Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, gramnegative Organismen direkt aus Blutkulturbrühe mit Hilfe der Maloff-Technologie zu identifizieren. Dazu werden fünf Milliliter einer positiven Blutkulturbrühe in ein Serumtrennröhrchen überführt und zentrifugiert. Nach dem Schleudern wird die bakterienhaltige Flüssigkeitsschicht in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und dann mit niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert. Anschließend wird der Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt und mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert.

Das resultierende Pellet wird in Ameisensäure resuspendiert und von maldi analysiert, um die vorhandenen Bakterienarten zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der traditionellen Kultur ist die frühere Identifizierung gramnegativer Bakterien. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die klinische Mikrobiologie, da die Diagnose einer Bakteriämie Auswirkungen auf die Wahl des vom Arzt verschriebenen antimikrobiellen Mittels hat.

Dieses Verfahren wird von Leonardo Bascu demonstriert, der einer der Techniker in unserer Abteilung ist, die dieses Verfahren regelmäßig durchführen. Aerobe oder anaerobe Blutkulturflaschen, die nach Ermessen des klinischen Personals entnommen werden, in der Regel im Rahmen einer fieberhaften Erkrankung, werden in automatisierten Maschinen inkubiert, die kontinuierlich das Wachstum von Bakterien überwachen. Wenn es Anzeichen von Wachstum in einer Blutkulturflasche gibt, identifiziert das Gerät die signalisierte Flasche.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die signalisierte Blutkulturflasche aus dem Inkubator nehmen. Stellen Sie es in eine biologische Sicherheitswerkbank. Bereiten Sie eine Grammfärbung aus der signalisierten Blutkulturbrühe gemäß den lokalen institutionellen Protokollen vor und untersuchen Sie sie mikroskopisch, ob gramnegative Organismen identifiziert wurden.

Verarbeiten Sie die Kulturbrühe nach der hier beschriebenen Methode. Werden grampositive Organismen identifiziert, kann eine alternative molekulare Schnellmethode verwendet werden. Drehen Sie die Blutkulturflasche zum Mischen zwei- bis dreimal um.

Dann in die Biosicherheitswerkbank. Befestigen Sie eine 10-Milliliter-Spritze an einem Sicherheitsblutübertragungsgerät. Befestigen Sie das Bluttransfergerät an der Blutkulturflasche und ziehen Sie fünf Milliliter der Brühe in den Spritzentransfer auf.

Die aspirierte Blutkulturbrühe wird in eine Serum-Trennröhrchenzentrifuge bei 1.250 mal G für 15 Minuten gegeben, um rote Blutkörperchen zu entfernen. Nach dem Schleudern zeigt die Blutkultur aus den Aerobic-Flaschen eine klare Trennung der roten Blutkörperchen zum Boden des Röhrchens, wobei die Gelflüssigkeitsgrenzfläche als undurchsichtige weiße Farbe erscheint. Im Gegensatz dazu erscheint die Blutkultur aus der lytischen anaeroben Blutkultur als tiefrote Farbe an der Grenzfläche der Gelflüssigkeit.

Da die lysierten Bestandteile der roten Blutkörperchen in dem Überstand für beide Arten suspendiert bleiben, aspirieren und verwerfen Sie den Überstand mit einer sterilen Transferpipette, wobei darauf zu achten ist, dass etwa ein Milliliter des Buffy-Coats unmittelbar über der Grenzfläche der Gelflüssigkeit verbleibt. Mischen Sie anschließend mit einer sterilen Pipette vorsichtig den letzten Milliliter Buffy Coat Fluid über der Gelschnittstelle und geben Sie dann das gesamte Volumen in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Drehen Sie das neue Röhrchen 30 Sekunden lang mit einer Ein-Milliliter-Einwegpipette aus Kunststoff bei 288 g G.

Den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen und das Röhrchen mit dem Pellet entsorgen. In diesem Schritt ist es wichtig, eine Übertragung des Pellets zu vermeiden. Dies ist besonders wichtig bei anaeroben Blutkulturproben, da das Supinat pigmentiert bleibt und das Pellet nicht immer deutlich zu sehen ist.

Zentrifugieren Sie die Probe eine Minute lang bei 18.407 mal G und ziehen Sie dann mit einer Feinspitzenpipette den Überstand ab und entsorgen Sie ihn, um so wenig Restflüssigkeit wie möglich zu hinterlassen, ohne das Pellet zu beschädigen. Fügen Sie einen Milliliter steriles DNA- und RNA-freies Wasser hinzu und pipettieren Sie auf und ab, um die restliche Pelletzentrifuge wieder zu suspendieren. Die resuspendierte Lösung bei 18, 407 mal G für eine Minute.

Nach der Zentrifugation wird der Überstand mit einer Pipette mit feiner Spitze abgesaugt und verworfen. Auch hier gilt: Achten Sie darauf, so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Mikrolitern 70%iger Ameisensäure.

Bei großen Pellets kann es erforderlich sein, das Ameisensäurevolumen um 50 bis 100 % zu erhöhenVerwenden Sie die Pipettenmischung, um eine homogene Lösung zu gewährleisten. Verwenden Sie bei Bedarf die Pipettenspitze, um das Pellet physikalisch aufzubrechen. Die resultierende Lösung enthält konzentrierte Bakterien, die aus der Blutkulturbrühe isoliert wurden, die relativ frei von menschlichen Zellen und von Blutkultur-Flaschenharzen ist. Mit einer Pipette wird eine saubere maldi TOF-Zielplatte mit zwei Mikrolitern der vorbereiteten Suspension pro Zielpunkt inokuliert. Bereiten Sie drei Zielstellen für jede Probe vor, um das gelegentliche Problem fehlgeschlagener Lesevorgänge zu überwinden.

Platzieren Sie die Platte auf dem Rand des Abzugs, um den Luftstrom zu maximieren, damit sie schnell trocknen und jede getrocknete Stelle mit einem Mikroliter Matrixlösung überziehen kann. Lassen Sie die Maldi to Target Plate am Rand des Abzugs trocknen. Stellen Sie wie bisher sicher, dass eine homogene Zubereitung jede der Zielpunkte auf der Platte ausfüllt.

Setzen Sie die Zielplatte in das maloff-Massenspektrometer ein. Stellen Sie sicher, dass die Platte bündig mit den federbelasteten Platten abschließt. Setzen Sie die Zielplatte erst ein, wenn alle Zielpunkte trocken sind.

Überprüfen Sie die Gummidichtung, um sicherzustellen, dass sie frei von Flusen, Staub und Haaren ist. Dadurch können die erforderlichen Vakuumbedingungen geschaffen werden. Schließen Sie anschließend den Maloff-Tischdeckel und drücken Sie dann die Ein-Aus-Taste an der Vorderseite des Instruments.

Der Deckel verriegelt sich und es entsteht ein Vakuum. Öffnen Sie die maldi typ und flex control software innerhalb der typ software. Wählen Sie im Dropdownmenü mit dem Titel Datei die Option Neue Klassifizierung aus, benennen Sie das Projekt, und wählen Sie dann Neu aus.

Wählen Sie Weiter aus. Um die Einrichtung im Fenster der Flex-Control-Software abzuschließen, identifizieren Sie die Bildschirmgrafik der Zielplatte, während Sie die linke Maustaste gedrückt halten. Bewegen Sie die Maus über die geimpften Flecken und markieren Sie die Zielflecken, die verwendet werden.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine beliebige Stelle der ausgewählten Zielpositionen und wählen Sie dann im Dropdown-Menü die Option Analyten hinzufügen aus. Fügen Sie für jeden der Zielpunkte der Spalte ID Details zur Blutkulturidentifikation hinzu und klicken Sie auf Weiter. Wenn Sie fertig sind, wählen Sie die Datenbank für kommerzielle Taxonomie-Spektren aus und wählen Sie Next Laboratories may use additional interne oder kommerzielle Datenbanken, um die Anzahl der Referenzspektren zu erhöhen, klicken Sie auf Fertig und das MALDI TOF MS beginnt mit der Generierung von Spektren.

Gelegentlich können höhere maldi-to-Scores erreicht werden, indem die manuelle Erfassung von maldi-to-Spektren innerhalb der Flex-Control-Software verwendet wird. Sobald die Spektren erfasst sind und die Analyse in der Stereotypisierungssoftware abgeschlossen ist, wählen Sie die Plus-Schaltfläche neben der Artidentifikation aus. Um die Identifikationsliste für jedes Ziel zu erweitern, untersuchen Sie die fünf wichtigsten Identifikationen, und notieren Sie, ob die fünf wichtigsten Identifikationen ähnlich sind.

Wenn die fünf wichtigsten Genres mit Werten von mehr als oder gleich 1,7 für denselben Zielpunkt nicht übereinstimmen, kann eine Mischung von Arten vorhanden sein. Beachten Sie, dass die OV-Technologie eine geringe Empfindlichkeit für den Nachweis gemischter Spezies aufweist. Wenn eine Punktzahl von mindestens 2,0 für die höchste Übereinstimmung an einem Zielpunkt festgestellt wird, melden Sie die Spezies, bei der die höchste Punktzahl an einem Zielpunkt größer oder gleich 1,7, aber kleiner als 2,0 ist, das Gen.

Nur wenn zusätzliche Kriterien der fünf wichtigsten Identifikationen übereinstimmen, dann auf Artebene melden. Wenn alle Spektren vollständig sind, drücken Sie die Ein-Aus-Taste an der MALDI, um zu bearbeiten, öffnen Sie die Aufnahme der Zielplatte und entfernen Sie die Platte. Wenn Sie eine wiederverwendbare Maldi TOF-Zielplatte verwenden, verwenden Sie Alkohol, um alle Zielpunkte zu reinigen, und lagern Sie die Maldi to Plate bei Raumtemperatur, sobald sie sauber und trocken ist, um gramnegative Bakterien aus Blutkulturbrühe zu identifizieren.

Wie in diesem Videoartikel beschrieben, handelt es sich hier um die von MALDI TOF MS generierten Spektren für Eureka coli mit einem logarithmischen Score von 1,86. Rechts davon sind die ersten fünf Übereinstimmungen zu sehen, die von der Eingabesoftware identifiziert werden. Es ist zu beachten, dass die Spezies durchweg als re coli mit einer Punktzahl von 1,861 angegeben wird.

Da es sich bei den fünf besten Übereinstimmungen um E-coli handelt, gilt die Identifizierung auf Speziesebene als zuverlässig. Die von MALDI bis MS erzeugten Spektren für Pseudomonas aerogen sind hier dargestellt. Die logarithmische Punktzahl beträgt 2,216, rechts davon sind die ersten fünf Übereinstimmungen, die von der Eingabesoftware identifiziert werden.

Beachten Sie, dass die Art durchweg als Pseudomonas aerogen mit einer hohen Punktzahl von 2.216 angegeben wird. Die Identifizierung gilt auf der Ebene der Art als zuverlässig. Die von MALDI bis MS erzeugten Spektren für eine gemischte Blutkulturbrühe, die Esia coli und SIO Marsens enthält, sind hier zu sehen: Rechts sind die ersten fünf Übereinstimmungen der Typisierungssoftware, die sowohl Reiki coli als auch SIO marsan meldet.

In den ersten fünf übereinstimmenden Spektren. Dieses Mischgen ist nur in etwa einem Drittel der Mischbouillonkulturen nachweisbar. Diese Tabelle fasst die zuvor veröffentlichten Ergebnisse der Verifizierungsstudie dieser Methode zusammen, in der 91,8 % der monomikrobiellen Brühen einen Maldi-Wert von weniger als 1,7 mit 100 % bzw. 97 % Übereinstimmung mit Genius bzw. Spezies erreichten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie eine Signalblutkulturflasche für die Identifizierung mit Maldi Toff vorbereiten können. Wenn wir dieser Methode folgen, können wir das gleiche Pellet, das für die bakterielle Identifizierung vorbereitet wurde, verwenden, um ein standardisierteres Inokular für automatisierte Empfindlichkeitstests vorzubereiten. Diese Technik ermöglicht es Laboratorien beispielsweise, Klinikern eine frühzeitige Diagnose zu stellen, die sich auf das Management auswirken kann.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Blutkulturflaschen gefährlich sein kann und bei der Handhabung von Blutkulturflaschen immer Vorsichtsmaßnahmen, einschließlich einer biologischen Sicherheitswerkbank, getroffen werden sollten.