Linear Amplificação Mediada por PCR - Localização de elementos genéticos e Caracterização de Unknown Flanquear DNA

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar as posições exatas dos vetores virais integrados no genoma. Isso é alcançado por uma reação inicial de PCR linear com iniciadores biotinilados para enriquecer sequências de junção entre o vetor e o genoma a partir de DNA genômico em fase sólida em uma série de reações, gerando DNA de dupla fita com sequências de DNA conhecidas em ambas as extremidades do produto, o que permite a amplificação exponencial das junções entre o vetor e o genoma. Em seguida, adaptadores de sequenciamento são incorporados aos produtos de PCR lamb.

Para sequenciar e caracterizar o DNA flanqueador desconhecido por meio de sequenciamento profundo, esses fragmentos revelam as posições exatas de integração do vetor. O resultado é uma diversidade de junções amplificadas, observada por eletroforese em gel. Este método fornece informações sobre a distribuição dos sítios de integração do vetor viral em pacientes submetidos à terapia gênica clínica.

Ele também pode ser aplicado a outros estudos, como inserção, mutagênese, triagens, infecção viral, câncer e clonalidade de células-tronco ou diversidade de linfócitos T. O procedimento será demonstrado por Ina RA, técnica do meu laboratório. Para este procedimento, prepare primeiro a mistura de cassete de ligação: misture 40 microlitros de cada um dos dois LCO Legos com 110 microlitros de cloreto de tris e 10 microlitros de cloreto de magnésio em um tubo de microcentrífuga. Em seguida, coloque a mistura para incubação em um bloco térmico a 95 graus Celsius por cinco minutos e, depois, resfrie lentamente até a temperatura ambiente durante a noite.

No dia seguinte, adicione 300 microlitros de água ao ligador de dupla fita preparado, ao DNA e filtre-os em um tubo de microcentrífuga. Centrifugue o filtro para recolher o DNA do ligador concentrado no ouit. Em seguida, recupere o ouit do filtro.

Adicione 80 microlitros de água ao ouit e pipete alíquotas de 10 microlitros em tubos de PCR. Use PCR para pré-amplificar as junções do genoma do vetor em tubos de reação de 50 microlitros para cordeiro.

Adicione entre um nanograma e um micrograma de DNA da amostra por reação de 50 microlitros. Para o RN lamb, utilize pelo menos 100 nanogramas de DNA. Não adicione mais de 25 microlitros para executar a PCR de acordo com a tabela dois no texto.

E quando concluído, adicione mais 0,5 microlitros de tech a cada reação e execute o programa de PCR uma segunda vez. Primeiro, prepare as microesferas magnéticas. Adicione 20 microlitros de microesferas magnéticas revestidas com strept ENC a um tubo de 1,5 mililitro e coloque-as no separador de microesferas magnéticas por um minuto à temperatura ambiente.

Em seguida, descarte o sobrenadante elevado. Suspenda as perolas em 40 microlitros de PBS com BSA e coloque as perolas novamente no separador por mais um minuto. Substitua o sobrenadante por uma lavagem de 20 microlitros de solucao de cloreto de litio tres molar.

E novamente, coloque as microesferas no separador por um minuto. Finalize substituindo o sobrenadante por 50 microlitros de solução de cloreto de lítio seis molar. Agora, adicione a mistura de microesferas magnéticas ao produto da reação de PCR e deixe essa mistura incubar de duas horas a durante a noite, à temperatura ambiente, com agitação suave.

O DNA biotinilado e a tira tava e as microesferas revestidas formarão complexos que podem ser armazenados a quatro graus Celsius por até quatro dias. Prossiga com lamb ou NR lamb devido à sua alta sensibilidade. A L-A-M-P-C-R é propensa à contaminação se executada com descuido.

Esse é um ambiente de grau PCR. E a atenção especial à limpeza é de extrema importância. Para amplificar com sucesso o DNA flanqueador desconhecido sem contaminar as amostras, primeiro exponha os complexos ao separador por um minuto e ressuspenda as microesferas de DNA em 100 microlitros de água.

Em seguida, exponha os complexos ao separador por um minuto. Desta vez, ressuspenda os complexos de DNA ligados às microesferas em uma mistura contendo 8,25 microlitros de água, 1 microlitro de tampão de nucleotídeo HEXA, um quarto de microlitro de dNTPs e meio microlitro de polimerase cano.

Incube esta mistura a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, adicione 90 microlitros de água e exponha a reação ao separador por mais um minuto. Depois, ressuspenda os complexos de perlas de DNA em uma lavagem de 100 microlitros de água.

Use o separador por mais um minuto e prepare a reação com a enzima de restrição. Após remover o sobrenatante, adicione 8,5 microlitros de água, um microlitro de tampão para enzima de restrição e meio microlitro da enzima de restrição.

Ao selecionar a enzima de restrição, certifique-se de que ela não possua sítios dentro ou a jusante do sítio de ligação do iniciador utilizado na reação de pré-amplificação. Após permitir que as enzimas reajam por uma hora na temperatura ideal, adicione 90 microlitros de água. Use um separador por um minuto e re-suspenda os complexos BDNA em uma lavagem com 100 microlitros de água.

Repita a separação e prepare a reação de ligação. Adicione às esferas cinco microlitros de água, um microlitro de tampão fast link 10x, um microlitro de TP, um microlitro de DNA ligase fast link e um microlitro do cassete de ligação preparado no início do procedimento.

Deixe essa reação ocorrer por cinco minutos à temperatura ambiente. Encerre a reação adicionando 90 microlitros de água e separando as microesferas, seguido por uma lavagem com 100 microlitros de água. Em seguida, outra separação para desnaturar o DNA sintetizado: ressuspenda as microesferas em cinco microlitros de hidróxido de sódio 0,1 normal e deixe a mistura agitar por cinco minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, separe os complexos por um minuto e colete o SUP natin, que contém a junção do genoma vetorial pré-amplificado. Prossiga imediatamente com a amplificação exponencial ou armazene a menos 20 graus Celsius. Inicie expondo os complexos ao separador por um minuto.

E ressuspender os grânulos de DNA em 100 microlitros de água. E separá-los novamente e remover o sobrenadante. Para a reação de ligação, adicionar 6,5 microlitros de água, um microlitro de circ Ligase, tampão de reação 10 x.

Meio microlitro de cloreto de magnésio, meio microlitro de TP, um microlitro de oligos ligadores SS e meio microlitro de cir ligase. Após uma hora a 60 graus Celsius, encerre a reação com 90 microlitros de água utilizando o separador de esferas, ressuspendendo as esferas em outros 100 microlitros de um, usando o separador novamente e coletando os complexos de lavagem em 10 microlitros de água. Comece preparando uma mistura mestra de PCR conforme descrito na tabela três do texto.

Adicione 48 microlitros da mistura mestra a dois microlitros dos produtos de lamb ou NR lamb em tubos PCR de 200 microlitros e realize a PCR conforme descrito no texto anteriormente, prepare mais strept em esferas e ressuspenda-as em cloreto de lítio seis molar. Use 20 microlitros para lamb ou 50 microlitros para NR lamb. Em seguida, adicione as esferas ao mesmo volume dos produtos da reação de PCR e incube-as em agitador a 300 RPM por duas horas até a noite toda à temperatura ambiente, colete o complexo de DNA e esferas e lave-o com 100 microlitros de água conforme demonstrado anteriormente.

Agora, suspenda o complexo em hidróxido de sódio 0,1 normal e incube as esferas por 10 minutos à temperatura ambiente em agitador. Em seguida, exponha as esferas ao separador por um minuto e colete o sobrenadante contendo o DNA amplificado em um novo tubo. Usando o DNA amplificado como molde, utilize dois microlitros dele para realizar uma PCR conforme descrito na tabela quatro do texto.

Visualize os produtos por eletroforese em gel para purificar os produtos. Misture 40 microlitros deles com 44 microlitros de esferas magnéticas AMPure XP em temperatura ambiente e incube por cinco minutos. Em seguida, separe as esferas por dois minutos no ímã.

Após a remoção do sobrenadante, lave as microesferas duas vezes utilizando 200 microlitros de etanol a 70%, e então reconstitua as microesferas em 30 microlitros de água usando 40 nanogramas do iniciador de fusão de DNA. A PCR pode ser utilizada para adicionar adaptadores específicos para sequenciamento. Os detalhes são fornecidos na tabela cinco.

Verifique os produtos em um gel. A visualização dos resultados da PCR do gene lamb por eletroforese em gel de alta resolução é a melhor opção de análise diagnóstica em comparação. Embora o agarose a 2% também funcione, ele não funciona tão bem.

A clonalidade do NR LAMB, os produtos de PCR não podem ser diagnosticados visualmente. Um gel de agarose a 2% é, no entanto, perfeitamente suficiente para determinar o sucesso do protocolo. Após o sequenciamento dos produtos de PCR, a localização dos vetores pode ser identificada no genoma do hospedeiro.

A partir desses dados, é possível registrar as localizações dos sítios de inserção em regiões codificadoras e próximas aos sítios iniciais de transcrição após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de terapia gênica explorassem a biossegurança de vetores de transferência gênica tanto em modelos pré-clínicos quanto em ensaios clínicos de terapia gênica.