesso de líquido.

Coloque-os em um papel de seda e adicione rapidamente 100 microlitros de uma enzima de digestão da parede celular resfriada. Misture nas almofadas. Em seguida, cubra os slides com lamínulas grandes.

Incube as lâminas por duas horas a 37 graus Celsius em uma câmara úmida. É importante otimizar a temperatura de digestão de CO para cada nova solução enzimática, pois esta etapa é crítica para uma coloração homogênea posteriormente. Lavar as lâminas duas vezes com PBT durante cinco minutos por lavagem.

Em seguida, drene as lâminas agora para cada lâmina. Adicione 100 microlitros de RNAs A em PBS completados com 1% de interpolação e incube as lâminas por uma hora a 37 graus Celsius em uma câmara úmida após a incubação, lave as lâminas duas vezes com PBT como antes e, em seguida, fixe o tecido novamente incubando as lâminas em um banho de PBTF recém-feito por 20 minutos. Enxágue o PBTF com uma lavagem em PBT por 10 minutos.

Em seguida, prossiga para a permeação do tecido incubando as lâminas em PBS com 2% de interpolação por duas horas a quatro graus Celsius. Use duas lavagens em PBT cada uma de cinco minutos para remover a solução permeável. Em seguida, prossiga com a coloração imunológica.

Comece incubando as lâminas no anticorpo primário de interesse. Aplicar alíquotas de 100 microlitros do anticorpo diluído em PBS e com 0,2% entre cada lâmina. Transfira as lâminas para uma câmara úmida e incuba-as a quatro graus Celsius por 12 a 24 horas.

Lave as lâminas em um banho de PBT por duas a quatro horas com um balanço suave em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 100 microlitros de anticorpo secundário diluído um a 200 em PBS com 0,2%entre 20 e incube as lâminas por 24 horas a quatro graus Celsius. Um banho de uma hora em PBT com balanço suave é suficiente para lavar as lâminas de anticorpo secundário não ligado.

Em seguida, contracorar o ADN com uma solução de 10 microgramas por mililitro de iodeto de propídio em PBS. Deixe a coloração continuar por 15 minutos e, em seguida, lave as lâminas com PBT usando um balanço suave por 15 minutos em temperatura ambiente. Agora monte as lâminas com um meio anti-desbotamento suplementado com 10 microgramas por mililitro de iodeto de propídio.

Depois de deixar descansar por uma hora, faça a imagem das lâminas em um microscópio confocal usando uma lente de imersão de glicerol 63 x. Portanto, durante a aquisição de imagens, é fundamental manter as configurações de varredura idênticas entre as amostras para permitir a quantificação comparativa e usar um modo de detecção linear. Posteriormente, reconstrua as imagens seriais em estruturas tridimensionais, segmente cada núcleo de interesse e use um software de processamento de imagem 3D para quantificar os sinais.

Usando este protocolo robusto de preparação em grande escala, Mount Vues inteiros manterão sua estrutura tridimensional. As estruturas subcelulares tornam-se visíveis com alto detalhe, como visto com a cromatina. Ao corar o DNA, a heterocromatina aparece como um foco brilhante e bem definido, sem a necessidade de aplicar deconvolução.

Este protocolo permite a coloração imunológica paralela com vários anticorpos em uma rodada. Por exemplo, o marcador permissivo associado à cromatina U, H três trimm metilado lisina quatro e o marcador associado à heterocromatina H três monometil lisina 27 foram detectados em um experimento em lâminas replicadas distintas para analisar a dinâmica da cromatina. Outra técnica compatível é a hibridização fluorescente C dois ou peixes peixes a 45 s.Ribossômico.

Repetições de DNA foram usadas para definir regiões de organização nuclear. A sonda foi marcada diretamente com Alexa 4 88, e o DNA foi corado com contadores Para análise de ificação, é muito importante testar diferentes diluições corporais e tempos de incubação para identificar as condições que fornecem sinal robusto e hogene com o menor possível. E contrição corporal.

Como este método alcança excelente preservação do tecido e permeação ideal para análise de célula única da organização da cromatina, ele abre caminho para cientistas no campo da biologia celular vegetal ou epigenética vegetal investigarem a organização nuclear ou subcelular em um único nível celular e no contexto do homem como um todo.