Radial Mobilidade e função citotóxica de Retroviral Replicando Vector transduzidas, Alloresponsive não aderentes Linfócitos T

O objetivo geral do experimento a seguir é mostrar a migração de linfócitos T efetores não aderentes sobre uma monocamada de células tumorais aderentes. Isso é conseguido estabelecendo primeiro uma monocamada de células tumorais aderentes nos poços de lâminas mascaradas de Teflon revestidas com poli D lisina como um efetor marcado com fluorescência na segunda etapa, os linfócitos T são sedimentados no centro da monocamada usando um coletor de sedimentação celular. Em seguida, a microscopia de luz e fluorescência é usada para visualizar a migração das células não aderentes sobre a monocamada.

Os resultados mostram que a migração e as funções efetoras de linfócitos T não aderentes em co-cultura com uma monocamada de células tumorais aderentes são mantidas após os linfócitos terem sido transduzidos com um vetor retroviral. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes é que a migração radial de linfócitos T efetores não aderentes pode ser medida em cultura de carvão com células tumorais aderentes. Isso tem implicações de longo alcance para pacientes com tumores cerebrais primários ou metastáticos porque os linfócitos T citotóxicos alogênicos que são modificados para expressar um gene ativador pró-droga, como a citosina desaminase, estão sendo testados como uma abordagem multimodal para eliminar o tumor no cérebro.

Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldade em estabelecer monocamadas de células tumorais aderentes devido à heterogeneidade do crescimento de células tumorais nas características de adesão. A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas para gerar uma monocamada tumoral uniforme e uma sedimentação eficaz de L-O-C-T-L não aderente requerem uma compreensão experiente das características de ambos os tipos de células. Para começar, coloque até quatro esterilizados.

10 lâminas revestidas de Teflon em uma placa de Petri estéril de 150 milímetros por 15 milímetros. Coloque uma placa de Petri de 35 milímetros por 10 milímetros contendo dois a três mililitros de água estéril ao lado das lâminas para fornecer umidade. Em seguida, precifique as lâminas cobrindo cada poço com uma solução de 100 microgramas por mililitro de poli D licina ou poli L lisina.

Incubar as lâminas durante uma hora à temperatura ambiente, aspirar a solução e enxaguar a superfície do poço duas vezes com PBS com os alvéolos de amostra preparados. Colha um frasco confluente de células tumorais aderentes. Conte o número de células viáveis por microscopia óptica e, em seguida, suspenda as células a uma concentração de cinco vezes 10 elevado a seis células por mililitro.

Em meio de crescimento tamponado, adicione cinco a 10 microlitros da suspensão celular a cada poço, dependendo do tipo de célula tumoral, aumente o volume do poço para 40 microlitros com meio e pipete para cima e para baixo lentamente para distribuir uniformemente as células. Após a semeadura dos poços, deixe as células tumorais assentarem em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, coloque a tampa na placa de Petri e transfira-a cuidadosamente para uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono incubada por pelo menos 24 horas.

Troque o meio de cultura nos poços diariamente, removendo cuidadosamente parte do meio da monocamada e substituindo-o por um volume maior de meio de células T completo fresco. As células normalmente serão confluentes dentro de um a três dias para preparar as células para sedimentação na monocamada de células tumorais. Colha as células T não aderentes e marque-as com um corante de proliferação celular de acordo com o protocolo do fabricante pelo menos uma hora antes do ensaio.

Em seguida, coloque a câmara umidificada contendo as lâminas de células tumorais no gabinete de segurança biológica. Lave os poços com PBS pipetando e, em seguida, adicione 45 microlitros de meio completo com 10% de soro aos poços. Deslize um coletor de sedimentação de células esterilizadas sobre os poços até que o gancho na extremidade do coletor toque o fundo da lâmina.

Certifique-se de que o meio esteja visível nos canais do coletor. Em seguida, conte as células não aderentes e suspenda-as em uma a duas vezes 10 elevado a quinto. Células por microlitro no meio.

Interrompa suavemente as células para eliminar quaisquer aglomerados de células que possam interferir na sedimentação celular. Pipetar lentamente um microlitro da suspensão celular para o canal do coletor para cada um. Bem, então incube o aparelho em temperatura ambiente por 20 a 30 minutos para permitir que as células do canal se assentem na monocamada.

Depois que as células se acomodarem, levante suavemente o coletor para cima sem tocar na corrediça. Certifique-se de que os pellets de células estejam encaixados dentro da circunferência do canal do coletor. Usando um microscópio, as células assentadas devem aderir ligeiramente à monocamada para que mover suavemente a lâmina não disperse o pellet.

Depois de confirmar que as células sedimentaram, transfira a lâmina para um microscópio invertido equipado com uma câmara de dióxido de carbono e umidade. Use a objetiva de quatro x para imagens fluorescentes de campo claro e multicanal das células. Adquira imagens de uma determinada área em canais de campo claro e fluorescentes e, em seguida, adicione barras de mícron com software de captura de imagem.

Armazene a lâmina em uma incubadora umidificada entre os pontos de tempo, uma vez que todos os pontos de tempo sejam adquiridos. Arraste e solte os arquivos de imagem no programa de edição de imagens e selecione a opção adicionar camada para criar um arquivo de imagem com várias camadas. Mescle a luz e as imagens fluorescentes em uma camada.

Use o software de aquisição para tirar fotos de uma área de oito milímetros por oito milímetros. O software deve ser configurado para unir as imagens capturadas automaticamente usando o canal que é melhor representado em todo o poço. Se apenas canais de fluorescência forem visualizados, este deve ser o canal para obter imagens das células aderentes.

Alternativamente, as imagens podem ser costuradas usando um software de edição de imagem. Isso é feito alinhando regiões das imagens que são conservadas de uma imagem para outra e sobrepondo as imagens umas sobre as outras até que uma imagem completa seja gerada. Junte as imagens usando o software de imagem.

Use as imagens combinadas para fazer mapas de fluorescência de intensidade de superfície com o software Image J para visualizar a agregação de células T fluorescentes ou se espalhar ao longo do tempo. Os linfócitos T citotóxicos alo-reais humanos conhecidos como Allo CTL transduzidos, com um vetor retroviral competente para replicação que codifica um gene de expressão de proteína fluorescente verde esmeralda, estavam assentados no centro de uma monocamada de células de glioma. Após quatro horas, todos os OCTL formaram agregados visíveis em 24 horas.

Manchas vazias apareceram na monocamada de células aderentes, indicando lise das células tumorais e alguns allo CTL migraram além da borda de ataque. Allo CTL murino marcado com fluorescência estava sentado no centro de uma camada mono de células de glioma marcadas com fluorescência da gripe em uma hora Allo CTL intimamente associado às células de glioma por 48 horas, Allo CTL havia migrado para longe do centro da intensidade da superfície da camada mono. Mapas de fluorescência foram gerados a partir dessas imagens com o software de imagem J e mostram uma migração substancial para longe do centro após 48 horas.

É importante trocar o meio de cultura diariamente para a monocamada de células tumorais para manter condições de cultura saudáveis. Além disso, uma vez dominado, a sedimentação de células não aderentes deve levar cerca de 20 minutos Após este procedimento. Outros métodos, como o rastreamento do caminho celular, podem ser usados para responder a perguntas sobre a taxa na qual o allo CTL migra através da monocamada ou o tempo em que estão em contato com as células tumorais que desempenham suas funções citotóxicas.

Este protocolo ajudará os pesquisadores no campo da terapia imunogênica a explorar a migração de linfócitos T modificados por genes em cocultura com células tumorais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar células não aderentes e aderentes por cocultura e como usar o coletor de sedimentação celular para estudar a migração radial horizontal de células não aderentes sobre a monocamada de células tumorais.