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Advanced Biology

Culturas Neuronais Primárias

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Neuroscience

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Primary Neuronal Cultures

1.10: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience

1.15: An Introduction to Developmental Neurobiology

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08:43 min

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April 30, 2023

Overview

A complexidade do cérebro muitas vezes requer neurocientistas para usar um sistema mais simples para manipulações experimentais e observações. Uma abordagem poderosa é gerar uma cultura primária dissecando tecido do sistema nervoso, dissociando-o em células únicas, e cultivando essas células in vitro. As culturas primárias tornam os neurônios e a glia facilmente acessíveis às ferramentas experimentais necessárias para técnicas como manipulação genética e imagem de lapso de tempo. Além disso, essas culturas representam um ambiente altamente controlável para estudar fenômenos complexos, como interações células-células.

Este vídeo fornece uma visão geral dos principais passos na produção de culturas neuronais primárias, que incluem selecionar e dissecar o tecido de interesse, quebrar mecanicamente e quimicamente o tecido para produzir uma única suspensão celular, emplacar as células e manter as culturas na mídia apropriada. Vários exemplos também são apresentados para mostrar como células cultivadas podem ser usadas para investigar o tráfico de proteínas, alterações morfológicas e eletrofisiologia em neurônios vivos.

Procedure

O cérebro é um dos órgãos mais complexos do corpo, então neurocientistas muitas vezes precisam de um sistema mais simples para manipulações experimentais e observações. A cultura celular é um desses sistemas que permite fácil acesso a neurônios vivos. Em geral, cultivar células envolve cultuá-las em soluções especiais chamadas mídia cultural dentro de um ambiente estéril e controlável – geralmente uma incubadora quente. Uma cultura primária é aquela que é produzida a partir de tecido dissecado a partir de um organismo. Diferentes tipos de culturas neuronais primárias podem ser feitas a partir de uma variedade de animais, estágios de desenvolvimento e tecidos do sistema nervoso.

Este vídeo fornecerá uma introdução ao método de produção de culturas neuronais primárias e alguns dos experimentos, que comumente usam essas células.

Muitos dos modelos animais importantes para a pesquisa em neurociência podem ser usados para preparar culturas neuronais primárias. Com camundongos e ratos – dois dos mamíferos mais usados em pesquisas biomédicas – tecidos neuronais de embriões, filhotes recém-nascidos e adultos podem ser dissecados para cultivo. Embriões e filhotes perinatais são tipicamente preferidos, uma vez que as células cerebrais são imaturas e menos suscetíveis a danos.

Vários tecidos do sistema nervoso podem ser isolados e usados para produzir diferentes tipos de culturas neuronais primárias. Por exemplo, partes específicas do cérebro podem ser dissecadas, como o cerebelo, córtex e hipocampo. A medula espinhal ou componentes do sistema nervoso periférico, como o gânglio raiz dorsal, também podem ser dissecados e cultivados para cultivar tipos específicos de neurônios.

Independentemente da fonte tecidual, o método geral de produção de culturas neuronais primárias pode ser resumido em alguns passos principais: Dissecção, dissociação, chapeamento e manutenção.

Vamos começar uma revisão aprofundada dessas etapas com a primeira: Dissecção. Ao se preparar para as etapas de dissecção e cultivo, a esterilidade é fundamental para evitar que as culturas se contaminem. As ferramentas devem ser esterilizadas com álcool, e uma coifa de fluxo laminar é frequentemente usada para remover contaminantes no ar.

Para a cultura de neurônios roedores, o tecido deve ser removido de animais recém-eutanizados em uma solução de sal frio e tamponada. Usando um microscópio dissecando, partes menores do tecido – como o hipocampi – podem ser cuidadosamente isoladas para um processamento posterior.

Em seguida, é necessário dividir a amostra em seus componentes celulares em um processo conhecido como dissociação. O tecido dissecado é primeiro picado usando um bisturi ou uma tesoura. As peças de tecido resultantes são então transferidas para um novo recipiente. Uma enzima proteolítica como trippsina ou papain é adicionada para digerir as proteínas da matriz extracelular que unem as células. Após uma breve incubação em uma incubadora quente ou banho de água, os pedaços de tecido são suavemente lavados com tampão para remover as enzimas.

Os pedaços de tecido suavizado podem agora ser dissociados pela trituração, que envolve passar o tecido através de uma tubulação várias vezes para que as células sejam liberadas em uma única suspensão celular. Neste ponto, as células podem ser contadas para concentração e verificadas para viabilidade usando manchas como o azul Trypan, o que ajuda a determinar o quanto a suspensão deve ser diluída para um crescimento bem sucedido.

Finalmente, os neurônios estão prontos para a cultura! Vamos rever algumas medidas importantes que precisam ser tomadas para mantê-las vivas e saudáveis. A composição dos meios culturais que são usados para cultivar os neurônios é muito importante. Suplementos especiais que suportam a sobrevivência neuronal e o crescimento são geralmente adicionados à mídia. Outros aditivos podem incluir drogas que inibem a divisão de células não neuronais, como células gliais.

Depois que a suspensão das células neuronais é misturada com a mídia, as células estão prontas para serem banhadas nos recipientes desejados. Estes podem incluir pratos de cultura e pratos ou tampas de vidro colocados dentro desses recipientes. Como os neurônios não podem crescer diretamente no vidro, as tampas são tratadas com antecedência para criar melhores superfícies para o apego e crescimento celular. Esses tratamentos podem incluir revestimento com proteínas de matriz extracelular sintética; por exemplo, poli-lysina e laminina; ou gravura ácida para endurecer a superfície.

Uma vez banhados, os neurônios são cultivados dentro de uma incubadora quente e umidificada. O crescimento dos processos neuronais pode ser observado em horas a dias. Para manter as culturas, uma parte da mídia cultural é substituída por novas mídias cerca de uma vez por semana. Normalmente, culturas neuronais primárias são usadas para experimentos em qualquer lugar de alguns dias a algumas semanas após o revestimento.

Agora que você tem neurônios crescendo em culturas, o que você pode fazer com essas células?

Um método básico comumente aplicado às culturas neuronais é a manipulação genética por transfecção ou transdução viral. A codificação de materiais genéticos, por exemplo, uma proteína mutante, pode ser introduzida nos neurônios cultivados para alterar a função neuronal. Alternativamente, a transfecção com RNA duplamente encalhada é uma técnica eficaz para bloquear a expressão proteica. A disponibilidade de múltiplos métodos e reagentes para manipulação genética fazem deste um aplicativo particularmente valioso para uma ampla variedade de perguntas de pesquisa.

Uma pergunta de exemplo que pode ser abordada com transfesões em culturas neuronais é: Como e onde certas proteínas ou complexos proteicos são traficados para as várias estruturas morfológicas do neurônio? Para chegar à resposta, os neurônios são transfectados com DNA codificando a proteína de interesse, que pode ser fundida com uma proteína fluorescente, como proteína fluorescente verde ou GFP. Os padrões de movimento e a localização da proteína fluorescente pode então ser monitorada com imagens vivas. Este método pode ser usado para estudar, por exemplo, o tráfico de receptores neurotransmissores para a superfície celular.

Culturas neuronais primárias também são muito úteis para estudos de eletrofisiologia, nos quais a atividade elétrica de células únicas pode ser medida usando microeletrodos. A única camada de neurônios em uma cultura significa que as células individuais são fáceis de atingir, e manipulações como tratamentos farmacológicos são aplicadas de forma rápida e uniforme. Por exemplo, o efeito de um composto de teste na atividade de um único neurônio pode ser medido com a técnica de grampo de remendo em neurônios cultivados.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE às culturas neuronais primárias. Neste vídeo, demonstramos como essas culturas são preparadas e os tipos de experimentos para os quais são comumente usados. Culturas neuronais primárias podem ser feitas a partir de uma grande variedade de fontes de tecido, tipicamente usando um método que envolve dissecção, dissociação em uma suspensão celular e crescimento em meios culturais em incubadoras.

Obrigado por assistir!

Transcript

The brain is one of the most complex organs in the body, so neuroscientists often need a simpler system for experimental manipulations and observations. Cell culturing is one such system that enables easy access to living neurons. In general, culturing cells involves growing them in special solutions called culture media within a sterile, controllable environment – usually a warm incubator. A primary culture is one that is produced from tissue dissected from an organism. Different types of primary neuronal cultures can be made from a variety of animals, developmental stages and nervous system tissues.

This video will provide an introduction to the method of producing primary neuronal cultures and some of the experiments, which commonly use these cells.

Many of the animal models important to neuroscience research can be used to prepare primary neuronal cultures. With mice and rats – two of the most commonly used mammals in biomedical research – neuronal tissue from embryos, newborn pups, and adults can be dissected for culturing. Embryos and perinatal pups are typically preferred since the brain cells are immature and less susceptible to damage.

Various nervous system tissues can be isolated and used to produce different types of primary neuronal cultures. For example, specific parts of the brain can be dissected, such as the cerebellum, cortex and hippocampus. The spinal cord or components of the peripheral nervous system, such as the dorsal root ganglia, can also be dissected and cultured to grow specific types of neurons.

Regardless of the tissue source, the general method for producing primary neuronal cultures can be summarized in a few major steps: Dissection, dissociation, plating, and maintenance.

Let’s begin an in-depth review of these steps with the first one: Dissection. In preparing for the dissection and culturing steps, sterility is critical to prevent cultures from becoming contaminated. Tools must be sterilized with alcohol, and a laminar flow hood is often used to remove airborne contaminants.

For culturing rodent neurons, tissue should be removed from freshly euthanized animals into a cold, buffered salt solution. Using a dissecting microscope, smaller parts of the tissue – such as the hippocampi – can be carefully isolated for further processing.

Next, it’s necessary to break the sample down into its cellular components in a process known as dissociation. The dissected tissue is first minced using a scalpel or scissors. The resulting tissue pieces are then transferred to a new container. A proteolytic enzyme such as trypsin or papain is then added to digest the extracellular matrix proteins that bind the cells together. Following a short incubation in a warm incubator or water bath, the tissue pieces are gently washed with buffer to remove the enzymes.

The softened tissue pieces can now be dissociated by trituration, which involves passing the tissue through a pipet multiple times so that the cells are freed into a single cell suspension. At this point, the cells can be counted for concentration and checked for viability using stains like Trypan blue, which helps determine how much the suspension should be diluted for successful growth.

At last, the neurons are ready for culture! Let’s review some important measures that need to be taken in order to keep them alive and healthy. The composition of the culture media that is used to grow the neurons is very important. Special supplements that support neuronal survival and growth are usually added to the media. Other additives can include drugs that inhibit the division of non-neuronal cells such as glial cells.

After the neuronal cell suspension is mixed with the media, the cells are ready to be plated in the desired containers. These can include culture dishes and plates or glass coverslips placed inside these containers. Since neurons cannot grow directly on glass, the coverslips are treated beforehand to create better surfaces for cell attachment and growth. These treatments can include coating with synthetic extracellular matrix proteins; for example, poly-lysine and laminin; or acid etching to roughen the surface.

Once plated, the neurons are grown inside a warm, humidified incubator. The growth of neuronal processes can be observed within hours to days. To maintain the cultures, a portion of the culture media is replaced with fresh media about once a week. Typically, primary neuronal cultures are used for experiments anywhere from a few days to a few weeks after plating.

Now that you have neurons growing in cultures, what can you do with these cells?

One basic method commonly applied to neuronal cultures is genetic manipulation by transfection or viral transduction. Genetic material encoding, for example, a mutant protein, can be introduced into the cultured neurons to alter neuronal function. Alternatively, transfection with double stranded RNA is an effective technique for blocking protein expression. The availability of multiple methods and reagents for genetic manipulation make this a particularly valuable application for a wide variety of research questions.

An example question that can be addressed with transfections in neuronal cultures is: How and where are certain proteins or protein complexes trafficked to the neuron’s various morphological structures? To get at the answer, neurons are transfected with DNA encoding the protein of interest, which can be fused with a fluorescent protein such as green fluorescent protein or GFP. The movement patterns and localization of the fluorescently-tagged protein can then be monitored with live imaging. This method can be used to study, for example, the trafficking of neurotransmitter receptors to the cell surface.

Primary neuronal cultures are also very useful for electrophysiology studies, in which the electrical activity of single cells can be measured using microelectrodes. The single layer of neurons in a culture means that individual cells are easy to target, and manipulations such as pharmacological treatments are quickly and evenly applied. For example, the effect of a test compound on a single neuron’s activity can be measured with the patch clamp technique in cultured neurons.

You’ve just watched JoVE’s introduction to primary neuronal cultures. In this video, we’ve demonstrated how these cultures are prepared and the types of experiments for which they’re commonly used. Primary neuronal cultures can be made from a wide variety of tissue sources, typically using a method that involves dissection, dissociation into a cell suspension, and growing in culture media in incubators.

Thanks for watching!

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