Osso meio condicionado: Preparação e Bioensaio

O objetivo geral deste vídeo é descrever como preparar o meio condicionado ósseo e testar sua atividade in vitro. Isso é feito primeiro colhendo lascas de osso de uma mandíbula de porco usando um raspador de osso. O segundo passo é tratar termicamente, desmineralizar ou não fazer nada com os chips ósseos antes de incubá-los em meio de cultura por 24 horas.

Em seguida, o meio condicionado ósseo é coletado contendo todos os fatores liberados dos chips ósseos. A etapa final é estimular as células com o meio condicionado ósseo ou pré-incubar um biomaterial com o meio condicionado ósseo e células-semente após o período de incubação. Em última análise, a PCR quantitativa em tempo real é usada para mostrar mudanças na expressão gênica das células após o tratamento.

A utilização de enxertos ósseos autólogos isoladamente ou em combinação com outros biomateriais estimula a regeneração óssea em defeitos ósseos peri-implantares e, assim, garante bons resultados a longo prazo. Este vídeo apresenta um bioensaio in vitro, que é útil para determinar a resposta genética das células massais às biomoléculas dentro da condição óssea. Médio O meio de condição óssea pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo maxilofacial e odontológico do trauma, como por que o osso autólogo é o objetivo do enxerto padrão na regeneração óssea.

A preparação do meio de condição do osso processado, como enxerto automático de osso tratado termicamente ou matriz óssea izada, pode ser difícil de padronizar. Portanto, é importante ser preciso. Para começar, obtenha mandíbulas de porco frescas de um açougueiro local e coloque-as em uma superfície firme.

Em seguida, use um periósteo para liberar um retalho de espessura total do periósteo, prestando atenção especial para não deixar nenhum tecido mole preso ao osso. Depois que o periósteo for removido, segure firmemente o raspador ósseo e use movimentos longos para colher lascas ósseas do lado vestibular da mandíbula. Descarte qualquer um dos chips de osso menores que um milímetro de comprimento.

Evite que as lascas de osso sequem, cobrindo-as rapidamente com meio de cultura em uma placa de Petri de 10 centímetros. Depois que lascas de osso suficientes forem coletadas, prepare um lote de controle térmico pasteurizando cinco gramas das lascas de osso. Pasteurize os chips aquecendo-os por 30 minutos a 80 graus Celsius ou autoclave-os por 20 minutos a 121 graus Celsius.

Em seguida, prepare um controle desmineralizado adicionando cinco gramas de lascas de osso em uma solução molar de ácido clorídrico e colocando-as em um shaker por quatro a seis horas a quatro graus Celsius. Em seguida, lave as lascas de osso repetidamente com meio de cultura até atingir um pH neutro. Coloque cinco gramas de lascas de osso fresco e cinco gramas de cada uma das preparações de controle em pratos separados e adicione 10 mililitros de meio de cultura fresco a cada prato.

Em seguida, incube as amostras em uma atmosfera umidificada a 37 graus Celsius por 24 horas para criar o meio condicionado no dia seguinte. Retire o meio de cada prato e coloque-o em um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue o meio condicionado por 200 vezes a gravidade por 10 minutos para remover quaisquer detritos.

Em seguida, remova o sobrenadante e passe-o por um filtro estéril de 0,2 mícron, armazene os quads Ali congelados a 80 graus Celsius negativos até que sejam necessários. Comece semeando células mesenquimais humanas, como células ósseas ou fibroblastos gengivais e do ligamento periodontal, em uma placa de 12 baleias a uma concentração de 30.000 células por centímetro quadrado. Cubra as células com meio de crescimento e deixe as células se fixarem à placa durante a noite na manhã seguinte.

Descarte o meio de cultura e lave as células com PBS pré-aquecido a 37 graus Celsius. Em seguida, estimule as células adicionando meio de cultura livre de soro pré-aquecido com e sem meio condicionado a 20% de osso. Se também testar a capacidade de absorção de um biomaterial, adicione o meio condicionado ao osso, incluindo quaisquer controles, aos tubos contendo o biomaterial de interesse, e incube os tubos a 37 graus Celsius por uma hora.

Em seguida, enxágue o biomaterial vigorosamente com PBS pré-aquecido e semeie células mesenquimais humanas a uma concentração de 30.000 células por centímetro quadrado no material. Incubar as células sozinhas ou aquelas semeadas nos biomateriais em uma atmosfera umidificada a 37 graus de células CS por 24 horas. Em seguida, descarte o meio de cultura.

Enxágue as células com PBS pré-aquecido e extraia o RNA das células usando um protocolo padrão de isolamento de RNA. Uma vez que o RNA tenha sido isolado, prepare amostras de CD NA de cada grupo de tratamento, começando com concentrações iguais do RNA extraído e executando uma reação de transcriptase reversa em cada amostra. Em seguida, realize PCR quantitativo em tempo real nas amostras para procurar níveis de genes selecionados usando os primers e condições listados no protocolo de texto que acompanha.

Finalmente, calcule a qualidade do meio condicionado ósseo com base nos níveis relativos de expressão gênica, normalizando para os níveis de limiar de ciclo dos genes para o gene de manutenção Gabb dh usando o método delta delta CT. Aqui estão alguns resultados típicos que mostram as mudanças na expressão gênica de fibroblastos orais expostos ao meio condicionado ósseo por 24 horas. Dois genes adrenalina e trax reprimida e três foram significativamente regulados negativamente para 40% dos níveis originais, enquanto as interleucinas 11 e 33, juntamente com a N-A-D-P-H oxidase quatro e o proteglicano quatro, foram todos regulados positivamente em até 200 vezes.

Curiosamente, as membranas de barreira de colágeno usadas para proteger os chips ósseos do tecido mole circundante absorvem grande parte do meio condicionado ósseo responsável pelas mudanças na expressão gênica. As membranas de colágeno, no entanto, não conseguiram absorver os fatores que controlam a expressão da interleucina 33. Portanto, a expressão da interleucina 33 não é regulada nesse cenário.

O protocolo aqui descrito pode ser adaptado para estudar a resposta de diferentes tipos de células envolvendo regeneração óssea. Além disso, o protocolo pode ser usado para preparar o meio de condição a partir do osso de processo e outros preenchimentos ósseos. A relevância clínica deste bioensaio permanece obscura.

A resposta celular ao BCM in vivo é provavelmente mais complexa e inclui um grande espectro de genes e diferentes células-alvo que se estendem às apresentadas aqui. No entanto, nosso bioensaio fornece os primeiros insights sobre a composição presumivelmente complexa das moléculas de RAF ósseas e a resposta celular in vitro.