Radial Mobilidade e função citotóxica de Retroviral Replicando Vector transduzidas, Alloresponsive não aderentes Linfócitos T

O objetivo geral do seguinte experimento é demonstrar a migração de linfócitos T efetores não aderentes sobre uma monocamada de células tumorais aderentes. Isso é conseguido primeiramente estabelecendo uma monocamada de células tumorais aderentes nos poços de lâminas de teflon mascaradas e revestidas com poli D lisina; como segundo passo, linfócitos T efetores marcados com fluorescência são sedimentados no centro da monocamada utilizando um manifold de sedimentação celular. Em seguida, microscopia de luz e de fluorescência são utilizadas para visualizar a migração das células não aderentes sobre a monocamada.

Os resultados mostram que a migração e as funções efetoras de linfócitos T não aderentes em co-cultura com uma monocamada de células tumorais aderentes são mantidas após os linfócitos terem sido transduzidos com um vetor retroviral. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que a migração radial de linfócitos T efetores não aderentes pode ser medida em co-cultura com células tumorais aderentes. Isso tem implicações significativas para pacientes com tumores cerebrais primários ou metastáticos, pois linfócitos T citotóxicos alogênicos modificados para expressar um gene ativador de pró-fármaco, como a citosina desaminase, estão sendo testados como uma abordagem multmodal para eliminar tumores no cérebro.

Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldade em estabelecer monocamadas de células tumorais aderentes devido à heterogeneidade do crescimento celular tumoral em relação às características de aderência. A demonstração visual deste método é essencial, pois os passos para gerar uma monocamada tumoral uniforme e uma sedimentação eficaz das L-O-C-T-L não aderentes requerem um entendimento experiente das características de ambos os tipos celulares. Para começar, coloque até quatro esterilizados.

Lâminas de Teflon revestidas com 10 poços em uma placa de Petri estéril de 150 milímetros por 15 milímetros. Coloque uma placa de Petri de 35 milímetros por 10 milímetros contendo dois a três mililitros de água estéril ao lado das lâminas para fornecer umidade. Em seguida, pré-trate as lâminas cobrindo cada poço com uma solução de 100 microgramas por mililitro de poli-D-lisina ou poli-L-lisina.

Incube as lâminas por uma hora à temperatura ambiente, depois aspire a solução e enxágue a superfície do poço duas vezes com PBS com os poços da amostra preparados. Colete um frasco confluente de células tumorais aderentes. Conte o número de células viáveis por microscopia de luz e, em seguida, suspenda as células em uma concentração de cinco vezes 10 à sexta células por mililitro.

No meio de crescimento tamponado, adicione de cinco a 10 microlitros da suspensão celular a cada poço, conforme o tipo de célula tumoral, complete o volume do poço até 40 microlitros com meio e pipete lentamente para cima e para baixo para distribuir as células uniformemente. Após a semeadura dos poços, deixe as células tumorais sedimentarem à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, coloque a tampa na placa de Petri e transfira-a cuidadosamente para uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de dióxido de carbono e incube por pelo menos 24 horas.

Altere o meio de cultura dos poços diariamente, removendo cuidadosamente parte do meio do monocamada e substituindo-o por um volume maior de meio completo para linfócitos T fresco. Normalmente, as células atingirão confluência em um a três dias para preparar as células para sedimentação sobre o monocamada de células tumorais. Recolha os linfócitos T não aderentes e marque-os com um corante de proliferação celular de acordo com o protocolo do fabricante, pelo menos uma hora antes do ensaio.

Em seguida, coloque a câmara umidificada contendo as lâminas com células tumorais dentro da cabine de segurança biológica. Lave os poços com PBS por pipetagem e, então, adicione 45 microlitros de meio completo com 10% de soro aos poços. Deslize um manifold esterilizado de sedimentação celular sobre os poços até que o gancho na extremidade do manifold toque o fundo da lâmina.

Certifique-se de que o meio seja visível nos canais do manifold. Em seguida, conte as células não aderentes e as suspenda em uma a duas vezes 10 à quinta. Células por microlitro no meio.

Disperse suavemente as células para eliminar quaisquer aglomerados celulares que possam interferir na sedimentação celular. Pipete lentamente um microlitro da suspensão celular no canal do manifold para cada poço. Em seguida, incube o aparelho à temperatura ambiente por 20 a 30 minutos para permitir que as células no canal sedimentem sobre a monocamada.

Após as células terem sedimentado, levante cuidadosamente o manifold verticalmente sem tocar a lâmina. Certifique-se de que os pellets celulares tenham assentado dentro da circunferência do canal do manifold. Usando um microscópio, as células assentadas devem aderir levemente à monocamada, de modo que mover suavemente a lâmina não dispersará o pellet.

Após confirmar que as células sedimentaram, transfira a lâmina para um microscópio invertido equipado com câmara de dióxido de carbono e umidade. Utilize a objetiva de quatro x para imagens em campo claro e fluorescência multicanal das células. Adquira imagens de uma área específica em canais de campo claro e fluorescência, e então adicione barras de micrômetros com o software de captura de imagens.

Armazene a lâmina em um incubador umidificado entre os pontos temporais após a aquisição de todos os pontos temporais. Arraste e solte os arquivos de imagem no programa de edição de imagens e selecione a opção adicionar camada para criar um arquivo de imagem com múltiplas camadas. Una as imagens claras e as imagens fluorescentes em uma única camada.

Utilize o software de aquisição para capturar imagens de uma área de oito milímetros por oito milímetros. O software deve ser configurado para unir automaticamente as imagens capturadas usando o canal que é melhor representado em toda a placa. Se forem adquiridos apenas canais de fluorescência, este deve ser o canal para aquisição das células aderentes.

Alternativamente, as imagens podem ser unidas usando um software de edição de imagens. Isso é feito alinhando regiões das imagens que são conservadas de uma imagem para outra e sobrepondo as imagens umas sobre as outras até que uma imagem completa seja gerada. Una as imagens utilizando o software de imagens.

Utilize as imagens combinadas para criar mapas de intensidade de superfície de fluorescência com o software Image J, a fim de visualizar a agregação ou disseminação de linfócitos T fluorescentes ao longo do tempo. Linfócitos T citotóxicos alocitotóxicos humanos, conhecidos como Allo CTL, transduzidos com um vetor retroviral com capacidade de replicação que codifica um gene de expressão da proteína fluorescente verde esmeralda, foram colocados no centro de uma monocamada de células de glioma. Após quatro horas, os Allo CTL tinham formado agregados visíveis em 24 horas.

Apareceram áreas vazias na monocamada de células aderentes, indicando lise das células tumorais, e alguns CTL alogênicos haviam migrado além da borda anterior. CTL alogênicos murinos marcados com fluorescência foram posicionados no centro de uma monocamada de células de glioma marcadas com fluorescência após uma hora; após 48 horas, os CTL alogênicos estavam fortemente associados às células de glioma e haviam migrado para fora do centro da superfície da monocamada. Mapas de fluorescência foram gerados a partir dessas imagens com o software ImageJ e mostram migração substancial para fora do centro após 48 horas.

É importante trocar o meio de cultura diariamente para a monocamada de células tumorais, a fim de manter condições de cultura saudáveis. Além disso, uma vez dominado, o processo de sedimentação das células não aderentes deve levar cerca de 20 minutos após este procedimento. Outros métodos, como o rastreamento do trajeto celular, podem ser utilizados para responder perguntas sobre a taxa na qual os CTL alogênicos migram através da monocamada ou o tempo que permanecem em contato com as células tumorais exercendo suas funções citotóxicas.

Este protocolo ajudará pesquisadores na área de terapia gênica imunológica a explorar a migração de linfócitos T modificados geneticamente em co-cultivo com células tumorais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar células não aderentes e aderentes por co-cultivo e de como usar o manifold de sedimentação celular para estudar a migração radial horizontal de células não aderentes sobre uma monocamada de células tumorais.