Transferência de genes assistida por eletroporação incorporada em agarose em progenitores de interneurônios corticais de camundongos

Encha uma micropipeta com uma mistura de DNA contendo vetores de plasmídeo carregando o gene de interesse e um corante de rastreamento. Prenda-o em um micromanipulador.

Posicione um bloco de agarose sob o microscópio e coloque uma fatia de cérebro embrionário de camundongo embebida em agarose com interneurônios corticais sobre ela.

Abaixe a micropipeta e injete a mistura de DNA na região progenitora do interneurônio. O corante de rastreamento marca o local da injeção.

Posicione outro bloco de agarose em um eletrodo de placa de Petri e uma coluna de agarose no eletrodo de cobertura.

Transfira a fatia para o bloco e alinhe o eletrodo de cobertura sobre o local da injeção.

Aplique breves pulsos elétricos para permeabilizar temporariamente as membranas celulares, permitindo que os plasmídeos entrem no núcleo.

Incube a fatia em um meio para manter a viabilidade celular.

Dentro do núcleo, o plasmídeo desencadeia a expressão gênica, produz a proteína alvo e modula as funções progenitoras do interneurônio.

Para a injeção, misture o DNA do vetor de expressão e controle a uma concentração de 1 micrograma por microlitro para cada vetor e adicione solução estoque verde rápida a uma diluição de 1 a 10. Encha uma micropipeta de vidro puxada de 0,5 milímetro de diâmetro interno e 1 milímetro de diâmetro externo com 10 microlitros da mistura de DNA e carregue a micropipeta em um injetor de bomba pneumática pico. Coloque o bloco maior de agarose sob um estereomicroscópio e coloque a fatia a ser injetada no pedaço de agarose.

Em seguida, injete volumes de 25 a 50 nanolitros na região de eminência ganglionar medial ou ganglionar caudal selecionada da fatia. Imediatamente após a injeção, coloque o pequeno bloco de agarose no eletrodo da placa de Petri e use uma microespátula de extremidade plana para prender a coluna de agarose ao eletrodo de cobertura móvel.

Transfira a fatia injetada com sua membrana de suporte para o bloco de agarose e coloque o eletrodo superior com a coluna de agarose no topo da região selecionada da fatia. Em seguida, galvanize a região com dois pulsos de 5 milissegundos de 125 volts, com 500 milissegundos de intervalo. Após a eletroporação, coloque a fatia com sua membrana de suporte de volta em seu prato de retenção e retorne o prato à incubadora de cultura de tecidos.