Osteoclastos Derivação do mouse Medula Óssea

O objetivo geral deste procedimento é isolar osteoclastos da medula óssea de camundongos em grande número. Isso é feito primeiro colhendo ossos de camundongos sacrificados. Em seguida, as células são liberadas da medula óssea usando um almofariz e pilão para esmagar os ossos em tampão de fatos.

Em seguida, a solução da medula óssea é colocada em camadas no meio de separação de células de gradiente de densidade e a separação de células de gradiente de densidade é realizada. Finalmente, a camada contendo as células de interesse é aspirada e as células são colocadas em meio de indução de micrófagos da medula óssea. Em última análise, a coloração trap é usada para mostrar a presença de um grande número de osteoclastos.

As implicações dessa técnica se estendem a doenças associadas à função alterada dos osteoclastos, que podem variar em gravidade, desde doença neonatal letal devido à falha em formar um espaço medular para hematopoiese até patologias mais comumente encontradas como osteoporose, porque produz um método confiável de isolar um grande número de osteoclastos da medula óssea de camundongos. Para começar, traga 10 mililitros de separação de células de gradiente de densidade comercialmente disponível, temperatura média a ambiente em um tubo cônico de 50 mililitros. Colocar uma alíquota de 50 ml de tampão de fax à temperatura ambiente para ser utilizada com o meio de separação de células com gradiente de densidade.

Depois de preparar um meio adicional e sacrificar um camundongo C 57 black six, de acordo com o protocolo de texto, posicione o mouse em uma placa de dissecação e use etanol a 70%. Para pulverizá-lo, colha o olho e a coluna fértica tíbia. Em seguida, coloque os ossos em um tampão de fatos no gelo.

Em seguida, usando papel de seda limpo, remova o músculo e o tecido mole dos ossos. Coloque os ossos em um pilão com três mililitros de tampão e esmague-os suavemente. Em seguida, aspire o líquido manchado de sangue e passe-o por um filtro de 70 micrômetros para um tubo cônico de 50 mililitros.

Adicione mais cinco mililitros de tampão de efeitos ao osso triturado e esmague ainda mais antes de transferir o líquido através do filtro para o tubo de 50 mililitros. Continue com esse processo até que o fluido não fique mais vermelho antes de peletar a medula óssea a 200 Gs por cinco minutos a quatro graus Celsius. Para realizar uma separação de gradiente, aspire os sobrenadantes do pellet celular e use 10 mililitros de tampão de fax para resus.

Suspenda o pellet, incline o tubo cônico do meio de separação de células de gradiente de densidade de temperatura ambiente para cerca de 30 graus e use uma pipeta elétrica com a ponta da pipeta contra a superfície superior interna do tubo. Camada lenta da solução de medula óssea no meio usando uma centrífuga à temperatura ambiente sem aceleração ou desaceleração. Gire o gradiente a 200 Gs por 15 minutos.

Em seguida, aspire a camada intermediária turva, que contém as células de interesse e transfira-as para um novo tubo cônico. Adicione 20 mililitros de tampão de fax gelado para lavar as células. Em seguida, use um mililitro de meio estimulante de micrófagos da medula óssea para ressuspender o pellet celular final após a contagem de células.

Coloquei dois mililitros de meio estimulante de micrófagos em cada poço de uma placa de 24 poços. Em seguida, adicione 200.000 células a cada poço, uma densidade celular que garantirá a cultura adequada de osteoclastos in vitro. Agite suavemente a placa e incubada a 37 graus Celsius sem trocar o meio por três dias.

Após o terceiro dia, troque o meio por meio de indução de osteoclastos da medula óssea e comece a trocá-lo diariamente por cinco a sete dias. Nesse ponto, grandes osteoclastos multinucleados devem ser visíveis. Consulte o protocolo de texto para coloração e o ensaio de reabsorção como visto aqui.

Um alto número de osteoclastos pode ser confirmado usando ensaio resistente ao tartarato. Os osteoclastos de coloração de fosfatatos são visualizados como grandes glóbulos roxos com múltiplos núcleos usando o protocolo demonstrado neste vídeo. É comum isolar osteoclastos com até 30 núcleos por célula.

O uso de uma superfície mineralizada é considerado o método padrão-ouro para avaliar a atividade de reabsorção de osteoclastos in vitro. Nesta figura, a microscopia de campo claro com ampliação de 10 x demonstra uma porcentagem de superfície mineralizada ou poços de reabsorção que são formados conforme delineado em preto, o que permite a determinação da capacidade de reabsorção dos osteoclastos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar de forma confiável um grande número de osteoclastos da medula óssea de camundongos.