質量分析法による総合的なO-結合およびスルホグライコミクスのための改良されたゲル内還元β脱離

この手順の全体的な目標は、Olink グリカンを回収することです。これは、まず糖タンパク質をSDSページで分解することによって達成されます。2番目のステップは、目的の糖タンパク質を含むゲル片を洗浄することです。

次に、還元的β脱離によりolink糖鎖が遊離されます。最後のステップは、位相分配によるメチル化あたりの糖鎖です。最終的に、パーマメチル化糖鎖はタンデム質量分析法で分析され、構造を検出し、存在量を定量します。

この手法が高速液体クロマトグラフィーなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、当社の分析法が中性糖鎖と荷電化糖鎖を迅速な位相分配で分離することです。この手法は、分解された糖タンパク質から遊離した糖鎖または結合糖鎖の包括的な特性評価を可能にすることで、糖鎖科学分野の重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手順を開始する前に、ゲル電気泳動を使用して糖タンパク質を分離してください。

電気泳動後、ゲルをガラスプレートに置き、きれいなメスで目的領域を切り出すことで、OG糖鎖の収量を増やします。目的のゲルバンドを別のガラスプレートに移し、ピースを約2ミリメートルの立方体にカットします。小さなゲル片を、ステンレス製のマイクロスパチュラを備えた13 x 100 mmのスクリュートップガラス管に移します。

次に、25ミリモルの重炭酸アンモニウムまたはアンビを1ミリリットルサンプルチューブに加えます。テフロンラインスクリュートップキャップでチューブをキャッピングした後、チューブをフリックして内容物を静かに混合してから、10分間放置します。次に、ガラス管からアンビットを慎重に取り外します。

牧草地またはガラスピペットを使用して、ガラス管に1ミリリットルのアセトニトリルを加えて、ゲル片を完全に覆います。チューブに蓋をした後、チューブをフリックして内容物を静かに混合し、10分間放置します。終了したら、ガラス管からアセトニトリルを取り除きます。

明るい青色がなくなるまで前の手順を繰り返した後、2ミリリットルの酢酸エチルを追加し、チューブを再びキャップします。チューブを摂氏4度に一晩置き、端から端まで攪拌します。酢酸エチル洗浄液を除去したら、2ミリリットルの脱イオン水で3回の洗浄を行います。

ゲル片が乾燥したら、100ミリモルの水酸化ナトリウム溶液を500マイクロリットル加えます。そして、氷の上に3〜5分間立って、ゲルを糖鎖の回復を促進する基本条件に平衡化させましょう。これに続いて、500マイクロリットルの2モルの水素化ホウ素ナトリウムを100ミリモルの水酸化ナトリウムに加え、100ミリモルの水酸化ナトリウムに1モルの水素化ホウ素ナトリウムの最終濃度をもたらします。

チューブを穏やかに混合した後、サンプルを摂氏45度で18時間インキュベートします。インキュベーションの最初の1時間は、15分ごとにチューブを穏やかに混合します。ベータ除去反応が完了し、チューブを氷の上に置いた後、10%酢酸をゆっくりと滴下します。

塩基を中和するには、酢酸の添加の間にサンプルチューブを穏やかにボルテックスし、チューブを遠心分離して気泡を排除し、必要に応じてスピルオーバーを防ぎます。小さなガラス柱を作成するには、セラミックカッターを使用して牧草地またはガラスピペットの先端を引っ掻いて壊し、ピペットの先端のテーパーの長さが約1センチメートルになるようにします。グラスウールのプラグをからかった後、グラスウールを先端に向かって押して、樹脂ベッドのサポートを形成します。

ピペットカラムを洗濯バサミで固定し、ガラス試験管の上に置きます。次に、グラスウールが入った空のピペットを1ミリリットルのメタノールと3ミリリットルの5%酢酸で洗います。ダウX水素陽イオン交換樹脂スラリーを5%酢酸で渦巻かせた後。

牧草地のピペット コラムで 1 ミリリットルのベッド容量を生成するのに十分な量を移し、5 容量の 5% 酢酸チェックフロースルーを使用してカラムをすすぎ、樹脂粒子の出現を確認します。新しい 16 x 125 mm のスクリュートップガラス管にカラムを載せた後、サンプルをカラムにロードします。フロースルーが収集されたら、少なくとも 3 容量の 5% 酢酸を含む糖鎖を同じチューブに溶出します。

凍結乾燥後、乾燥したサンプルチューブにメタノール中の10%酢酸300マイクロリットルを加えます。ボルテックス後、得られたトリメチルベイトを摂氏37度の窒素流下で蒸発させることにより除去します。再懸濁と乾燥のステップを少なくとも4回繰り返した後、サンプルを5%酢酸で再構成します。

サンプルを平衡化したC 18カラムにロードしたら、13 x 100 mmのガラス製スクリューキャップチューブに流量を回収します。OOG グリカンを 3 ミリリットルの 5% 酢酸で同じチューブに溶出します。次に、サンプルを凍結乾燥して、パーマメチル化用のベース試薬を調製します。

400マイクロリットルの50%水酸化ナトリウムを、きれいな13 x 100ミリメートルのガラススクリュートップチューブに加えます。次に、800マイクロリットルの無水メタノールを同じチューブに加えます。4ミリリットルの無水ジメチルスルフ酸化物と渦を加えて、白い沈殿物を生成します。

サンプルを600倍Gで1分間遠心分離し、沈殿物をペレット化します。上清を捨て、4ミリリットルの無水ジメチルスルフ酸化物をペレットの渦に加えた後、試薬は、塩基スラリーが半透明になるまでさらに4回繰り返します。ペレット化したベースを3ミリリットルの無水ジメチルスルフ酸化物に溶解し、清潔な牧草ピペットでピペッティングで上下させて穏やかに混合します。

次に、乾燥したサンプルとボルテックスに200マイクロリットルの無水ジメチルスルフ酸化物を加えます。それを復活させるには、再懸濁したベーススラリーを300マイクロリットルのサンプルに加え、すぐに100マイクロリットルのITOMメタンを追加します。チューブをテフロンで裏打ちされたキャップで密封し、ボルテックスで5分間激しく混合します。

パーマメチル化反応を止めるには、チューブを氷の上に置き、5%酢酸を2ミリリットル加えます。ボルテックス後、溶液を5回ピペットで上下させ、蒸発によってITOMメタンの残量を減らします。この時点で、ボルテックスと遠心分離の後、2ミリリットルのジクロロメタンをサンプルに加えます。

上部の水層を新しい13 x 100 mmガラス管に移します。ジクロロメタン層の水洗を繰り返した後、第2の水相と第1の水層を結合します。ジクロロメタン相の水洗浄を2〜3回繰り返したら、ジクロロメタン相を清潔なガラス管に清潔な牧草ピペットで移します。

次に、有機相を摂氏42度の窒素流下で乾燥させます。C 18カラムをe平衡化し、その上に水層をロードした後。C 18カラムを水で洗浄し、パーマメチル化硫酸O糖鎖を2ミリリットルの50%アセトニトリルを含む新しいガラス管に溶出し、ナノエレクトロスプレー源を使用して適切な質量分析計に直接注入することにより、210°Cで毎分0.4〜0.6マイクロリットルのシリンジ流量でパーマメチル化OG糖鎖

MSM Sおよびイオントラップ装置の多次元MSにおける衝突誘起解離によるフラグメンテーションの毛細管温度は、インゲル還元的β除去法を用いてウシムチンから遊離したpermメチル化olink糖鎖サンプルの30〜40%のコリジョンエネルギー代表質量スペクトルを適用した上で示しています。スペクトルは、ポリアクリルアミドゲルに由来するポリ分散汚染物質によって支配されています。底面パネルは、ベータ除去前のゲル片の酢酸エチル洗浄がこの問題を解消することを示しています。

Oinked 糖鎖は、小さくスライスされたゲル片または大きくスライスされたゲル片を使用して Ingel 還元的ベータ除去により、ウシの上顎下ムチンから遊離されました。小さなゲル片からの oinked 糖鎖の回収率は、大きなゲルスライスからの回収率よりもほぼ 10 倍高かった。中性パーマメチル化糖鎖は、有機ジクロロメタン相で回収されます。

一方、オン酸パーマのメチル化糖鎖は、水相に定量的に分配されます。位相分配法の効率性とシンプルさにより、サンプルのスループットとその後の分析アプローチが大幅に促進されます。非硫酸化パーマメチル化 O 糖鎖は有機相から回収され、すべてのパーマメチル化スル糖鎖は水相から回収されたため、ほぼ Isobar 硫酸化糖鎖および非硫酸化糖鎖の同定と特性評価が容易になります。

これらの糖鎖はわずか0.1質量単位の差があり、その発生後に2つの分子種を位相分配によって物理的に分離しなければ分解することは困難である。この技術により、組織サンプル、培養細胞、モデルシステム、および患者サンプルにおける糖鎖の多様性を徹底的に調査することができました。このビデオを見れば、glyタンパク質から放出されたすべての結合糖鎖をうまくパルメートし、パーショニングする方法を十分に理解できるはずです。

SDSページで解決しました。