Name: Medindo phagosome pH Raciometrico por microscopia de fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Aprenda a medir o pH fagossomal em fagócitos vivos usando microscopia de fluorescência ratiométrica. Este método permite monitorar mudanças de pH em tempo real e analisar a heterogeneidade individual dos fagossomos.

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Os autores são apoiados financeiramente pela Swiss National Science Foundation por meio de uma bolsa operacional N° 31003A-149566 (para N.D.), e The Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust por meio de um Subsídio para Jovens Investigadores (para P.N.).

Declaração de Ética: Todas as manipulações em animais foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes do Comitê da Universidade de Genebra Research Animal. 1. Preparação de Metas fagocíticas <ol><li> Adicionar 20 mg de zimosan secou-se para 10 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Agitar em vórtice e aquecimento num banho de água a ferver durante 10 min. Arrefecer e centrifugar a 2000 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante, ressuspender em 1 ml de PBS e sonicado durante 10 minutos num banho de água sonicador. Transferir 500 uL de dois tubos de 1,5 ml. Centrifugar a 11.000 xg durante 5 min. </li><li> Repita a lavagem com 500 mL PBS. O zimosan fervida pode ser dividido em alíquotas, congelada e armazenada a -20 ° C. </li><li> Lavar duas vezes zimosan em 500 ul preparadas de fresco 0,1 M Na 2 CO 3, pH 9,3 como anteriormente (passo 1.2). </li><li> Ressuspender em 490 mL após a lavagem final. Adicionar 10 ul de 10 mg / ml de FITC dissolvido em dimetil sulfoxidE (DMSO), vortex, cobrir com folha, e incuba-se com agitação durante 4 h à TA. </li><li> Para remover o corante não ligado, lavar como indicado acima (passo 1.2), em primeiro lugar com 0,5 mL de DMSO + 150 ul de PBS, em seguida, 0,5 ml de DMSO + 300 ul de PBS, em seguida, 0,5 ml de DMSO + 450 ul de PBS, em seguida, apenas PBS. </li><li> Contagem de zimosan utilizando um hemocitómetro. Adicionar 1 ml de zymosan a 500 ul de PBS, vórtice, em seguida, adicionar 10 ul para a extremidade da câmara de hemocitómetro, onde se encontra com a lamela colocada sobre a grelha central. Montar o hemocitómetro em um microscópio de campo brilhante equipado com uma objectiva 20X. </li><li> Concentre-se no canto superior esquerdo contendo 16 quadrados e contam todas as partículas de zimosan nesta área, utilizando um contador de contagem mão. Repita com o canto inferior direito. Calcular a concentração de zimosan com a seguinte equação: concentração Zymosan = Contagem / 2 x 500 x 10 4 zimosan / ml. Zimosan marcado pode ser dividido em alíquotas, congelada e armazenada a -20 ° C. </li><li> Opsonizar o wi zymosan rotuladath um anticorpo de coelho anti-zimosan na diluição 1: 100. Vortex e incubar durante 1 hora em um banho de água a 37 ° C. Lava-se com 500 ul de PBS como acima (passo 1.2). Nota: A sonicação é altamente recomendada, particularmente depois de opsonização, como zimosan tende a formar grumos que podem tornar mais difícil a análise mais tarde. A opsonização com 65% v / v de soro de rato ou humano podem ser utilizados como uma alternativa. </li><li> Contagem de zimosan utilizando um hemocitómetro como descrito nos passos de 1,7-1,8, e diluir para 100 x 10 6 de partículas / ml. A opsonização com outros estimuladores fagocíticas, tais como o complemento ou nenhuma opsonização, pode ser alternativamente realizada. </li></ol> 2. Live Video Microscopia <ol><li> Isolar neutrófilos primários de ratinho, tal como descrito em detalhe noutro local 38. <ol><li> Como alternativa, use qualquer tipo de célula fagocitária. Manter em gelo neutrófilos no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 5% de soro de vitelo fetal (v / v), 200 U de penicilina / streptomycin, a uma concentração de 10 x 10 6 células / ml até estar pronto para utilização. Outros tipos de células podem ser semeadas 1-4 dias antes. </li></ol></li><li> Adicionar 2 x 10 5 (20 ul) de neutrófilos para o centro de um prato de 35 mm com fundo de vidro, gota a espalhar pela adição de 50 uL de meio e incubar a 37 ° C durante 5 min para permitir que as células a aderirem. </li><li> Adicionar 1 ml de solução salina equilibrada de Hank (HBSS) aquecido a 37 ° C contendo o inibidor de MPO específico hidrazida 4-aminobenzóico (4-ABH, 10 uM). Os inibidores não-específicos de MPO, tais como azida de sódio (5 mM), também podem ser usados, mas têm sido sugeridos recentemente para exercer efeitos não-específicos adicionais de pH 39. </li><li> Montar o prato num microscópio de campo amplo de fluorescência equipado com um sistema de aquecimento de 37 ° C e uma objectiva de óleo de 40X. Incubar as células sem imagem durante 10 min para permitir que as células e material para equilibrar. </li><li> Ajuste as configurações de microscópio para adquirir uma imagem de transmissão de campo brilhante [phase ou contraste de interferência diferencial (DIC) se disponível] com 440 nm ou 490 nm de excitação e 535 nm de emissão a cada 30 seg. </li><li> Ajuste o tempo de exposição e freqüência de aquisição de acordo com o sistema de microscópio para evitar o excesso de fotodegradação e fototoxicidade e, dependendo das questões experimentais sejam colocadas. Comece a aquisição de imagem. </li><li> Após 2 minutos, adicionam-se 10 x 10 6 (50 ul) pelo zimosan opsonizado com FITC para o centro do prato. Ajuste alvo: rácios de células, dependendo do tipo de fagócitos e alvo utilizado. </li><li> Continuar imagiologia durante 30 min. Após 30 min parar a aquisição de lapso de tempo e iniciar um temporizador. Mova o palco e capturar 10 ou mais instantâneos em diferentes campos de visão a imagem outros phagosomes, tudo dentro de 5 min. </li></ol> 3. Calibração e Controle de Experimentos <ol><li> Prepare as soluções de calibração pH (receitas estão descritos na Tabela 1) antes do dia de experimento e congelar em alíquotas de 10 ml.Descongelar as soluções de calibração e aquecer até 37 ° C num banho de água. Verificar o pH com um medidor de pH e registrar o pH real de soluções. </li><li> Montar uma bomba peristáltica na parte inferior prato de vidro antes da aquisição da imagem e realizar microscopia de vídeo ao vivo como descrito acima (seção 2). </li><li> No final do período de aquisição 30 min ligar a bomba para remover a solução dentro do prato, adicionar 1 ml da primeira solução de calibração e parar a bomba. </li><li> Aguarde até que o sinal estabilize, geralmente 5 min. Repita com cada solução de calibração. <ol><li> Executar, pelo menos, uma calibração por dia experimental, calibrar e começando com o mais elevado pH e trabalhando sequencialmente para o mais baixo, bem como a partir do pH mais baixo e trabalhar sequencialmente para o mais alto. </li></ol></li><li> Como um controlo, adicionar 100 uL de 100 uM de inibidor de NADPH-oxidase iodeto difenil propionium (DPI), diluída em HBSS para as células em 900 ul de HBSS no prato de vidro de fundo, eincube durante 10 min. </li><li> Comece aquisição e adicionar zymosan como acima (passo 2.7). Após 15 min de fagocitose, adicionar 10 ul de 10 mM de inibidor V-ATPase concanamycin A (ConcA) diluídos em HBSS e continuar imagiologia durante mais 15 minutos adicionais. </li></ol> 4. Análise <ol><li> Análise de filmes de lapso de tempo e instantâneos fagosoma. Nota: As instruções a seguir são específicos para ImageJ. Passo-a-passo as instruções podem variar muito, dependendo do software utilizado, mas as funções descritas nesta seção estão disponíveis na maioria dos softwares de análise de imagem profissional. <ol><li> Abra as imagens com software de análise de imagem profissional. Subtrair o fundo no canal 490 por desenhar um pequeno quadrado ROI com a ferramenta de seleção polígono quadrado em uma área onde não há células e clicando em Plugins&gt; BG Subtração de ROI. Em seguida, fazer o upload do mesmo ROI no canal 440, clicando em Editar&gt; Seleção&gt; Restaurar seleção e repita. </li><li>Faça uma imagem de relação de 32-bit do 490 canal dividido pelo canal 440, clicando em Processo&gt; Calculadora da imagem ..., selecionando as imagens apropriadas nos menus drop-down Image1 e Image2, em seguida, selecionando &#39;Divide&#39; no menu drop-down Operação e verificando resultado caixa de seleção de 32 bits (float). </li><li> Alterar tabela de consulta a codificação de cores para uma codificação de cores proporção compatível clicando Image&gt; Tabelas de Pesquisa&gt; Rainbow RGB. Limite a relação da imagem para eliminar a 0 e infinito pixels clicando Image&gt; Adjust&gt; Threshold .... Ajuste as barras de rolagem para que zymosan aparece em vermelho e clique em Aplicar, certificando-se os Set pixels de fundo caixa de seleção para NaN é selecionado. </li><li> Combine isso pilha relação com o canal de campo brilhante em um composto multi-canal clicando em Imagem&gt; Cor&gt; Mesclar Canais, e seleccionando a imagem de campo brilhante no menu canal suspenso cinza ea imagem relação no menu dropdown canal verde, e seleccionando oMantenha imagens de origem check-box. Digitalizar os filmes de lapso de tempo ou instantâneos para determinar quais phagosomes estão a ser analisadas. O canal de campo brilhante é útil para este. </li><li> Desenhe regiões de interesse (ROI) usando a ferramenta de seleção polígono oval em torno phagosomes, e adicioná-los para o gerente ROI clicando Analisar&gt; Ferramentas&gt; ROI Manager&gt; Adicionar. Meça o seu rácio de intensidade zymosan clicando em Mais&gt; Multi-Measure e de-selecionar o Uma linha fatia check-caixa por. </li><li> Para filmes de lapso de tempo, trilha fagossomos um de cada vez, desenhando um ROI, digitando Ctrl + M para medir cada ponto de tempo, e movendo o ROI quando necessário para rastrear valores de intensidade ao longo do tempo. Copie as medidas da janela de resultados em um software de planilha. Nota: Análise de 15 (5 cursos de tempo por experimentação x 3) experiências independentes é ideal, mas mais ou menos pode ser necessária, dependendo da variabilidade observada. Guardar as ROIs é sempre recomendável. Alguns pacotes de software permitem que regi imagemstration e atualização dinâmica de ROIs, facilitando dessa parte da análise. </li></ol></li><li> A conversão de fluorescência a valores de pH <ol><li> Medir a razão 490/440 para phagosomes na calibração filmes de lapso de tempo como descrito na seção 4.1. </li><li> Em uma planilha, traçar os valores da relação com o tempo, e calcular os valores médios da relação de todos os phagosomes dentro do campo de visão (geralmente, entre 5-20) a partir de 5 pontos temporais no meio do período de tempo correspondente a cada calibração de pH solução. (Veja também as caixas vermelhas na Figura 5A.) </li><li> Traçar estas médias de 490/440 valores da razão contra o pH de medição atual. Combinar pelo menos 3 calibrações independentes num único gráfico. Use um pacote de software estatístico ou numérica para executar uma regressão não linear (curva de melhor ajuste), geralmente a uma equação sigmoidal. Nota: Por exemplo, na Figura 5B a equação utilizada foi uma sigmoidal de Boltzmann [Y = Fundo + ((Top-Bottom)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], onde valores Y são as relações 490/440, X são os valores de pH e parte superior, inferior, parâmetros V50 e inclinação são calculados pelo software. </li><li> Use a equação obtida para transformar valores da relação de pH. Nota: Por exemplo, na Figura 5B da equação obtida para a curva de calibração na presença de azida de sódio é Rácio 490/440 = 1,103 + [(2,89-1,103) / (1 ​​+ EXP ((6,993-pH) /0.9291)] . Resolvendo para pH dá a seguinte equação: pH = 6,993-0,9291 * [LN ((1.178 / (Ratio-1.103)) - 1))]. </li></ol></li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

Apesar de ser mais demorada do que os métodos alternativos, tais como a espectroscopia e FACS, que empregam uma estratégia semelhante de um corante utilizando sensível ao pH acoplado a alvos mas medir o pH médio de uma população de fagossomas, microscopia oferece várias vantagens. Primeiro é que interno e externo ligado, mas não internalizadas, as partículas podem facilmente ser distinguidos sem ter que adicionar outros produtos químicos, tais como azul de tripano ou anticorpos, para extinguir ou rotular partículas exte...

Fagocitose, o processo pelo qual as células imunes inatas engolem grandes partículas, evoluiu do mecanismo alimentar de organismos unicelulares e envolve a ligação a um alvo, envolvendo-o com uma membrana e comprimindo a membrana para formar um vacúolo dentro do citosol chamado fagossomo. Enquanto a membrana fagossômica é derivada da membrana plasmática, a classificação ativa de proteínas e lipídios, bem como a fusão com endomembranas durante a formação do fagossomo, transformam o fagossomo em uma organela distinta dentro da célula com propriedades degradativas que permitem a morte, neutralização e quebra do material ingerido1-3. Esse processo, chamado de maturação fagossomal, depende da entrega de uma série de enzimas proteolíticas e microbicidas, incluindo a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase, que transfere elétrons para os fagossomos produzindo o forte oxidante O2- e suas espécies reativas de oxigênio (ROS) derivadas 2,4. 
O pH luminal dos fagossomos tem uma influência profunda em vários eventos necessários para a função do fagossomo. Primeiro, o pH influencia o tráfego de endomembranas em geral, pois as mudanças conformacionais dependentes do pH dos reguladores do tráfego transmembrana alteram o recrutamento de determinantes do tráfego, como Arfs, Rabs e proteínas do revestimento vesicular, que por sua vez definem quais vesículas podem se fundir com fagossomos 5-8. Em segundo lugar, a composição iônica do lúmen fagossômico também é transformada à medida que os fagossomos amadurecem, e alguns transportadores de íons, como o trocador Na+/H+ ou os antitransportadores Cl-/H+ da família ClC, que promovem a função fagocítica, dependem da translocação H+ 9,10. Da mesma forma, a produção de ROS está intimamente ligada ao pH fagossomal. As EROs e seus subprodutos oxidantes tóxicos são reconhecidos há muito tempo como cruciais para a morte fagossômica em neutrófilos 4,11,12 e demonstraram desempenhar papéis críticos em outros fagócitos, incluindo macrófagos, células dendríticas (DCs) e ameba 13-16. A NADPH oxidase é uma enzima eletrogênica que libera H+ no citosol à medida que o NADPH é consumido, e que requer a transferência simultânea de H+ através de canais HVCN1 companheiros ao lado dos elétrons transportados para o lúmen fagossomal, a fim de aliviar a despolarização maciça que, de outra forma, levaria à auto-inibição da enzima 17-21. Finalmente, várias enzimas proteolíticas têm atividade ideal em diferentes pH, portanto, as mudanças de pH fagossômicas dependentes do tempo podem influenciar quais enzimas estão ativas e quando. A importância do pH fagossômico é destacada por organismos como Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis e Salmonella typherium, que subvertem a morte fagocítica, pelo menos em parte, alterando o pH fagossomal 22-24.
Nos mamíferos, os principais fagócitos são neutrófilos, macrófagos e células dendríticas e, dependendo do tipo de célula, as alterações de pH fagossômicas dependentes do tempo podem variar amplamente e parecem desempenhar papéis diferentes. Nos macrófagos, uma acidificação forte e rápida mediada pela ATPase vacuolar da bomba de prótons dependente de ATP (V-ATPase) é um dos principais fatores que medeiam a morte 25-27, assemelhando-se aos mecanismos presentes na ameba que utiliza a fagocitose como mecanismo de alimentação 28. Nessas células, acredita-se que a ativação de proteases ácidas desempenhe um papel fundamental. Em contraste, a morte de neutrófilos depende mais de ROS, bem como de HOCl produzida pela mieloperoxidase (MPO)11, e o pH permanece neutro ou alcalino durante os primeiros 30 minutos, acidificando apenas mais tarde 29,30. O pH neutro tem sido sugerido para favorecer a atividade de proteases oxidativas, como certas catepsinas. Em DCs, o pH fagossômico é controverso, com alguns relatando acidificação e outros pH neutro ou alcalino 31,32, mas ROS e pH podem influenciar profundamente a capacidade dessas células de apresentar antígenos às células T, uma de suas principais funções 33. 
É importante ressaltar que hormônios, quimiocinas e citocinas podem produzir eventos de sinalização que induzem maturação e mudanças no comportamento dos fagócitos e, por sua vez, influenciam o pH fagossomal 34,35. Da mesma forma, medicamentos, por exemplo, a cloroquina antimalárica, que também é considerada para terapias anticancerígenas 36, podem afetar o pH fagossomal e, portanto, os resultados imunológicos. Assim, uma variedade de biólogos celulares, imunologistas, microbiologistas e desenvolvedores de medicamentos podem estar interessados em medir o pH fagossomal ao buscar entender os mecanismos subjacentes aos efeitos de uma determinada interrupção genética, composto bioativo ou microrganismo nas respostas imunes inatas e adaptativas. 
Aqui descrevemos um método para medir o pH fagossômico em neutrófilos que nos permitiu mostrar a importância do canal HVCN1 na regulação do pH fagossômico de neutrófilos 19. O método baseia-se na propriedade raciométrica do isotiocianato de fluoresceína (FITC), cuja emissão de fluorescência a 535 nm é sensível ao pH quando excitada a 490 nm, mas não a 440 nm 37. Quando esse corante é quimicamente acoplado a um alvo, neste caso zimosano, ele pode ser seguido usando microscopia de fluorescência de campo amplo, onde as células são visualizadas à medida que fagocitam e as mudanças de pH fagossômico são medidas em tempo real à medida que o fagossomo amadurece. O pH real é então obtido realizando um experimento de calibração em que as células que fagocitaram são expostas a soluções de pH diferente que contêm os ionóforos nigericina e monensina, que permitem o rápido equilíbrio do pH dentro dos fagossomos com a solução externa. Os valores da razão são então comparados com o pH conhecido das soluções, uma curva de calibração é construída por regressão não linear e a equação resultante é usada para calcular o pH a partir do valor da razão.

<table><tbody><tr><td>Zymosan A pó</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4250</td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Isotiocianato de fluoresceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-zymosan (Zymosan A Reagente de opsonização de biopartículas)</td><td>Life Technologies</td><td>Z2850</td><td>Sigma-Aldrich O6637 é um produto equivalente. Alternativamente, o soro a 25% pode ser usado como reagente opsonizante.</td></tr><tr><td>4-Hidrazida aminobenzóica (4-ABH)</td> <td>Santa Cruz</td><td>sc-204107</td><td>Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Cloreto de difenilenoiodonium (DPI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2926</td><td>Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Concanamicina A (ConcA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>27689</td><td>Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Monensin</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-026-G001</td><td>Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14200-075</td><td>Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hank</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td>Solução salina balanceada de Ringer ou outros tampões fisiológicos claros podem ser substituído.</td></tr><tr><td>Carbonato de sódio (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795</td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Ácido 2-(N-Morfolino)etanossulfônico (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671&nbsp;</td><td>Existem vários provedores</td></tr><tr><td>Ácido 4-(2-Hidroxietil)piperazina-1-etanossulfônico (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>N-Metil-D-glucamina (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004&nbsp;</td><td>Existem vários provedores</td></tr><tr><td>Etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N&prime;,N&prime;-ácido tetracético (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3777</td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503&nbsp;</td><td>Existem vários provedores</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Etanol Absoluto (EtOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td>Existem</td></tr> <tr><td>vários fornecedoresPlacas de Petri de 35 mm com fundo de vidro (Fluorodish)</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>Placas Ibidi &micro;-transparentes ou lamínulas com câmaras de imagem apropriadas podem ser substituídas Banho-maria</td></tr><tr><td>sonicanizante</td><td>O. Kleiner AG</td><td></td><td>Um sonicador pode ser usado em seu lugar, existem vários fornecedores de instrumentos</td></tr><tr><td>Hematocitômetro</td><td>Marienfeld GmbH</td><td></td><td>Existem vários fornecedores</td></tr> <tr><td>de instrumentosMicroscópio de imagem ao vivo de campo amplo</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Existem vários fornecedores de instrumentos, mas o microscópio deve ser capaz de gerar imagens de excitação/emissão 440/535 e 490/535, respectivamente. As configurações confocais de disco giratório com recursos de campo claro podem ser substituídas, mas o zymosan tende a ficar fora de foco com mais frequência. &nbsp;</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica (Dynamax RP-1)</td><td>Rainin</td><td></td><td>Existem vários fornecedores de instrumentos</td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Schott Gerate GmbH</td><td></td><td>Existem vários fornecedores de instrumentos</td></tr><tr><td>Manual Counter</td><td>Milian SA</td><td></td><td>Existem vários fornecedores de instrumentos</td></tr></tbody></table>

medindo phagosome ph raciometrico por microscopia de fluorescência

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

A fagocitose é um processo fundamental através do qual as células imunes inatas engolir bactérias, células apoptóticas ou de outras partículas estranhas, a fim de matar ou neutralizar o material ingerido, ou apresentá-lo como antigénios e iniciar respostas imunes adaptativas. O pH de fagossomas é um parâmetro crítico de fissão regulação ou fusão com endomembranas e activação de enzimas proteolíticas, eventos que permitem que o vacúolo fagocítica de amadurecer em um organelo degradativa. Além disso, a translocação de H + é necessária para a produção de níveis elevados de espécies reactivas de oxigénio (ROS), as quais são essenciais para a morte eficiente e de sinalização a outros tecidos do hospedeiro. Muitos patógenos intracelulares subverter assassinato phagocytic limitando phagosomal acidificação, destacando a importância do pH em biologia phagosome. Descrevemos aqui um método para a medição raciométrica phagosomal pH em neutrófilos usando isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com zimosano como fagocítica targets e geração de imagens de células vivas. O ensaio baseia-se nas propriedades de fluorescência do FITC, que é extinta por pH acídico, quando excitado a 490 nm, mas não quando excitado a 440 nm, permitindo a quantificação de uma relação dependente do pH, em vez de fluorescência absoluta, de um único corante. Um protocolo detalhado para a realização do corante calibração in situ e a conversão de relação a valores de pH verdadeiro também é fornecido. -Dye único raciométrica métodos são geralmente considerado superior ao comprimento de onda único ou protocolos pseudo-ratiometric dual-dye, como eles são menos sensíveis a perturbações tais como o branqueamento, o foco alterações, variações laser e rotulagem irregular, que distorcem o sinal medido. Este método pode ser facilmente modificado para medir o pH em outros tipos de células fagocíticas, e zymosan pode ser substituído por qualquer outra partícula contendo amina, a partir de drageias inertes para os microorganismos vivos. Finalmente, este método pode ser adaptada para fazer uso de outras sondas fluorescentes sensíveis a diferentes gamas de pH ou outro phagosomatividades de al, tornando-se um protocolo generalizado para a imagiologia funcional de phagosomes.

A seguir, são resultados representativos para um experimento onde o pH phagosomal de neutrófilos primários de rato isolados da medula óssea de tipo selvagem ou Hvcn1 - / - ratinhos foram comparados. Para uma experiência bem sucedida, é importante para obter phagosomes suficientes dentro do campo de visão durante toda a duração do filme de lapso de tempo, evitando muitas phagosomes, que mais tarde serão mais difíceis de segmento durante a análise de imagem. A Figura 1 mostra</strong...

O pH fagossômico influencia a maturação do fagossomo, a produção de oxidantes, a morte fagossômica, bem como a apresentação do antígeno. Aqui descrevemos um método raciométrico para medir as mudanças de pH no curso do tempo e no ponto final em fagossomos individuais em fagócitos vivos usando microscopia de fluorescência.

Medindo phagosome pH Raciometrico por microscopia de fluorescência

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

O objetivo geral deste conjunto de experimentos é medir o pH dos fagossomos em células vivas utilizando microscopia de fluorescência ratiométrica. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia de fagócitos, como a identificação de moléculas-chave nas interações com patógenos ou o efeito de perturbações genéticas ou de fármacos sobre a fagocitose. A principal vantagem desta técnica é que, ao contrário de métodos baseados em populações, como citometria de fluxo ou espectroscopia, efeitos como alterações na migração ou ligação de partículas, ou a heterogeneidade entre fagossomos individuais, podem ser detectados.A implicação desta técnica se estende aos nossos tratamentos contra organismos químicos patogênicos, pois muitos desses microrganismos podem alterar o pH ácido dos fagossomos para evitar a degradação. Para iniciar este procedimento, adicione 20 miligramas de Xan seco a 10 mililitros de PBS estéril, vortexie e aqueça em banho-maria fervente por 10 minutos. Em seguida, resfrie e centrifugue a 2000 ×g por cinco minutos.Em seguida, remova o sobrenatante e re-suspenda o Xan em um mililitro de PBS. Sonique por 10 minutos em banho-maria. Após a sonicação, transfira 500 microlitros do Xan re-suspenso para dois tubos de 1,5 mililitro e centrifugue a 11.000 Gs por cinco minutos.Repita a lavagem com 500 microlitros de PBS. Em seguida, lave o Xan duas vezes em 500 microlitros de solução recém-preparada de carbonato de sódio 0,1 molar em pH 9,3 e RESSUSPENSO em 490 microlitros da solução de carbonato de sódio após a lavagem final. Posteriormente, adicione 10 microlitros de FZ dissolvido em DMSO a 10 miligramas por mililitro ao vórtex do Xan.Cubra com papel alumínio e incube com agitação por quatro horas à temperatura ambiente. Para remover o olho não ligado, lave primeiro com 0,5 mililitros de DMSO mais 150 microlitros de PBS, incluindo sonicador entre as etapas de lavagem. Em seguida, lave com 0,5 mililitros de DMSO mais 300 microlitros de PBS, depois lave com 0,5 mililitros de DMSO mais 450 microlitros de PBS, seguido por PBS sozinho. Depois disso, adicione um microlitro de Xan a 500 microlitros de PBS e vortex.Em seguida, adicione 10 microlitros da suspensão diluída de xma sand à borda da câmara do hemocitômetro, onde ela encontra a lamínula. Monte o hemocitômetro em um microscópio de campo claro equipado com uma objetiva de 20 x. Foque no canto superior esquerdo, que contém 16 quadrados, e conte todas as partículas de xma sand nesta área. Utilizando um contador manual, repita o procedimento no canto inferior direito.Em seguida, calcule a concentração de Xan utilizando esta equação. Depois, opsonize o Xan marcado com o anticorpo anti-Xan em uma diluição de um para 100, vortexie e incube a amostra por uma hora em banho-maria a 37 °C. Posteriormente, conte as partículas de xmas utilizando um hemocitômetro e, então, dilua até 100 vezes 10 à sexta partículas por mililitro.Após o isolamento dos neutrófilos primários de camundongo, adicione duas vezes 10 à quinta potência de neutrófilos ao centro de uma placa de vidro de fundo de 35 milímetros. Em seguida, espalhe a gota adicionando 50 microlitros de meio e incube a 37 graus Celsius por cinco minutos para permitir a adesão celular. Posteriormente, adicione um mililitro de HBSS aquecido a 37 graus Celsius contendo inibidor de mieloperoxidase.Monte a placa em um microscópio de fluorescência de campo amplo, equipado com um sistema de aquecimento a 37 graus Celsius e uma objetiva de imersão em óleo de 40x. Incube as células sem realizar imagens por 10 minutos para permitir a equilibração das células e do equipamento. Em seguida, ajuste as configurações do microscópio para adquirir uma imagem de transmissão em campo claro com excitação de 440 nanômetros ou 490 nanômetros e emissão de 535 nanômetros a cada 30 segundos.Após dois minutos, adicione 10 vezes 10 à sexta semente fitzy zy para o centro da placa e continue a aquisição de imagens por 30 minutos. Após 30 minutos, interrompa a aquisição com lapso de tempo e inicie um cronômetro. Mova a platina e capture 10 ou mais instantâneos em diferentes campos de visão para imagens de outras zonas vaga em até cinco minutos.Neste procedimento, descongele as soluções de calibração e aqueça a 37 graus Celsius em banho-maria. Verifique o pH com um medidor de pH e registre-o. Em seguida, monte uma bomba peristáltica sobre o recipiente de vidro com fundo de vidro antes da aquisição de imagens.Em seguida, realize microscopia por vídeo em tempo real ao final do período de aquisição de 30 minutos. Ligue a bomba para remover a solução do recipiente. Posteriormente, adicione um mililitro da primeira solução de calibração e pare a bomba.Aguarde cinco minutos até que o sinal se estabilize. Repita o procedimento com cada solução de calibração. Para analisar os filmes com lapso de tempo e as imagens instantâneas de fagossomos, abra as imagens com o ImageJ. Subtraia o fundo no canal 490 desenhando uma região de interesse (ROI) quadrada pequena em uma área sem células.Usando a ferramenta de seleção de polígono quadrado e clicando em plugins. Em seguida, subtração do fundo. Carregue a mesma ROI no canal 440 clicando em editar.Em seguida, selecione, depois restaure a seleção e repita o procedimento de subtração do fundo. Crie uma imagem de razão de 32 bits do canal 490 dividido pelo canal 440, primeiro clicando em processar. Depois, em calculadora de imagem.Depois disso, selecione as imagens apropriadas nos menus suspensos imagem um e imagem dois. Selecione dividir no menu suspenso operação e marque a caixa de seleção resultado 32 bits. Em seguida, altere a tabela de consulta de codificação de cores para uma codificação de cores compatível com razão, clicando em imagem e depois em tabelas acima.Em seguida, RGB arco-íris. Defina um limiar para a imagem de razão para eliminar pixels zero e infinito clicando na imagem. Em seguida, ajuste e depois aplique o limiar.Ajuste as barras de rolagem para que o Xan apareça em vermelho e clique em aplicar, e certifique-se de que a caixa de seleção definir os pixels de fundo como nan esteja marcada. Se os valores de fundo e de sinal do Xan produzirem valores de razão muito semelhantes, resultando em uma imagem de razão com ruído, adicione novamente uma pequena quantidade de fundo ao canal 440 clicando em processar. Depois, matemática.Em seguida, adicione e refaça a imagem de razão para obter um resultado mais limpo. Alternativamente, omita a subtração do fundo do canal 440. Depois, combine esta pilha de razão com um canal de campo claro em um composto multicanal clicando em cor da imagem.Em seguida, combine os canais. Selecione a imagem de campo claro no menu suspenso do canal cinza e a imagem de razão no menu suspenso do canal verde. Em seguida, marque a caixa de seleção para manter as imagens originais.Posteriormente, analise os filmes com lapso de tempo ou as imagens comparando os canais de campo claro e de razão para determinar quais fagossomos devem ser analisados, desenhe uma ROI ao redor dos fagossomos utilizando a ferramenta de seleção de polígono oval e adicione-os ao gerenciador de ROI clicando em ferramentas de análise. Depois, gerenciador de ROI, seguido por adicionar; em seguida, meça a razão de intensidade Xan clicando em mais medições múltiplas e desmarque a caixa de seleção "uma linha por corte". Para filmes com lapso de tempo.Acompanhe as zonas de FGA uma por vez desenhando um controle do tipo ROI M para medir cada ponto temporal e mova o ROI quando necessário para acompanhar os valores de intensidade ao longo do tempo. Em seguida, copie as medidas da janela de resultados para uma planilha para converter a fluorescência em valores de pH. Após medir a razão de 490 para 440 para fagossomos nos filmes com lapso de tempo de calibração em uma planilha, plote os valores da razão ao longo do tempo.Em seguida, calcule os valores médios das razões para todos os fagossomos no campo de visão em cinco pontos temporais no meio do período correspondente a cada solução de calibração de pH. Represente graficamente esses valores médios da razão 490/440 em função do pH medido real, combinando pelo menos três calibrações independentes em um único gráfico. Em seguida, realize uma análise de regressão não linear para obter uma equação que transforme os valores de razão em pH.Esta figura mostra como os fagossomos e os Xan ingeridos são diferenciados. O painel esquerdo mostra uma imagem combinada de campo claro e uma razão Fitz zy de 490 a 440. Já o painel direito mostra apenas a imagem de campo claro.Os fagossomos podem ser diferenciados das partículas externas que ou não apresentam colocalização com as células ou cuja fluorescência não corresponde a um centro escuro cercado por um anel mais brilhante, característico dos fagossomos na imagem de campo claro mostrada. Abaixo estão os cursos temporais típicos do pH fagossomal em neutrófilos selvagens e em neutrófilos com deleção de HV CN um. Nos neutrófilos selvagens, o pH é neutro ou levemente alcalino nos primeiros momentos. Após a ingestão, os fagossomos de neutrófilos com deleção de HV CN um podem ser alcalinos ou ácidos. Imagens capturadas entre 30 e 35 minutos após a adição dos alvos permitem que o pH médio da população seja calculado a partir de um grande número de fagossomos nos histogramas das razões Fitz Xan apresentados aqui.Poderíamos observar as diferenças em pequenas variações de pH entre neutrófilos do tipo selvagem e neutrófilos com deleção do HVCN1. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em seis horas. A partir da etapa de otimização, ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de otimizar as condições de imagem. Primeiro, otimizar a concentração do anticorpo para a etapa de otimização também pode ser útil para garantir uma fagocitose robusta ao seguir este procedimento.Outros métodos, como a medição da produção de Ross ou a avaliação da eliminação bacteriana, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como se o Ross pequeno ou a capacidade do fagossomo de matar bactérias é alterada juntamente com o pH após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da biologia de fagócitos explorarem quais fatores influenciam a capacidade das células fagocíticas de matar ou processar materiais ingeridos para desencadear respostas imunes adicionais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar microscopia de fluorescência geométrica para medir parâmetros fisiológicos de fagossomos em tempo real em células vivas.Não se esqueça de que trabalhar com inibidores UNIFOR e células vivas pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

measuring-phagosome-ph-by-ratiometric-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra uma técnica de microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) de alta resolução para visualização em tempo real da formação e fechamento de fagossomos durante a fagocitose mediada por macrófagos de glóbulos vermelhos opsonizados (RBCs) opsonizados por IgG presos à superfície de um prato de fundo de vidro. Os macrófagos estendem os pseudópodes ao redor das hemácias e os engolfam dentro dos fagossomos, destacando-os da superfície do vidro.

Visualização baseada em microscopia TIRF da formação e fechamento de fagossomos

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Estudo da fagolisossomo Biogenesis em macrófagos ao vivo

Vários métodos estão disponíveis para medir o pH intracelular, mas muito poucos deles permitem a medição simultânea do pH citoplasmático e organelar. Aqui, descrevemos em detalhes uma metodologia rápida e precisa para medir simultaneamente o pH citoplasmático e vesicular por imagem raciométrica de células vivas.

Medição simultânea em pH endocítica e citossólicos Compartimentos em células vivas usando microscopia confocal

Aqui apresentamos um protocolo para quantificar a fagocitose de partículas fluorescentes por linhagem celular de macrófagos aderentes usando um método fluorométrico. Este método facilita uma quantificação de alto rendimento da internalização de partículas, bem como a polimerização de actina resultante.

Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

Descrevemos uma configuração experimental para visualizar com alta resolução sem precedentes a formação e fechamento de fagossomos em três dimensões em macrófagos vivos, usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Permite o monitoramento da base do copo fagocítico, dos pseudópodes que se estendem, bem como do local preciso da cisão do fagossomo.

&quot;Fagossomo Encerramento Ensaio&quot; para Visualize Formação fagossomo em Três Dimensões Usando Total Internal Reflection Microscopia fluorescente (TIRFM)

Este manuscrito descreve um método simples para medir o pH e phagosomal área, bem como o pH citoplasmática de neutrófilos humanos e de rato utilizando o indicador de medida proporcional seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, ou S-1. Isto é conseguido usando microscopia de fluorescência confocal ao vivo de células e análise de imagem.

Imaging o neutrófilos fagossoma e citoplasma utilizando um indicador de pH Ratiometric

Rotular o domínio extracelular de uma proteína de membrana com um fluoróforo sensível ao pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite a localização subcelular, expressão, e o tráfico de ser determinado. proteínas imagiologia SEP-rotulado com microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRFM) permite a quantificação dos níveis da proteína na membrana do RE e periférico plasma.

Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

Efferocytosis, a remoção fagocitária das células apoptóticas, é necessário para manter a homeostase e é facilitado por receptores e vias de sinalização que permitem o reconhecimento, a duração e internalização de pilhas apoptotic. Neste documento, apresentamos um protocolo de microscopia de fluorescência para a quantificação dos efferocytosis e a atividade das vias de sinalização de efferocytic.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Doenças neurodegenerativas estão associadas a funções de microglia disreguladas. Este artigo descreve um ensaio in vitro de fagocitose de células neuroblastoma por macrófagos iPSC. As leituras quantitativas de microscopia são descritas tanto para imagens de lapso de tempo de células vivas quanto para imagens de alto conteúdo de células fixas.

Ensaio de imagem quantitativa in vitro para fagocitose de células de neuroblastoma morto por iPSC-Macrófagos

Apresentado aqui é um protocolo para quantificar e produzir imagens dinâmicas de células-tronco mesenquimais (MSC) regulação mediada de fagocitose macrófago (MΦ) de partículas de levedura não opssonizada (zymosan) que são conjugadas a uma molécula fluorescente sensível ao pH.

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Medindo o pH, As Químicas Redox e a Capacidade Degradativa dos Macropinossos usando microscopia multiscopia memétrica de proporção de fluorofora dupla

Aprenda a medir o pH fagossomal em fagócitos vivos usando microscopia de fluorescência ratiométrica. Este método permite monitorar mudanças de pH em tempo real e analisar a heterogeneidade individual dos fagossomos.

Medindo phagosome pH Raciometrico por microscopia de fluorescência

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