Name: O Desenvolvimento da liofilizado Loop-mediadas isotérmicas de amplificação Reagentes para a detecção de Burnetii Coxiella (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprenda o método LAMP com reagentes liofilizados para detectar Coxiella burnetii em amostras de pacientes. Esta técnica simplificada é ideal para diagnóstico em regiões com recursos limitados onde a febre Q é endêmica.

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Esta pesquisa foi apoiada pela Naval Medical Research Center, a pesquisa unidade de trabalho 6000.RAD1.J.A0310. As opiniões expressas neste artigo são de responsabilidade dos autores e não reflecte necessariamente a política oficial ou a posição do Departamento da Marinha, Departamento de Defesa, ou do Governo dos Estados Unidos. Wei-Mei Ching é um funcionário do governo dos EUA. Este trabalho foi preparado como parte de seus deveres oficiais. Título 17 USC §105 prevê que «proteção dos direitos autorais sob este título não está disponível para qualquer obra do Governo dos Estados Unidos. &#39; Título 17 USC §101 define uma obra governo dos Estados Unidos como um trabalho preparado pelo membro do serviço militar ou funcionário do governo dos EUA como parte de suas funções oficiais dessa pessoa.

1. Preparar diluições de DNA plasmídico como padrão para a Reacção LAMP <ol><li> Utilizar um espectrofotómetro para determinar a densidade óptica (OD) a 260 nm para determinar o plasmídeo (contendo IS1111a gene alvo de C. burnetii RSA 493) a concentração de ADN. Um OD 260 de 1 é igual a 50 ug / ul de ADN. </li><li> Converter a quantidade de DNA de plasmídeo no número de cópias. Uma vez que o tamanho do plasmídeo é 6330 pb, o peso molecular deste plasmídeo é de 4,1 x 10 6 g (6,330 pb x 649 g / BP). A concentração do ADN do plasmídeo é 34,2 ng / mL (tal como determinado a partir do passo 1.1). 1 ul desta amostra de ADN contém 34,2 ng de ADN plasmídico, o equivalente a 5 x 10 9 cópias (34,2 x 10 -9 g / 4,1 x 10 6 6,02 x 10 gx 23) de ADN. </li><li> Adicionar 10 ul de ADN de plasmídeo (5 x 10 9 cópias / mL) a 90 uL de água para uma diluição de 10 vezes para fazer uma amostra de ADN de 5 x 10 8 cópias / ul. </li><li> Repetir o passo 1.3 para preparar amostras de ADN de 5 x 10 7, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 x 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1, e 5 x 10 0 cópias / ul. </li></ol> 2. Prepare Template DNA a partir de amostras de Reacção LAMP <ol><li> Realizar a extracção do ADN a partir de amostras de plasma humano, utilizando um kit de ADN de mini-comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Usar um total de 200 ul de amostra para a extracção e eluir o DNA extraído num volume de 20 ul. </li></ol> 3. Prepare 2x Tampão LAMP Reaction <ol><li> Misturar 200 mL de 10x tampão de Pol, 320 ul de 5 M trimetilglicina, 12 ul de 1 M de MgSO4, 280 uL de mistura de dNTP (10 mM cada) e 188 ul de água para perfazer 1 ml de tampão de 2x LAMP. Misture por pulso-vórtex durante 10 segundos. </li></ol> 4. Execute lâmpada padrão Reaction <ol><li> Misture 12,5 ul de 2x LATampão PM (tal como preparado no passo 3; Tris-HCl 40 (pH 8,8), KCl 20 mM, MgSO mM 16 4, 20 mM de (NH 4) 2 SO 4, 0,2% de Triton X-100, trimetilglicina 1,6 M, 1,4 mistura de dNTP mM), 1,2 ul de mistura de iniciadores, 1 mL de polimerase de ADN Bst (8 U / ul) e 5,3 ul de água para tornar a mistura de reacção (20 ul) num tubo de PCR de 0,2 ml. </li><li> Adicionar 5 uL de ADN (do passo 1 ou 2) para a mistura reaccional de 20 ul e misturar bem. </li><li> Primeiro tubo e incubar a 60 ° C durante 60 min num banho-maria ou bloco de aquecimento. Esta é a temperatura de reacção óptima previamente determinada. </li><li> Adicionar 5 uL de tampão de carga de gel de 10x para terminar a reacção. </li><li> Carga de 5 ul dos produtos de reacção a um gel de agarose a 2% corado com intercalando mancha de ácido nucleico. </li><li> Executar gel a 100 V durante 35 min em tampão 1 x TBE. </li><li> Visualize os resultados por luz UV. </li></ol> 5. Execute Reaction LAMP com Reconstituídoreagentes <ol><li> Misturar 125 ul de Tampão 10 x Pol, 200 mL de 5 M trimetilglicina, 7,5 ul de 1 M de MgSO4, 667,5 ul de água para perfazer 1 ml de tampão de reconstituição. Misture por pulso-vórtex durante 10 segundos. </li><li> Retire os tubos que contêm os reagentes liofilizados a partir do saco de folha de alumínio selado. Não utilize os tubos se o saco de folha de alumínio não está vedada ou se ele estiver danificado. </li><li> Adicionar 20 ul de tampão de reconstituição em cada tubo para ressuspender reagentes liofilizados. </li><li> Misture pipetando tampão cima e para baixo 5 vezes. Dê uma olhada para garantir que os reagentes liofilizados são completamente re-suspensa. O pó branco deve desaparecer no tubo. </li><li> Adicionam-se 5 ul de molde de ADN (do passo 1 ou 2) para os reagentes reconstituídos e misturar bem. </li><li> Primeiro tubo e incubar a 60 ° C durante 60 min num banho-maria ou bloco de aquecimento. </li><li> Adicionar 5 uL de tampão de carga de gel de 10x para terminar a reacção. </li><li> Carga de 5 ul de reacçãoprodutos para um gel de agarose a 2% corado com corante intercalante ácido nucleico. </li><li> Executar gel a 100 V durante 35 min em tampão 1 x TBE. </li><li> Visualize os resultados por luz UV. </li></ol> 6. Execute LAMP Reação com Reconstituição tampão contendo HNB ou fluorescente intercalando Dye <ol><li> Misturar 125 mL de 10x Pol de Amortecimento, 200 mL de 5 M trimetilglicina, 7,5 ul de 1 M de MgSO4, 7,5 ul de HNB 20 mM (ou 12,5 ul de 100x corante fluorescente intercalante) e 660 uL (ou 655 ul) de água para fazer 1 ml de tampão de reconstituição. Misture por pulso-vórtex durante 10 segundos. </li><li> Use o tampão reconstituído preparado na seção 6 para repetir os passos 5.2 - 5.6. </li><li> Visualize os resultados por a olho nu (reacção contendo HNB) ou uma luz UV (reacção contendo corante de intercalação fluorescente). </li></ol> 7. Realizar em tempo real Reaction LAMP com Scanner Tubo <ol><li> Adicionam-se 5 ul de DNA para o reconstitutreagentes ed contendo corante de intercalação fluorescente, perto do tubo e inseri-lo para o scanner tubo. </li><li> Ajuste da temperatura de incubação a 60 ° C. Medir a fluorescência a 520 nm durante 60 min. </li></ol>

<ol><li>Anderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+Q+fever+United+States%2C+2013%3A+recommendations+from+CDC+and+the+Q+Fever+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Recomm.+Rep%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group.</a> MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).</li>
<li>Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+ratio+of+serum+doxycycline+concentration+to+MIC+and+rapid+decline+of+antibody+levels+during+treatment+of+Q+fever+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+and+Chemother%22%5BJournal%5D)">Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis.</a> Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).</li>
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<li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).</li>
<li>Thekisoe, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+Loop-Mediated+Isothermal+Amplification+%28LAMP%29+reagents+and+its+amplification+efficiency+on+crude+trypanosome+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vet.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates.</a> J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).</li>
<li>Chen, H. W., Ching, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+rapid+and+easy+detection+of+Coxiella+Burnetii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii.</a> J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+In-House+Real-Time+LAMP+Assays+with+a+Commercial+Assay+for+the+Detection+of+Pathogenic+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria.</a> Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Anteriormente, foi desenvolvido um ensaio LAMP sensível e específico visando o elemento de inserção IS1111a 14. O elemento IS1111 foi selecionado porque ele é altamente conservado entre as diferentes estirpes de C. burnetii e o seu elevado número de cópias (7-110) em que as bactérias (Klee 2006). Os nossos resultados mostraram que a lâmpada pode detectar cerca de 25 cópias do elemento IS1111, que pode correlacionar-se com tão pouco como uma única cópia cromossómica de ADN <...

A pequena bactéria gram-negativa Coxiella burnetii é o agente causador da febre Q, que é uma zoonose em todo o mundo. Devido à distribuição mundial da febre Q ea alta infectividade do C. burnetii, pessoal militar e civil dos Estados Unidos desdobradas no exterior estão em risco de serem infectados nas áreas endêmicas. febre Q manifesta de duas formas: infecções agudas e crónicas. Febre Q aguda apresenta-se com sintomas semelhantes aos da gripe, hepatite ou pneumonia, e geralmente é uma doença autolimitada, com uma taxa de mortalidade baixa. Febre Q crónica, embora menos prevalente, muitas vezes resulta em endocardite, que tem uma taxa de mortalidade muito maior se não tratada 1,2. Portanto, o diagnóstico precoce para orientar um tratamento adequado é fundamental para o atendimento ao paciente. Reacção em cadeia da polimerase (PCR) e PCR quantitativo em tempo real (qPCR) ensaios foram desenvolvidos para a detecção de C. DNA burnetii em culturas de células e amostras clínicas 3-5 &lt;/ Sup&gt;. Ambos PCR e qPCR são caros e muitas vezes não é facilmente disponível em áreas com recursos limitados para o trabalho de rotina. Originalmente descrito por Notomi 6, amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) oferece um método de amplificação de DNA alternativa. LAMP utiliza ADN-polimerase Bst ADN para a síntese de deslocamento de cadeia, juntamente com conjuntos de iniciadores especialmente concebidos para que reconhecem, pelo menos, seis regiões independentes do gene alvo. A vantagem mais significativa de LAMP é que a amplificação ocorre sob condições isotérmicas. Por conseguinte, apenas um banho de água, ou um bloco de aquecimento da incubadora é necessária. Este método tem sido utilizado para detectar vários agentes patogénicos rickettsiais 7-9. A visualização dos produtos de ADN amplificados por electroforese em gel é o método mais preciso que pode diferenciar a partir de verdadeiros positivos falsos positivos devido à amplificação não específica. No entanto, os procedimentos envolvidos na electroforese em gel não são práticos para ar de recursos limitadoseas. Vários métodos alternativos foram desenvolvidos para detectar os produtos de reacção. Estes alternativa, tal como turbidez derivado de pirofosfato de magnésio formação 10 ou utilizando um corante fluorescente intercalante a ser visualizado sob luz UV 11,12 são mais favoráveis ​​do que a execução de um gel. Os reagentes LAMP foram estáveis ​​durante um mês quando armazenada a 25 ° C e 37 ° C, que são temperatura ambiente em países tropicais e sub-tropicais onde a febre Q é endémica 13. Um ensaio de LAMP foi desenvolvido no nosso laboratório para detectar a presença de C. burnetii em amostras de plasma 14. Descrevemos aqui um protocolo simples para a preparação da mistura de reacção a partir de LAMP os reagentes liofilizados. Os reagentes liofilizados são estáveis ​​durante um mês quando armazenada à temperatura ambiente. Quando combinado com um método fácil visualização, este é um método ideal para utilizar para a detecção de C. burnetii em um ambiente de recursos limitados.

<table><tbody><tr><td>Primers LAMP</td><td>Eurofins MWG operon</td><td>10 nmol, sem sal</td><td>Sequência projetada pelo cliente</td></tr><tr><td>Bst DNA polimerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0275L</td><td>8 unidades/ml</td></tr><tr><td>10x Thermo pol buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>mistura dNTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 mM cada</td></tr><tr><td>Betaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300</td><td>5 M, Trimetilglicina</td></tr><tr><td>Sulfato</td><td>de magnésio Sigma-Aldrich</td><td>M3409-1ML</td><td>1 M</td></tr><tr><td>10x Bluejuice</td><td>Invitrogen</td><td>10816-015</td><td>tampão de carregamento de gel</td></tr><tr><td>SYBR verde</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td>10.000x, visualize produtos em tubos</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Phenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>10.000x, visualize produtos em géis</td></tr><tr><td>Reagentes liofilizados</td><td>Gene Reach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidroxinaftol azul</td><td>Fluka</td><td>33936-10G</td><td></td></tr><tr><td>ESEQuant scanner de tubo</td><td>Qiagen</td><td></td><td>detecção em tempo real</td></tr></tbody></table>

o desenvolvimento da liofilizado loop-mediadas isotérmicas de amplificação reagentes para a detecção de<em&gt; burnetii coxiella</em

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, o agente causador da febre Q, é uma bactéria intracelular obrigatório. Ensaios de diagnóstico baseado em PCR, têm sido desenvolvidos para a detecção de C. ADN burnetii em culturas de células e amostras clínicas. PCR exige equipamento especializado e treinamento extensivo usuário final e, portanto, não é adequado para o trabalho de rotina, especialmente em uma área de recursos limitados. Nós desenvolvemos um ensaio de amplificação isotérmica mediada por ciclo (LAMP) para detectar a presença de C. burnetii em amostras de doentes. Este método é realizado em uma única temperatura de cerca de 60 ° C em um banho-maria ou bloco de aquecimento. A sensibilidade deste ensaio de LAMP é muito semelhante a PCR com um limite de detecção de cerca de 25 cópias por reacção. Este relatório descreve a preparação de reacção, utilizando reagentes liofilizados e visualização dos resultados utilizando azul hydroxynaphthol (HNB) ou uma lâmpada de UV com corante fluorescente intercalante na reacção. Os reagentes LAMP foram lyophilized e armazenado à temperatura ambiente (TA) durante um mês sem perda de sensibilidade de detecção. Este ensaio LAMP é particularmente robusto, porque a preparação da mistura de reacção não envolve etapas complexas. Este método é ideal para uso em ambientes de recursos limitados onde a febre Q é endêmica.

Os reagentes liofilizados LAMP no interior do tubo de 0,2 ml contém polimerase de ADN Bst, iniciadores e os dNTP. 20 ul de tampão de reconstituição é utilizado para re-suspender os reagentes liofilizados. A Figura 1 mostra os resultados da reacção LAMP em géis de agarose com reagentes recém-preparados e reagentes liofilizados. O reagente liofilizado não reduz a sua actividade. Reacções LAMP preparados por ambos os reagentes pode detectar 25 cópias de ADN molde. ...

Descrevemos aqui um método simples de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) usando reagentes liofilizados para a detecção de C. burnetii em amostras de pacientes.

O Desenvolvimento da liofilizado Loop-mediadas isotérmicas de amplificação Reagentes para a detecção de<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

O objetivo geral deste experimento é desenvolver um método LAMP simples utilizando reagentes liofilizados para a detecção de C.burnetii em amostras de pacientes. A principal vantagem deste protocolo é que não é necessária nenhuma refrigeração para o armazenamento dos reagentes. Este método é ideal para uso em ambientes com recursos limitados onde a febre Q é endêmica.A demonstração do procedimento será feita por Tatiana, uma técnica do nosso laboratório. Começando com o DNA do gene alvo IS1111a de C.burnetii RSA493, determine a concentração do plasmídeo com um espectrofotômetro em 260 nanômetros. Converta a concentração de DNA plasmidial em número de cópias utilizando os seguintes cálculos, em que 6330 corresponde ao comprimento em pares de bases do plasmídeo, e 34,2 nanogramas por microlitro é a concentração do plasmídeo, conforme determinado recentemente com o espectrofotômetro.Em seguida, prepare diluições seriadas de 8 a 10 vezes do plasmídeo para obter o seguinte número de cópias por microlitro. Para preparar o molde de DNA para a reação de LAMP, inicie com 200 microlitros de amostras de plasma humano e, com o kit de miniprep de DNA, extraia o DNA de acordo com o protocolo do

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Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Domesle, K. J., et al. Amplificação isotérmica mediada por laços para triagem de Salmonella em alimentos de origem animal e confirmação de Salmonela por isolamento em cultura.  J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra a técnica de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) para detectar um gene bacteriano alvo amplificando o DNA a temperatura constante. A mistura de reação é preparada adicionando uma mistura mestre isotérmica, primers específicos para o gene-alvo e amostras contendo...

Amplificação isotérmica mediada por alça para detecção de genes bacterianos

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Isothermal amplificação (lâmpada), Ensaios mediada por loop para detecção específica da espécie os de<em&gt; Eimeria</em&gt; Que infectam Galinhas

Fornecido é um protocolo para o desenvolvimento de um ensaio de amplificação da polimerase recombinase em tempo real para quantificar a concentração inicial de amostras de DNA usando um termociclador ou um microscópio e aquecedor de platina. Também é descrito o desenvolvimento de um controle positivo interno. Os scripts são fornecidos para processar dados brutos de fluorescência em tempo real.

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Coxiella burnetii é uma bactéria intracelular obrigatório Gram-negativa responsável pela febre Q doença zoonótica. Aqui, descrevemos métodos para a geração de mutantes por transposões Coxiella fluorescente, bem como a identificação e análise automatizada dos internalização, replicação e citotóxicos fenótipos resultantes.

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