Name: Radial Mobilidade e função citotóxica de Retroviral Replicando Vector transduzidas, Alloresponsive não aderentes Linfócitos T (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Aprenda a monitorar a migração radial de linfócitos T efetores não aderentes sobre monocamadas de células tumorais usando um manifold de sedimentação celular. Este método permite visualizar a mobilidade imunológica por microscopia de fluorescência.

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Apoiado em parte pelo NIH R01 CA121258, CA125244 R01, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI Grant Número UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, e do Fundo de Investigação Holmes Memorial Joan S.. MJH e GCO recebeu suporte do Joan S. Holmes Memorial pós-doutorado na Universidade da Califórnia. O dispositivo CSM foi obtido da Creative métodos científicos: www.creative-sci.com. O vector lentiviral foi recebido a partir da UCLA Vector Core, que é suportado por CURA / P30 DK041301.

1. Deslize Preparação <ol><li> Insira os slides Manifold sedimentação celular em bolsas de esterilização e selar com fita crepe. Vire o lado revestido de Teflon da corrediça do lado do papel a da bolsa para evitar depósitos de plástico nos poços. </li><li> Bolsas de autoclave durante 15 min a 121 ° C. </li><li> Remover slide da bolsa de esterilização dentro de uma cabine de segurança biológica e coloque em um estéril 150 x 15 mm estéril placa de Petri. Até quatro lâminas pode caber por prato. Coloque um 35 x 10 mm placa de Petri ao lado dos slides. Adicionar 2-3 ml de H 2 O estéril para proporcionar humidificação. </li><li> Lâminas pré-revestimento com poli-D-lisina a 100 mg / ml usando um volume suficiente para cobrir a totalidade bem. Depois de uma hora, à temperatura ambiente, aspirar a solução e lavar a superfície do poço duas vezes por pipetagem de 1x PBS sobre a superfície dos poços. </li><li> Opcionalmente, adiciona fibronectina ou outros componentes da matriz extracelular para assegurar uma maior aderência das células do tumor. Adicionar fibronectina a 5 jig / ml em volumes suficientes that os poços não seca dentro de um curto período de tempo à temperatura ambiente. <ol><li> Após 1 hora, aspirar a solução de sobra e lavar duas vezes por pipetagem cima e para baixo com 1x PBS. </li></ol></li><li> Manter PBS aos poços até tumor está pronto para a galvanização. Uso desliza no mesmo dia. </li><li> Colheita de um balão confluente do tipo de células de tumor aderentes desejado. Contagem de células viáveis ​​usando corante Trypan Blue exclusão por microscopia de luz e ressuspender em 5 x 10 6 células / ml em meio de crescimento, por exemplo adequadamente tamponada, meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS), L glutamina e piruvato de sódio. </li><li> Se imagiologia de fluorescência da população de células aderentes se desejado, rotular a população de células aderentes com um corante fluorescente ou um corante vital proliferação de células, seguindo os protocolos fornecidos pelo fabricante. </li><li> Suavemente pipeta 10 ul de meio completo em cada cavidade da lâmina, tendo o cuidado de evitar a criação de bolhas na microcavidadels, pois estes podem impedir a adesão de células tumorais uniforme. </li><li> Adicionar 2,5-5,0 x 10 4 células (5-10 ul de suspensão de células) para o meio em cada poço (Figura 1A). Ajustar o número óptimo dependendo do tipo de célula de tumor e o número de dias de crescimento desejados. Células tumorais maiores ou com células em crescimento rápido pode exigir menor quantidade de células inicialmente. Traga bem volume de até 40 mL, adicionando médio e pipeta cima e para baixo para assegurar uma distribuição uniforme das células. </li><li> Depois de todas as cavidades são semeadas, permitir que as células tumorais a aderir à TA, em seguida, colocar a tampa na de 150 x 15 mm numa caixa de Petri e cuidadosamente mover o prato para uma incubadora humidificada a 37 ° C / 5% de CO 2 durante pelo menos 24 horas. </li><li> Alterar o meio de cultura diária. Pipetagem cuidadosa de uma porção do meio gasto a partir da monocamada e substitua com meio completo fresco. NOTA: Por causa da evaporação, mais volume terá de ser adicionado do que foi retirado. Wells estará pronto para o ensaio quando um mesmo, conflefluente camada de células está presente. Este é tipicamente de 1-3 dias após a sementeira inicial. </li><li> Lavar monocamada suavemente uma vez com PBS como descrito no passo 1.4 e prosseguir para a etapa 2, se monocamadas são desejados, ou para o passo 1.13 abaixo para extrair proteínas da MEC da monocamada. </li><li> Adicione uma solução de 0,5% de Triton-X (v / v) em meio completo e adicionar 30 ul a cada poço. Deixe monocamada digerir na capa durante 2 min, em seguida, lavar duas vezes com meio completo por pipetagem como descrito acima. NOTA: A camada de ECM podem ser visíveis por microscopia de luz (Figura 2). Use os slides imediatamente, ou manter-se em meio completo no umidificado incubadora de CO 2 por 1-2 dias. Não permitir que os poços para secar. </li></ol> 2. A sedimentação de células T não aderentes Onto Deslize <ol><li> Se imagiologia de fluorescência da população de células não aderentes for desejado, rotular as populações de células não aderentes com um corante fluorescente vitais, tais como CFSE, Cell Rastreio Vermelho CMPTX, ou eFluor670, seguindo os protocolos fornecidos pelo fabricante, pelo menos, 1 hora antes do ensaio. Alternativamente, manipular as células para expressar proteínas fluorescentes codificados por vectores virais. </li><li> Autoclave o colector de sedimentação de células numa bolsa de autoclave tal como descrito no ponto 1.2 acima. </li><li> Retire a câmara úmida contendo lâminas revestidas de Teflon da incubadora e lugar na cabine de segurança biológica. </li><li> Lave os poços com PBS 1x por pipetagem cima e para baixo, em seguida, adicione 45 mL de meio completo, contendo pelo menos 10% de soro. </li><li> Remover o colector do envelope de esterilização e cuidadosamente deslizar ao longo dos poços até o &#39;gancho&#39; no final do colector toca o fundo da corrediça (Figura 1B). </li><li> Certifique-se de que o meio de cultura é visível em cada um dos canais. Se nenhum for visto, tirar o colector e adicionar mais meio para o correspondente bem, em seguida, substituir e verificar novamente. </li><li> Repita o passo 2,5 para cada channel do colector, ou para o maior número de poços, como desejado. </li><li> Contagem de células não-aderentes e ressuspender em não menos do que 1,0-2,0 x 10 5 / ul. Desenha-se 1 ml de células e pipeta-los lentamente no interior do canal (Figura 1C). Faça isso para cada bem desejar. </li><li> Deixar todo o aparelho carregado de células, isto é, o colector e corrediça, no interior da bio-capuz durante 20-30 minutos para permitir que as células do canal para assentar. </li><li> Remover o colector tocando ambas as extremidades e suavemente levantando-o da lâmina de modo a não perturbar as células semeadas focal no centro das cavidades (Figura 1D). </li><li> Inspeccionar cada poço para assegurar que as células não aderentes foram semeados com sucesso no centro do poço ficar dentro da circunferência do canal colector. As células não aderentes irá aderir idealmente ligeiramente à monocamada ou ECM e uns com os outros, por conseguinte, se mover ligeiramente as lâminas em torno não fará com que a célula Pellet para dispersar. Não disputam o slide. </li></ol> 3. Microscopia de Fluorescência <ol><li> Com um equipamento experimental adequado, realizar a imagem após a sedimentação é confirmado. Idealmente, usar um microscópio que está equipado com uma câmara de CO2 e humidade. Imagem com baixa potência, ou seja, 4X ou 10X, para permitir imagens múltiplas para ser tomado de uma área maior, de modo que a totalidade do bem pode ser visto. </li><li> Aquisição de imagens digitais usando software de captura de imagem. Realizar campo claro e / ou multi-canal de imagens por fluorescência. </li><li> Se desejar, configure um lapso de tempo para gravar imagens em diferentes canais sobre uma determinada área, ou manter o slide umidificado e em uma temperatura de 37 ° C / 5% de CO2 e manualmente tirar a imagem nos momentos desejados (Figura 1E &amp; F, recomendado para pontos de tempo mais longos). </li></ol> 4. Análise e Visualização <ol><li> Usando software de edição de imagem, luz e fl mesclaruorescent imagens em uma camada de modo a vários tipos de células e de marcadores pode ser visto na mesma imagem. Arraste e solte os arquivos de imagem para cada cor individual para o programa e, quando solicitado, selecione a opção &quot;Add Layer&quot; para criar um arquivo de imagem com várias camadas. <ol><li> Na maior ampliação, tome, alinhar e costurar as imagens de todo o bem digitalmente. Alinhar arquivos por olhando para regiões conservadas entre as duas imagens e sobrepondo uma imagem em cima da outra, até que um quadro completo é gerado. </li></ol></li><li> Adicionar bares mícron de imagens durante a aquisição utilizando o software de captura para determinar a distância células individuais têm migrado. </li><li> Para determinar a migração de células em vários momentos, fazer mapas de intensidade de fluorescência superfície com software de imagem, ou seja, ImageJ, para quantificar a agregação de células T fluorescente ou espalhar ao longo do tempo. <ol><li> Para gerar terrenos de superfície, dê uma imagem em camadas gerado na etapa 4.1 e sob a janela Layers,desmarque todas as camadas, exceto aqueles correspondentes ao canal desejado. Por exemplo, se uma parcela de superfície é desejada para visualizar a expressão de EMD, apenas as camadas &quot;verdes&quot; correspondentes ao filtro usado para este marcador deve ser visível. </li><li> Achatar a imagem e salvá-lo em um formato de arquivo reconhecido (por exemplo, .png) e carregar a imagem no programa. Para gerar a plotagem de superfície, altere o tipo de imagem para 8 bits, alterar o brilho / contraste conforme necessário para reduzir o fundo, e selecione a opção &quot;Analisar / Surface Plot &#39;. As imagens na Figura 5 foram geradas, verificando o &quot;Sombra&quot;, &quot;Desenhe Axis &#39;,&#39; One Polygon Per Line &#39;, e caixas de seleção&#39; Smooth &#39;. </li><li> Em alternativa, tomar medidas utilizando o raio ou o diâmetro do depósito celular focal no tempo zero e comparar com as células no ponto mais externo em momentos diferentes. O diâmetro do Teflon poços é de 6,0 mm. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

As células tumorais em uma única suspensão de células foram pipetadas para os poços de uma lâmina de Teflon-mascarado. As células foram deixadas aderir e, em seguida, formado monocamadas numa atmosfera humidificada com 5% de CO2, 37 ° C incubadora (Figura 1A). Monocamadas estabelecidas ou proteínas da MEC derivados de monocamada podiam ser colhidas para estes ensaios (Figura 1B). Linfócitos T efectoras marcadas com corantes fluorescentes vitais ou transduzidas com vectores qu...

O ensaio de migração celular radial monocamada foi originalmente desenvolvido para medir as propriedades infiltrativas de células tumorais aderentes 1-4 em lâminas revestidas com matriz extracelular (ECM) 5-7 proteínas ou com componentes de ECM individuais, tais como fibronectina ou laminina 1,2. A técnica de semeadura envolvida uma única suspensão celular de células de tumor no centro de poços, utilizando um colector de células de sedimentação aço inoxidável (CSM). Após a sedimentação, as células tumorais se aderir ao fundo do poço e a mudança no diâmetro da população inicial de células ao longo do tempo foi usada para estabelecer uma taxa de motilidade horizontal. O ensaio de migração celular Radial Monolayer proporcionaram uma vantagem visual sobre outros métodos existentes que empregavam transwell placas de ensaio in vitro os recursos migratórios de células; estes ensaios não são propícias à geração de imagens 8. Como assim, ele também forneceu uma grande quantidade de liberdade na escolha do timepointé quando a migração é avaliada, sem limite do número de pontos no tempo um pesquisador pode optar por imagem após a sedimentação. Porque a capacidade de migrar é uma funcionalidade importante para as células não aderentes, em especial na área da imunoterapia ou onde eles podem ser utilizados como veículos de administração para os vectores virais, nós adaptamos o uso do MCS para avaliar a migração de células não-aderentes tipos sobre monocamadas de células de tumor, além das proteínas de ECM. O benefício adicional de microscopicamente visualizando a migração de células não-aderentes em monocamadas de células tumorais viáveis, em ECM complexo isolado a partir do tumor, ou sobre os componentes da ECM individuais torna este ensaio versátil. Os ensaios que utilizam poços revestidos com uma única proteína extracelular não refletem exatamente o substrato tecido ECM ou tumor das células que migram através in vivo. Aqui, usamos alorreativas linfócitos T citotóxicos (alloCTL), sensibilizados a major histocompcomplexo atibility (MHC) proteínas utilizando reacções unidireccional mista de linfócitos de células de tumor (MLTR) ou reacções de linfócitos mistos (MLR) 9, como o nosso tipo de células não-aderentes representativo. Testamos células de origem humana e murina. Quando a migração foi medida em monocamadas de tumor, as células tumorais utilizadas foram alvos ou parcialmente relevantes, exibindo algumas das mesmas proteínas MHC encontrados na população de células usadas para sensibilizar as efetoras, ou alvos totalmente pertinentes, com um conjunto completo de moléculas MHC que o efetores foram sensibilizados no sentido. Em algumas experiências, foi utilizado CellTracker fluorescente vermelha CMPTX ou corante proliferação celular eFluor 670 para diferenciar entre células efectoras e alvo. Utilizou-se também a transdução com vectores virais para codificação de proteínas fluorescentes como uma forma adicional de visualizar as células. Para certos ensaios, nós transduced o alloCTL com vetores retrovirais replicantes (RRV) que codificam para o verde esmeralda (EMD) proteína fluorescente 10,11; para others, as células tumorais foram transduzidas com vectores lentivirais que codificam para mStrawberry. O alloCTL foram semeadas por meio de um canal do colector para o centro de qualquer monocamadas de células tumorais ou de ECM colhidas a partir de monocamadas de células de tumor. Interacções de células aderentes e não aderentes foram visualizadas por luz e / ou por microscopia de fluorescência ao longo do tempo. Perturbação na monocamada de células tumorais em baixa potência, ou tumorais células com núcleos fragmentados em alta potência foram indicadores de lesão celular por lise e apoptose, respectivamente. Nós digitalmente criados mapas de intensidade fluorescente superfície que mostram a migração de células fluorescentes T não aderentes sobre as culturas em monocamada. Observamos, também, a citotoxicidade engendrado para a monocamada de células de glioma aderente após a formação do cluster do alloCTL não aderente sobreposta. Assim, foi observada a transdução horizontal de RRV-EMD do alloCTL à monocamada de glioma.

<table><tbody><tr><td>Lâminas de microscópio mascaradas de teflon</td><td>Creative Scientific Methods</td><td>CSM002</td><td></td></tr><tr><td>Coletor de sedimentação celular</td><td>Creative Scientific Methods</td><td>CSM001</td><td></td></tr><tr>Placa de Petri, Placa <td>de Petri 430597</td><td></td><td>Corning</td><td>de 150 mm</td></tr>, Solução salina tamponada com fosfato de <tr><td>430588</td><td></td><td>Corning</td> de<td>35 mm</td></tr><tr><td>(PBS)</td> <td>Mediatech</td><td>21-040</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l ponteiras de pipeta</td><td>VWR</td><td>89003-060</td><td></td></tr><tr><td>Água destilada e desionizada (estéril)</td><td>Mediatech</td><td>25-055</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Mediatech</td><td>25-054-CL</td><td></td></tr><tr><td>Celltracker Red CMPTX</td><td>Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (opcional)</td><td>Gibco</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>Meios de cultura de células tumorais (e.g. DMEM)</td><td>Mediatech</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>AIM-V mídia sem soro</td><td>Invitrogen</td><td>12055-083</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td><td></td>invertido</tr><tr><td>SPOT Instrumentos</td><td></td><td></td><td>de Diagnóstico</td> Avançado</tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>BD</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>31/2 x 51/4 Autoclave Pouches</td><td>Crosstex</td><td>SCXS2</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Mediatech</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Cell Proliferation eFluor 670 eBioscience</td><td></td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

radial mobilidade e função citotóxica de retroviral replicando vector transduzidas, alloresponsive não aderentes linfócitos t

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

Relatamos uma nova adaptação do ensaio de migração celular radial monocamada, relatada pela primeira vez para medir a migração radial das células tumorais aderentes em proteínas de matriz extracelular, para medir a motilidade das células imunitárias fluorescentemente marcado, humano ou não-aderente efectoras de murino. Esta técnica utiliza um colector de aço inoxidável e 10 bem corrediça de Teflon para focalmente depositar as células T não-aderentes preparadas em poços quer com monocamadas confluentes de células de tumor ou proteínas da matriz extracelular. Microscopia de fluorescência de luz e / ou multi-canal é usado para rastrear o movimento eo comportamento das células efetoras ao longo do tempo. Corantes fluorescentes e / ou vectores virais que codificam transgenes fluorescentes são usados ​​para marcar diferencialmente os tipos de células para a imagiologia. Este método é distinta da de tipo semelhante em ensaios in vitro que rastreiam migração horizontal ou vertical / invasão utilizando câmaras de slides, agar ou transwell placas. O ensaio permite que os dados detalhados de imagem para be coletados com diferentes tipos de células que se distinguem por marcadores fluorescentes específicos; mesmo subpopulações específicas de células (isto é, transduzidas / nontransduced) pode ser monitorizado. Superfície parcelas intensidade de fluorescência são gerados usando canais de fluorescência específicas que correspondem ao tipo de célula de migração. Isto permite uma melhor visualização da mobilidade celular imune não-aderente em momentos específicos. É possível a obtenção de provas de outras funções das células efectoras, tais como citotoxicidade ou a transferência de vectores virais a partir de células de efector para alvo, bem como. Assim, o método permite que os investigadores microscopicamente documentar célula-a-célula interacções de diferencialmente marcado, não-aderente com células aderentes de vários tipos. Tais informações podem ser especialmente relevante na avaliação dos tipos de células do sistema imunológico biologicamente manipulados ou ativados, onde a prova visual de funcionalidade é desejados com células-alvo tumor antes de sua utilização para a terapia do câncer.

Os vectores virais que codificam para as proteínas fluorescentes pode ser utilizada em adição a, ou em vez de, corante fluorescente. Transdução virai deve ser executada antes do ensaio de motilidade. Ambos os tipos de células aderentes e não aderentes podem ser diferencialmente marcado. O protocolo para a transdução vai depender do tipo de vector utilizado. Aqui, nós transduced o alloCTL nas Figuras 3, 5 e 6 com RRV-EMD, pelo menos, dois dias antes do ensaio utilizando o protocolo descr...

Descrevemos um protocolo para monitorar a mobilidade radial de células imunes não aderentes in vitro usando um aparelho coletor/slide de sedimentação celular. A migração celular é rastreada em monocamadas de células tumorais ou em proteínas da matriz extracelular. O exame por microscopia de luz e fluorescência permite a observação da mobilidade celular e da funcionalidade citotóxica.

Radial Mobilidade e função citotóxica de Retroviral Replicando Vector transduzidas, Alloresponsive não aderentes Linfócitos T

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

O objetivo geral do seguinte experimento é demonstrar a migração de linfócitos T efetores não aderentes sobre uma monocamada de células tumorais aderentes. Isso é conseguido primeiramente estabelecendo uma monocamada de células tumorais aderentes nos poços de lâminas de teflon mascaradas e revestidas com poli D lisina; como segundo passo, linfócitos T efetores marcados com fluorescência são sedimentados no centro da monocamada utilizando um manifold de sedimentação celular. Em seguida, microscopia de luz e de fluorescência são utilizadas para visualizar a migração das células não aderentes sobre a monocamada.Os resultados mostram que a migração e as funções efetoras de linfócitos T não aderentes em co-cultura com uma monocamada de células tumorais aderentes são mantidas após os linfócitos terem sido transduzidos com um vetor retroviral. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que a migração radial de linfócitos T efetores não aderentes pode ser medida em co-cultura com células tumorais aderentes. Isso tem implicações significativas para pacientes com tumores cerebrais primários ou metastáticos, pois linfócitos T citotóxicos alogênicos modificados para expressar um gene ativador de pró-fármaco, como a citosina desaminase, estão sendo testados como uma abordagem multmodal para eliminar tumores no cérebro.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldade em estabelecer monocamadas de células tumorais aderentes devido à heterogeneidade do crescimento celular tumoral em relação às características de aderência. A demonstração visual deste método é essencial, pois os passos para gerar uma monocamada tumoral uniforme e uma sedimentação eficaz das L-O-C-T-L não aderentes requerem um entendimento experiente das características de ambos os tipos celulares. Para começar, coloque até quatro esterilizados.Lâminas de Teflon revestidas com 10 poços em uma placa de Petri estéril de 150 milímetros por 15 milímetros. Coloque uma placa de Petri de 35 milímetros por 10 milímetros contendo dois a três mililitros de água estéril ao lado das lâminas para fornecer umidade. Em seguida, pré-trate as lâminas cobrindo cada poço com uma solução de 100 microgramas por mililitro de poli-D-lisina ou poli-L-lisina.Incube as lâminas por uma hora à temperatura ambiente, depois aspire a solução e enxágue a superfície do poço duas vezes com PBS com os poços da amostra preparados. Colete um frasco confluente de células tumorais aderentes. Conte o número de células viáveis por microscopia de luz e, em seguida, suspenda as células em uma concentração de cinco vezes 10 à sexta células por mililitro.No meio de crescimento tamponado, adicione de cinco a 10 microlitros da suspensão celular a cada poço, conforme o tipo de célula tumoral, complete o volume do poço até 40 microlitros com meio e pipete lentamente para cima e para baixo para distribuir as células uniformemente. Após a semeadura dos poços, deixe as células tumorais sedimentarem à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, coloque a tampa na placa de Petri e transfira-a cuidadosamente para uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de dióxido de carbono e incube por pelo menos 24 horas.Altere o meio de cultura dos poços diariamente, removendo cuidadosamente parte do meio do monocamada e substituindo-o por um volume maior de meio completo para linfócitos T fresco. Normalmente, as células atingirão confluência em um a três dias para preparar as células para sedimentação sobre o monocamada de células tumorais. Recolha os linfócitos T não aderentes e marque-os com um corante de proliferação celular de acordo com o protocolo do fabricante, pelo menos uma hora antes do ensaio.Em seguida, coloque a câmara umidificada contendo as lâminas com células tumorais dentro da cabine de segurança biológica. Lave os poços com PBS por pipetagem e, então, adicione 45 microlitros de meio completo com 10% de soro aos poços. Deslize um manifold esterilizado de sedimentação celular sobre os poços até que o gancho na extremidade do manifold toque o fundo da lâmina.Certifique-se de que o meio seja visível nos canais do manifold. Em seguida, conte as células não aderentes e as suspenda em uma a duas vezes 10 à quinta. Células por microlitro no meio.Disperse suavemente as células para eliminar quaisquer aglomerados celulares que possam interferir na sedimentação celular. Pipete lentamente um microlitro da suspensão celular no canal do manifold para cada poço. Em seguida, incube o aparelho à temperatura ambiente por 20 a 30 minutos para permitir que as células no canal sedimentem sobre a monocamada.Após as células terem sedimentado, levante cuidadosamente o manifold verticalmente sem tocar a lâmina. Certifique-se de que os pellets celulares tenham assentado dentro da circunferência do canal do manifold. Usando um microscópio, as células assentadas devem aderir levemente à monocamada, de modo que mover suavemente a lâmina não dispersará o pellet.Após confirmar que as células sedimentaram, transfira a lâmina para um microscópio invertido equipado com câmara de dióxido de carbono e umidade. Utilize a objetiva de quatro x para imagens em campo claro e fluorescência multicanal das células. Adquira imagens de uma área específica em canais de campo claro e fluorescência, e então adicione barras de micrômetros com o software de captura de imagens.Armazene a lâmina em um incubador umidificado entre os pontos temporais após a aquisição de todos os pontos temporais. Arraste e solte os arquivos de imagem no programa de edição de imagens e selecione a opção adicionar camada para criar um arquivo de imagem com múltiplas camadas. Una as imagens claras e as imagens fluorescentes em uma única camada.Utilize o software de aquisição para capturar imagens de uma área de oito milímetros por oito milímetros. O software deve ser configurado para unir automaticamente as imagens capturadas usando o canal que é melhor representado em toda a placa. Se forem adquiridos apenas canais de fluorescência, este deve ser o canal para aquisição das células aderentes.Alternativamente, as imagens podem ser unidas usando um software de edição de imagens. Isso é feito alinhando regiões das imagens que são conservadas de uma imagem para outra e sobrepondo as imagens umas sobre as outras até que uma imagem completa seja gerada. Una as imagens utilizando o software de imagens.Utilize as imagens combinadas para criar mapas de intensidade de superfície de fluorescência com o software Image J, a fim de visualizar a agregação ou disseminação de linfócitos T fluorescentes ao longo do tempo. Linfócitos T citotóxicos alocitotóxicos humanos, conhecidos como Allo CTL, transduzidos com um vetor retroviral com capacidade de replicação que codifica um gene de expressão da proteína fluorescente verde esmeralda, foram colocados no centro de uma monocamada de células de glioma. Após quatro horas, os Allo CTL tinham formado agregados visíveis em 24 horas.Apareceram áreas vazias na monocamada de células aderentes, indicando lise das células tumorais, e alguns CTL alogênicos haviam migrado além da borda anterior. CTL alogênicos murinos marcados com fluorescência foram posicionados no centro de uma monocamada de células de glioma marcadas com fluorescência após uma hora; após 48 horas, os CTL alogênicos estavam fortemente associados às células de glioma e haviam migrado para fora do centro da superfície da monocamada. Mapas de fluorescência foram gerados a partir dessas imagens com o software ImageJ e mostram migração substancial para fora do centro após 48 horas.É importante trocar o meio de cultura diariamente para a monocamada de células tumorais, a fim de manter condições de cultura saudáveis. Além disso, uma vez dominado, o processo de sedimentação das células não aderentes deve levar cerca de 20 minutos após este procedimento. Outros métodos, como o rastreamento do trajeto celular, podem ser utilizados para responder perguntas sobre a taxa na qual os CTL alogênicos migram através da monocamada ou o tempo que permanecem em contato com as células tumorais exercendo suas funções citotóxicas.Este protocolo ajudará pesquisadores na área de terapia gênica imunológica a explorar a migração de linfócitos T modificados geneticamente em co-cultivo com células tumorais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar células não aderentes e aderentes por co-cultivo e de como usar o manifold de sedimentação celular para estudar a migração radial horizontal de células não aderentes sobre uma monocamada de células tumorais.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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