Medindo phagosome pH Raciometrico por microscopia de fluorescência

O objetivo geral deste conjunto de experimentos é medir o pH facossomal em células vivas usando microscopia de fluorescência métrica de razão. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia dos fagocitários, como a identificação de moléculas-chave nas interações de patógenos ou o efeito da interrupção genética ou drogas na fagocitose. A principal vantagem desta técnica é que, ao contrário dos métodos baseados na população, como fatos ou espectroscopia, podem ser detectados efeitos, como mudanças na migração de ligação de partículas ou na heterogeneidade dos fagossomos individuais.

A implicação dessa técnica se estende às nossas terapias contra organismos químicos patogênicos, pois muitos desses microrganismos podem alterar o pH fragoso para evitar distração nos fagossomos. Para iniciar este procedimento, adicione 20 miligramas de Xan seco a 10 mililitros de vórtice PBS estéril e aqueça em banho-maria fervente por 10 minutos. Em seguida, arrefecer e centrifugar a 2000 Gs durante cinco minutos.

Depois disso, remova o sobrenadante e ressuspenda o Xan em um mililitro de PBS. Sonicar por 10 minutos em banho-maria. Sonicar então transferir 500 microlitros do Xan ressuspenso para dois tubos de 1,5 mililitro e centrifugá-los a 11.000 Gs por cinco minutos.

Repita a lavagem com 500 microlitros de PBS. Em seguida, lave o Xan duas vezes em 500 microlitros de solução de carbonato de sódio 0,1 molar recém-preparada em pH 9,3 e RESUSPENDIDA em 490 microlitros de solução de carbonato de sódio após a lavagem final. Posteriormente, adicione 10 microlitros de FZ dissolvido em DMSO a 10 miligramas por mililitro ao vórtice Xan.

Cubra com papel alumínio e incube com agitação por quatro horas em temperatura ambiente Para remover o olho solto, primeiro lave com 0,5 mililitros de DMSO mais 150 microlitros de PBS, incluindo sonicação entre as etapas de lavagem. Em seguida, lave com 0,5 mililitros de DMSO mais 300 microlitros de PBS, depois lave com 0,5 mililitros de DMSO mais 450 microlitros de PBS, seguido apenas de PBS. Depois disso, adicione um microlitro de Xan a 500 microlitros de PBS e vórtice.

Em seguida, adicione 10 microlitros de areia xma diluída na borda da câmara do hemocitômetro onde ela encontra a lamínula, monte o hemocitômetro em um microscópio de campo claro equipado com uma objetiva de 20 x. Concentre-se no canto superior esquerdo contendo 16 quadrados e conte todas as partículas de areia de natal nesta área. Usando um contador de contagem manual, repita o procedimento no canto inferior direito.

Em seguida, calcule a concentração de Xan usando esta equação. Em seguida, opsonize o Xan marcado com o anticorpo anti Xan raivoso em um vórtice de diluição de um a 100 e incube a amostra por uma hora em banho-maria a 37 graus Celsius. Em seguida, conte a areia de natal usando um hemocitômetro e diluída a 100 vezes 10 elevado a sextas partículas por mililitro.

Depois de isolar os neutrófilos primários do camundongo, adicione duas vezes 10 ao quinto dos neutrófilos no centro de um prato de fundo de vidro de 35 milímetros. Em seguida, espalhe a gota adicionando 50 microlitros de meio e incubado a 37 graus Celsius por cinco minutos para permitir que as células adiram. Depois, adicione um mililitro de HBSS quente a 37 graus Celsius contendo inibidor da mielo peroxidase.

Monte a placa em um microscópio de fluorescência de campo amplo, equipado com um sistema de aquecimento de 37 graus Celsius e uma objetiva de óleo de 40 x. Incube as células sem imagem por 10 minutos para permitir que as células e o equipamento se equilibrem. Em seguida, ajuste as configurações do microscópio para adquirir uma imagem de transmissão de campo claro com excitação de 440 nanômetros ou 490 nanômetros e emissão de 535 nanômetros a cada 30 segundos.

Após dois minutos, adicione 10 vezes 10 à areia fitzy zy seis ized no centro do prato e continue a imagem por 30 minutos. Após 30 minutos, interrompa a aquisição de lapso de tempo e inicie um cronômetro. Mova o palco e capture 10 ou mais instantâneos em diferentes campos de visão para criar imagens de outras zonas vaga em cinco minutos.

Neste procedimento, descongele as soluções de calibração e aqueça a 37 graus Celsius em banho-maria. Verifique o pH com um medidor de pH e registre-o. Em seguida, monte uma bomba peristáltica no prato de fundo de vidro antes da aquisição da imagem.

Em seguida, realize microscopia de vídeo ao vivo no final do período de aquisição de 30 minutos. Ligue a bomba para remover a solução do prato. Em seguida, adicione um mililitro da primeira solução de calibração e pare a bomba.

Aguarde cinco minutos até que o sinal se estabilize. Repita o procedimento com cada solução de calibração. Para analisar os filmes de lapso de tempo e os instantâneos de fagossomos, abra as imagens com a imagem J.Subtraia o fundo no canal 490 desenhando um pequeno ROI quadrado em uma área sem células.

Usando a ferramenta de seleção de polígono quadrado e clicando em plugins. Em seguida, subtração BG depois. Carregue o mesmo ROI no canal 440 clicando em editar.

Em seguida, a seleção seguida pela seleção de restauração e repita o procedimento de subtração de fundo. Faça uma imagem de proporção de 32 bits do canal 490 dividido pelo canal 440 clicando primeiro no processo. Em seguida, calculadora de imagens.

Depois disso, selecione as imagens apropriadas nos menus suspensos da imagem um e da imagem dois. Selecione dividir no menu suspenso de operação e marque a caixa de seleção de resultado de 32 bits. Depois disso, altere a tabela de pesquisa de codificação de cores para uma codificação de cores compatível com a proporção clicando na imagem e, em seguida, nas tabelas.

Em seguida, arco-íris RGB. Defina um limite para a imagem de proporção para eliminar zero e infinito pixels clicando na imagem. Em seguida, ajuste seguido de limiar.

Ajuste as barras de rolagem para que o Xan apareça em vermelho e clique em aplicar e certifique-se de que a caixa de seleção definir pixels de fundo para nan esteja marcada. Se os valores de sinal de fundo e Xan produzirem valores de proporção muito semelhantes, resultando em uma imagem de proporção ruidosa, adicione de volta uma pequena quantidade de fundo ao canal 440 clicando em processo. Então matemática.

Em seguida, adicione e refaça a imagem da proporção para obter um resultado mais limpo. Como alternativa, omita a subtração de fundo de 440 canais. Em seguida, combine essa pilha de proporção com um canal de campo claro em uma composição multicanal clicando na cor da imagem.

Em seguida, mescle os canais. Selecione a imagem de campo claro no menu suspenso do canal cinza e a imagem da proporção no menu suspenso do canal verde. Em seguida, marque a caixa de seleção manter imagens de origem.

Depois, digitalize os filmes ou instantâneos de lapso de tempo comparando os canais de campo claro e proporção para determinar quais fagossomos devem ser analisados, desenhe um ROI ao redor dos fagossomos usando a ferramenta de seleção de polígonos ovais e adicione-os ao gerenciador de ROI clicando em ferramentas de análise. Em seguida, o gerenciador de ROI, seguido por adicionar, meça posteriormente sua taxa de intensidade Xan clicando em mais várias medidas e desmarque a caixa de seleção uma linha por fatia. Para filmes time-lapse.

Acompanhe as zonas FGA uma de cada vez, desenhando um controle do tipo ROI M para medir cada ponto de tempo e mova o ROI quando necessário para rastrear os valores de intensidade ao longo do tempo. Em seguida, copie as medições da janela de resultados para uma planilha para converter a fluorescência em valores de pH. Depois de medir a proporção de 490 a 440 para fagossomos nos filmes de lapso de tempo de calibração em uma planilha, plote os valores da proporção ao longo do tempo.

Em seguida, calcule os valores médios da razão para todos os fagossomos dentro do campo de visão em cinco pontos de tempo no meio do período de tempo correspondente a cada solução de calibração de pH. Represente graficamente esses valores médios de proporção de 490 a 440 em relação ao pH medido real, combinando pelo menos três calibrações independentes em um único gráfico. Em seguida, execute uma análise de regressão não linear para obter uma equação para transformar os valores da razão em pH.

Esta figura mostra como os fagossomos e o Xan ingerido são distinguidos. O painel esquerdo mostra uma imagem de campo claro mesclada e uma proporção de 490 a 440 Fitzzy. Considerando que o painel direito mostra apenas a imagem de campo claro.

Os fagossomos podem ser distinguidos das partículas externas que não se colocalizam com as células ou cuja fluorescência não corresponde a um centro escuro cercado por um anel mais brilhante característico dos fagossomos na imagem de campo claro mostrada. Aqui estão os cursos de tempo típicos do tipo selvagem e HV CN um knockout neutrófilo FGA omal pH nos neutrófilos do tipo selvagem, o pH neutro ou ligeiramente alcalino durante os primeiros pontos de tempo Após a ingestão, os fagossomos dos neutrófilos HV CN um knockout podem ser alcalinos ou ácidos. Instantâneos tirados 30 a 35 minutos após a adição de alvos permitem que o pH médio da população seja calculado a partir de um grande número de fagossomos nos histogramas das proporções de Fitz Xan mostradas aqui.

Pudemos ver as diferenças no pH pequeno entre os neutrófilos do tipo selvagem e do HVCN nocaute uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em seis horas. A partir da etapa de otimização ao tentar este procedimento, é importante lembrar de otimizar as condições de imagem. Primeiro, otimizar a concentração de anticorpos para a etapa de otimização também pode ser útil para garantir uma fagocitose robusta Após este procedimento.

Outros métodos, como medir a produção de Ross ou medir a morte bacteriana, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se o Ross pequeno ou a capacidade do fagossomo de matar bactérias é alterado junto com o pH após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia de fagocitos explorarem quais fatores influenciam a capacidade das células fagocíticas de matar ou processar os materiais ingeridos para provocar mais respostas imunes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a microscopia de fluorescência geométrica para medir os parâmetros fisiológicos dos fagossomos em tempo real em células vivas.

Não se esqueça de que trabalhar com inibidores da UNIFOR e células vivas pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de luvas devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.