Linear Amplificação Mediada por PCR - Localização de elementos genéticos e Caracterização de Unknown Flanquear DNA

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar as posições exatas da integração de vetores virais no genoma. Isso é obtido por uma reação de PCR linear inicial com primers biotinilados para enriquecer as sequências de junção do genoma do vetor do DNA genômico em fase sólida em uma série de reações, o DNA de fita dupla com sequências de DNA conhecidas em ambas as extremidades do produto são geradas, o que permite a amplificação exponencial das junções do genoma do vetor. Em seguida, os adaptadores de sequenciamento são incorporados aos produtos de PCR de cordeiro.

A fim de sequenciar e caracterizar o DNA flanqueador desconhecido com sequenciamento profundo, esses fragmentos revelam as posições exatas das integrações vetoriais. O resultado é uma diversidade de junções amplificadas vistas por eletroforese em gel. Este método fornece informações sobre a distribuição do local de integração do vetor viral em pacientes de terapia gênica clínica.

Também pode ser aplicado a outros estudos, como inserção, mutagênese, telas, infecção por vírus, câncer e clonalidade de células-tronco ou diversidade de células T. O procedimento será demonstrado por ina RA, um técnico do meu laboratório Para este procedimento, primeiro prepare os ligantes misture 40 microlitros de cada um dos dois LCO Legos com 110 microlitros de cloridrato de tris e 10 microlitros de cloreto de magnésio em um tubo de microcentrífuga. Em seguida, defina a mistura para incubar em um bloco de calor de 95 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, esfrie lentamente até a temperatura ambiente durante a noite.

No dia seguinte, adicione 300 microlitros de água ao ligante de fita dupla preparado, DNA, e filtre-os sobre um tubo de microcentrífuga. Gire o filtro para coletar o DNA do ligante concentrado no ouit. Em seguida, recupere o ouit do filtro.

Adicione 80 microlitros de água ao ouit e pipete. Alíquotas de 10 microlitros em tubos de PCR. Use PCR para pré-amplificar as junções do genoma do vetor em tubos de reação de 50 microlitros para cordeiro.

Adicione entre um nanograma e um micrograma de amostra de DNA por reação de 50 microlitros. Para cordeiro NR, use pelo menos 100 nanogramas de DNA. Não adicione mais de 25 microlitros de executar a PCR de acordo com a tabela dois do texto.

E quando concluído, adicione mais 0,5 microlitros de tecnologia a cada reação e execute o programa de PCR uma segunda vez. Primeiro, prepare as contas magnéticas. Adicione 20 microlitros de esferas magnéticas revestidas com ENC a um tubo de 1,5 mililitro e coloque-as no separador de esferas magnéticas por um minuto à temperatura ambiente.

Em seguida, descarte o aumento do sobrenadante. Suspenda os grânulos em 40 microlitros de PBS com BSA e coloque os grânulos de volta no separador por mais um minuto. Substitua o sobrenadante por uma lavagem de 20 microlitros de solução de cloreto de lítio de três molares.

E novamente, coloque as contas no separador por um minuto. Finalize substituindo o sobrenadante por 50 microlitros de solução de cloreto de lítio de seis molares. Agora adicione a mistura de esferas magnéticas ao produto da reação de PCR e deixe essa mistura incubar por duas horas a uma noite em temperatura ambiente com agitação suave.

O DNA biotinilado e a tira tava e as contas revestidas formarão complexos que podem ser armazenados a quatro graus Celsius por até quatro dias. Prossiga com cordeiro ou cordeiro NR Devido à sua alta sensibilidade. L-A-M-P-C-R é propenso a contaminação se executado com atenção.

Esse é um ambiente de grau PCR. E atenção especial à limpeza de extrema importância. Para amplificar com sucesso o DNA flanqueador desconhecido sem contaminar as amostras, primeiro exponha os complexos ao separador por um minuto e suspenda novamente as esferas de DNA em 100 microlitros de água.

Em seguida, exponha os complexos ao separador por um minuto. E desta vez ressuspenda os complexos de esferas de DNA em uma mistura com 8,25 microlitros de água. Um microlitro de tampão nucleotídeo HEXA, um quarto de microlitro de D DN NTPs e meio microlitro de cano polimerase.

Incube esta mistura a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, adicione 90 microlitros de água e exponha a reação ao separador por mais um minuto. Em seguida, ressuspenda os complexos de esferas de DNA em uma lavagem de água de 100 microlitros.

Utilizar o separador durante mais um minuto e preparar a reacção enzimática de restrição. Depois de remover o sobrenadante. Adicione 8,5 microlitros de água, um microlitro de tampão de enzima de restrição e meio microlitro da enzima de restrição.

Ao selecionar a enzima de restrição, certifique-se de que ela não tenha locais dentro ou a jusante do local de ligação primal usado na reação de amplificação preem. Depois de permitir que as enzimas reajam por uma hora na temperatura ideal, adicione 90 microlitros de água. Use um separador por um minuto e ressuspenda os complexos BDNA em uma lavagem de 100 microlitros de água.

Repita a separação e prepare a reação de ligação. Adicione às contas cinco microlitros de água, um microlitro de 10 x tampão de ligação rápida. Um microlitro de um TP, um microlitro de DNA ligase de ligação rápida e um microlitro do de ligação feito no início do procedimento.

Deixe essa reação funcionar por cinco minutos em temperatura ambiente. Termine a reação adicionando 90 microlitros de água e separando as contas, seguida de uma lavagem em 100 microlitros de água. E então outra separação para desnaturar o DNA sintetizado ressuspende as esferas em cinco microlitros de hidróxido de sódio 0,1 normal e permite que a mistura agite por cinco minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, separe os complexos por um minuto e colete o SUP natin, que contém a junção do genoma do vetor amplificado preem. Prossiga imediatamente com a amplificação exponencial ou armazene a menos 20 graus Celsius. Comece expondo os complexos ao separador por um minuto.

E resus suspendendo as esferas de DNA em 100 microlitros de água. E separe-os novamente e remova o sobrenadante. Para a reação de ligação, adicione 6,5 microlitros de água, um microlitro de circ Ligase, 10 x tampão de reação.

Meio microlitro de cloreto de magnésio, meio microlitro de TP, um microlitro de oligos ligantes SS e meio microlitro de cirligase. Após uma hora a 60 graus Celsius, termine a reação com 90 microlitros de água usando o separador de esferas Resus suspendendo as esferas em mais 100 microlitros de um, usando o separador novamente e coletando os complexos de lavagem em 10 microlitros de água. Comece preparando uma mistura principal de PCR conforme descrito na tabela três do texto.

Adicione 48 microlitros de master mix a dois microlitros de cordeiro ou produtos de cordeiro NR em tubos de PCR de 200 microlitros e execute o PCR conforme descrito no texto anterior, prepare mais strept em grânulos e ressuspenda-os em cloreto de lítio de seis molares. Use 20 microlitros para cordeiro ou 50 microlitros para cordeiro NR. Em seguida, adicione grânulos ao mesmo volume de produtos de reação de PCR e incube-os em um agitador a 300 RPM por duas horas durante a noite em temperatura ambiente, colete o complexo de grânulos de DNA e lave-o com 100 microlitros de água conforme demonstrado anteriormente.

Agora, suspenda o complexo em hidróxido de sódio normal 0,1 e incube as esferas por 10 minutos em temperatura ambiente em um shaker. Em seguida, expor as esferas ao separador durante um minuto e recolher o sobrenadante que contém o ADN amplificado para um novo tubo. Usando o DNA amplificado como modelo, use dois microlitros dele para executar uma PCR, conforme descrito na tabela quatro do texto.

Visualize os produtos por eletroforese em gel para purificar os produtos. Misture 40 microlitros deles com 44 microlitros de esferas magnéticas XP puras à temperatura ambiente e incube-as por cinco minutos. Em seguida, separe as contas por dois minutos no ímã.

Depois de remover o sobrenadante, lave as esferas duas vezes usando 200 microlitros de etanol a 70% e, em seguida, ressuspenda as esferas e 30 microlitros de água usando 40 nanogramas de primer de fusão de DNAA. A PCR pode ser usada para adicionar adaptadores específicos de sequenciamento. Os detalhes são fornecidos na tabela cinco.

Verifique os produtos em um gel. A visualização dos resultados da PCR de cordeiro por eletroforese em gel de alta resolução é a melhor escolha de análise diagnóstica por comparação. Embora 2%aros também funcione, não funciona tão bem.

A clonalidade de produtos NR LAMB, PCR não pode ser diagnosticada visualmente. Um gel 2%agros é, no entanto, perfeitamente suficiente para determinar o sucesso do protocolo. Após o sequenciamento dos produtos de PCR, a localização dos vetores pode ser encontrada no genoma do hospedeiro.

A partir desses dados, é possível registrar os locais de inserção em regiões codificantes e próximos aos locais de início da transcrição após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da terapia gênica explorarem a biossegurança dos vetores de transferência de genes em modelos pré-clínicos e em ensaios clínicos de terapia gênica.