Name: O Desenvolvimento da liofilizado Loop-mediadas isotérmicas de amplificação Reagentes para a detecção de Burnetii Coxiella (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprenda o método LAMP com reagentes liofilizados para detectar Coxiella burnetii em amostras de pacientes. Esta técnica simplificada é ideal para diagnóstico em regiões com recursos limitados onde a febre Q é endêmica.

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Esta pesquisa foi apoiada pela Naval Medical Research Center, a pesquisa unidade de trabalho 6000.RAD1.J.A0310. As opiniões expressas neste artigo são de responsabilidade dos autores e não reflecte necessariamente a política oficial ou a posição do Departamento da Marinha, Departamento de Defesa, ou do Governo dos Estados Unidos. Wei-Mei Ching é um funcionário do governo dos EUA. Este trabalho foi preparado como parte de seus deveres oficiais. Título 17 USC §105 prevê que «proteção dos direitos autorais sob este título não está disponível para qualquer obra do Governo dos Estados Unidos. &#39; Título 17 USC §101 define uma obra governo dos Estados Unidos como um trabalho preparado pelo membro do serviço militar ou funcionário do governo dos EUA como parte de suas funções oficiais dessa pessoa.

1. Preparar diluições de DNA plasmídico como padrão para a Reacção LAMP <ol><li> Utilizar um espectrofotómetro para determinar a densidade óptica (OD) a 260 nm para determinar o plasmídeo (contendo IS1111a gene alvo de C. burnetii RSA 493) a concentração de ADN. Um OD 260 de 1 é igual a 50 ug / ul de ADN. </li><li> Converter a quantidade de DNA de plasmídeo no número de cópias. Uma vez que o tamanho do plasmídeo é 6330 pb, o peso molecular deste plasmídeo é de 4,1 x 10 6 g (6,330 pb x 649 g / BP). A concentração do ADN do plasmídeo é 34,2 ng / mL (tal como determinado a partir do passo 1.1). 1 ul desta amostra de ADN contém 34,2 ng de ADN plasmídico, o equivalente a 5 x 10 9 cópias (34,2 x 10 -9 g / 4,1 x 10 6 6,02 x 10 gx 23) de ADN. </li><li> Adicionar 10 ul de ADN de plasmídeo (5 x 10 9 cópias / mL) a 90 uL de água para uma diluição de 10 vezes para fazer uma amostra de ADN de 5 x 10 8 cópias / ul. </li><li> Repetir o passo 1.3 para preparar amostras de ADN de 5 x 10 7, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 x 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1, e 5 x 10 0 cópias / ul. </li></ol> 2. Prepare Template DNA a partir de amostras de Reacção LAMP <ol><li> Realizar a extracção do ADN a partir de amostras de plasma humano, utilizando um kit de ADN de mini-comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Usar um total de 200 ul de amostra para a extracção e eluir o DNA extraído num volume de 20 ul. </li></ol> 3. Prepare 2x Tampão LAMP Reaction <ol><li> Misturar 200 mL de 10x tampão de Pol, 320 ul de 5 M trimetilglicina, 12 ul de 1 M de MgSO4, 280 uL de mistura de dNTP (10 mM cada) e 188 ul de água para perfazer 1 ml de tampão de 2x LAMP. Misture por pulso-vórtex durante 10 segundos. </li></ol> 4. Execute lâmpada padrão Reaction <ol><li> Misture 12,5 ul de 2x LATampão PM (tal como preparado no passo 3; Tris-HCl 40 (pH 8,8), KCl 20 mM, MgSO mM 16 4, 20 mM de (NH 4) 2 SO 4, 0,2% de Triton X-100, trimetilglicina 1,6 M, 1,4 mistura de dNTP mM), 1,2 ul de mistura de iniciadores, 1 mL de polimerase de ADN Bst (8 U / ul) e 5,3 ul de água para tornar a mistura de reacção (20 ul) num tubo de PCR de 0,2 ml. </li><li> Adicionar 5 uL de ADN (do passo 1 ou 2) para a mistura reaccional de 20 ul e misturar bem. </li><li> Primeiro tubo e incubar a 60 ° C durante 60 min num banho-maria ou bloco de aquecimento. Esta é a temperatura de reacção óptima previamente determinada. </li><li> Adicionar 5 uL de tampão de carga de gel de 10x para terminar a reacção. </li><li> Carga de 5 ul dos produtos de reacção a um gel de agarose a 2% corado com intercalando mancha de ácido nucleico. </li><li> Executar gel a 100 V durante 35 min em tampão 1 x TBE. </li><li> Visualize os resultados por luz UV. </li></ol> 5. Execute Reaction LAMP com Reconstituídoreagentes <ol><li> Misturar 125 ul de Tampão 10 x Pol, 200 mL de 5 M trimetilglicina, 7,5 ul de 1 M de MgSO4, 667,5 ul de água para perfazer 1 ml de tampão de reconstituição. Misture por pulso-vórtex durante 10 segundos. </li><li> Retire os tubos que contêm os reagentes liofilizados a partir do saco de folha de alumínio selado. Não utilize os tubos se o saco de folha de alumínio não está vedada ou se ele estiver danificado. </li><li> Adicionar 20 ul de tampão de reconstituição em cada tubo para ressuspender reagentes liofilizados. </li><li> Misture pipetando tampão cima e para baixo 5 vezes. Dê uma olhada para garantir que os reagentes liofilizados são completamente re-suspensa. O pó branco deve desaparecer no tubo. </li><li> Adicionam-se 5 ul de molde de ADN (do passo 1 ou 2) para os reagentes reconstituídos e misturar bem. </li><li> Primeiro tubo e incubar a 60 ° C durante 60 min num banho-maria ou bloco de aquecimento. </li><li> Adicionar 5 uL de tampão de carga de gel de 10x para terminar a reacção. </li><li> Carga de 5 ul de reacçãoprodutos para um gel de agarose a 2% corado com corante intercalante ácido nucleico. </li><li> Executar gel a 100 V durante 35 min em tampão 1 x TBE. </li><li> Visualize os resultados por luz UV. </li></ol> 6. Execute LAMP Reação com Reconstituição tampão contendo HNB ou fluorescente intercalando Dye <ol><li> Misturar 125 mL de 10x Pol de Amortecimento, 200 mL de 5 M trimetilglicina, 7,5 ul de 1 M de MgSO4, 7,5 ul de HNB 20 mM (ou 12,5 ul de 100x corante fluorescente intercalante) e 660 uL (ou 655 ul) de água para fazer 1 ml de tampão de reconstituição. Misture por pulso-vórtex durante 10 segundos. </li><li> Use o tampão reconstituído preparado na seção 6 para repetir os passos 5.2 - 5.6. </li><li> Visualize os resultados por a olho nu (reacção contendo HNB) ou uma luz UV (reacção contendo corante de intercalação fluorescente). </li></ol> 7. Realizar em tempo real Reaction LAMP com Scanner Tubo <ol><li> Adicionam-se 5 ul de DNA para o reconstitutreagentes ed contendo corante de intercalação fluorescente, perto do tubo e inseri-lo para o scanner tubo. </li><li> Ajuste da temperatura de incubação a 60 ° C. Medir a fluorescência a 520 nm durante 60 min. </li></ol>

<ol><li>Anderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+Q+fever+United+States%2C+2013%3A+recommendations+from+CDC+and+the+Q+Fever+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Recomm.+Rep%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group.</a> MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).</li>
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<li>Chen, H. W., Ching, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+rapid+and+easy+detection+of+Coxiella+Burnetii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii.</a> J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Anteriormente, foi desenvolvido um ensaio LAMP sensível e específico visando o elemento de inserção IS1111a 14. O elemento IS1111 foi selecionado porque ele é altamente conservado entre as diferentes estirpes de C. burnetii e o seu elevado número de cópias (7-110) em que as bactérias (Klee 2006). Os nossos resultados mostraram que a lâmpada pode detectar cerca de 25 cópias do elemento IS1111, que pode correlacionar-se com tão pouco como uma única cópia cromossómica de ADN <...

A pequena bactéria gram-negativa Coxiella burnetii é o agente causador da febre Q, que é uma zoonose em todo o mundo. Devido à distribuição mundial da febre Q ea alta infectividade do C. burnetii, pessoal militar e civil dos Estados Unidos desdobradas no exterior estão em risco de serem infectados nas áreas endêmicas. febre Q manifesta de duas formas: infecções agudas e crónicas. Febre Q aguda apresenta-se com sintomas semelhantes aos da gripe, hepatite ou pneumonia, e geralmente é uma doença autolimitada, com uma taxa de mortalidade baixa. Febre Q crónica, embora menos prevalente, muitas vezes resulta em endocardite, que tem uma taxa de mortalidade muito maior se não tratada 1,2. Portanto, o diagnóstico precoce para orientar um tratamento adequado é fundamental para o atendimento ao paciente. Reacção em cadeia da polimerase (PCR) e PCR quantitativo em tempo real (qPCR) ensaios foram desenvolvidos para a detecção de C. DNA burnetii em culturas de células e amostras clínicas 3-5 &lt;/ Sup&gt;. Ambos PCR e qPCR são caros e muitas vezes não é facilmente disponível em áreas com recursos limitados para o trabalho de rotina. Originalmente descrito por Notomi 6, amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) oferece um método de amplificação de DNA alternativa. LAMP utiliza ADN-polimerase Bst ADN para a síntese de deslocamento de cadeia, juntamente com conjuntos de iniciadores especialmente concebidos para que reconhecem, pelo menos, seis regiões independentes do gene alvo. A vantagem mais significativa de LAMP é que a amplificação ocorre sob condições isotérmicas. Por conseguinte, apenas um banho de água, ou um bloco de aquecimento da incubadora é necessária. Este método tem sido utilizado para detectar vários agentes patogénicos rickettsiais 7-9. A visualização dos produtos de ADN amplificados por electroforese em gel é o método mais preciso que pode diferenciar a partir de verdadeiros positivos falsos positivos devido à amplificação não específica. No entanto, os procedimentos envolvidos na electroforese em gel não são práticos para ar de recursos limitadoseas. Vários métodos alternativos foram desenvolvidos para detectar os produtos de reacção. Estes alternativa, tal como turbidez derivado de pirofosfato de magnésio formação 10 ou utilizando um corante fluorescente intercalante a ser visualizado sob luz UV 11,12 são mais favoráveis ​​do que a execução de um gel. Os reagentes LAMP foram estáveis ​​durante um mês quando armazenada a 25 ° C e 37 ° C, que são temperatura ambiente em países tropicais e sub-tropicais onde a febre Q é endémica 13. Um ensaio de LAMP foi desenvolvido no nosso laboratório para detectar a presença de C. burnetii em amostras de plasma 14. Descrevemos aqui um protocolo simples para a preparação da mistura de reacção a partir de LAMP os reagentes liofilizados. Os reagentes liofilizados são estáveis ​​durante um mês quando armazenada à temperatura ambiente. Quando combinado com um método fácil visualização, este é um método ideal para utilizar para a detecção de C. burnetii em um ambiente de recursos limitados.

<table><tbody><tr><td>Primers LAMP</td><td>Eurofins MWG operon</td><td>10 nmol, sem sal</td><td>Sequência projetada pelo cliente</td></tr><tr><td>Bst DNA polimerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0275L</td><td>8 unidades/ml</td></tr><tr><td>10x Thermo pol buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>mistura dNTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 mM cada</td></tr><tr><td>Betaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300</td><td>5 M, Trimetilglicina</td></tr><tr><td>Sulfato</td><td>de magnésio Sigma-Aldrich</td><td>M3409-1ML</td><td>1 M</td></tr><tr><td>10x Bluejuice</td><td>Invitrogen</td><td>10816-015</td><td>tampão de carregamento de gel</td></tr><tr><td>SYBR verde</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td>10.000x, visualize produtos em tubos</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Phenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>10.000x, visualize produtos em géis</td></tr><tr><td>Reagentes liofilizados</td><td>Gene Reach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidroxinaftol azul</td><td>Fluka</td><td>33936-10G</td><td></td></tr><tr><td>ESEQuant scanner de tubo</td><td>Qiagen</td><td></td><td>detecção em tempo real</td></tr></tbody></table>

o desenvolvimento da liofilizado loop-mediadas isotérmicas de amplificação reagentes para a detecção de<em&gt; burnetii coxiella</em

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, o agente causador da febre Q, é uma bactéria intracelular obrigatório. Ensaios de diagnóstico baseado em PCR, têm sido desenvolvidos para a detecção de C. ADN burnetii em culturas de células e amostras clínicas. PCR exige equipamento especializado e treinamento extensivo usuário final e, portanto, não é adequado para o trabalho de rotina, especialmente em uma área de recursos limitados. Nós desenvolvemos um ensaio de amplificação isotérmica mediada por ciclo (LAMP) para detectar a presença de C. burnetii em amostras de doentes. Este método é realizado em uma única temperatura de cerca de 60 ° C em um banho-maria ou bloco de aquecimento. A sensibilidade deste ensaio de LAMP é muito semelhante a PCR com um limite de detecção de cerca de 25 cópias por reacção. Este relatório descreve a preparação de reacção, utilizando reagentes liofilizados e visualização dos resultados utilizando azul hydroxynaphthol (HNB) ou uma lâmpada de UV com corante fluorescente intercalante na reacção. Os reagentes LAMP foram lyophilized e armazenado à temperatura ambiente (TA) durante um mês sem perda de sensibilidade de detecção. Este ensaio LAMP é particularmente robusto, porque a preparação da mistura de reacção não envolve etapas complexas. Este método é ideal para uso em ambientes de recursos limitados onde a febre Q é endêmica.

Os reagentes liofilizados LAMP no interior do tubo de 0,2 ml contém polimerase de ADN Bst, iniciadores e os dNTP. 20 ul de tampão de reconstituição é utilizado para re-suspender os reagentes liofilizados. A Figura 1 mostra os resultados da reacção LAMP em géis de agarose com reagentes recém-preparados e reagentes liofilizados. O reagente liofilizado não reduz a sua actividade. Reacções LAMP preparados por ambos os reagentes pode detectar 25 cópias de ADN molde. ...

Descrevemos aqui um método simples de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) usando reagentes liofilizados para a detecção de C. burnetii em amostras de pacientes.

O Desenvolvimento da liofilizado Loop-mediadas isotérmicas de amplificação Reagentes para a detecção de<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

O objetivo geral deste experimento é desenvolver um método LAMP simples utilizando reagentes liofilizados para a detecção de C.burnetii em amostras de pacientes. A principal vantagem deste protocolo é que não é necessária nenhuma refrigeração para o armazenamento dos reagentes. Este método é ideal para uso em ambientes com recursos limitados onde a febre Q é endêmica.A demonstração do procedimento será feita por Tatiana, uma técnica do nosso laboratório. Começando com o DNA do gene alvo IS1111a de C.burnetii RSA493, determine a concentração do plasmídeo com um espectrofotômetro em 260 nanômetros. Converta a concentração de DNA plasmidial em número de cópias utilizando os seguintes cálculos, em que 6330 corresponde ao comprimento em pares de bases do plasmídeo, e 34,2 nanogramas por microlitro é a concentração do plasmídeo, conforme determinado recentemente com o espectrofotômetro.Em seguida, prepare diluições seriadas de 8 a 10 vezes do plasmídeo para obter o seguinte número de cópias por microlitro. Para preparar o molde de DNA para a reação de LAMP, inicie com 200 microlitros de amostras de plasma humano e, com o kit de miniprep de DNA, extraia o DNA de acordo com o protocolo do fabricante. Dilua a amostra final em um volume de 20 microlitros.Prepare 1 mililitro do tampão de reação LAMP 2x combinando os seguintes reagentes. Misture por vortexagem rápida durante 10 segundos. Para realizar a reação LAMP padrão, em um tubo PCR de 0,2 mililitro, misture 12,5 microlitros do tampão LAMP 2x, 1,2 microlitros da mistura de iniciadores, 1 microlitro da polimerase Bst DNA e 5,3 microlitros de água.Em seguida, adicione 5 microlitros de DNA à reação de 20 microlitros e misture bem, depois incube a 60 graus Celsius em banho-maria ou bloco aquecedor por 60 minutos. Após a incubação, interrompa a reação adicionando 5 microlitros de tampão de carregamento para gel 10x ao tubo. Em seguida, carregue 5 microlitros dos produtos da reação em um gel de agarose 2% corado com corante intercalante de ácidos nucleicos.Execute o gel em TBE 1x a 100 volts durante 35 minutos, depois utilize luz UV para visualizar os resultados. Para realizar a reação LAMP com reagentes reconstituídos, prepare 1 mililitro de tampão de reconstituição combinando os seguintes reagentes. Misture com vortex de pulso por 10 segundos.Em seguida, retire os tubos que continham os reagentes liofilizados do saco de folha de alumínio lacrado. Para a Etapa 4.2, é muito importante garantir que o saco de folha de alumínio esteja adequadamente selado antes de abri-lo. Não utilize os tubos se o saco de alumínio não estiver selado ou estiver danificado.Adicione 20 microlitros de tampão de reconstituição a cada tubo de reagentes e misture pipetando para cima e para baixo cinco vezes. Certifique-se de que os reagentes liofilizados sejam completamente ressuspendidos. Em seguida, adicione 5 microlitros de molde de DNA aos reagentes reconstituídos e misture bem.Incube a 60 graus Celsius em banho-maria ou bloco de aquecimento por 60 minutos. Para encerrar a reação após a incubação, adicione 5 microlitros de tampão de carregamento para gel 10x e, em seguida, adicione 5 microlitros dos produtos da reação em um gel de agarose 2% corado com corante intercalante de ácidos nucleicos. Execute o gel em tampão TBE 1x a 100 volts por 35 minutos e, então, visualize os resultados sob luz ultravioleta.Para realizar a reação LAMP com azul de hidroxinaftol, ou HNB, ou corante intercalante, prepare 1 mililitro de tampão de reconstituição combinando os seguintes reagentes que incluem HNB ou um corante intercalante fluorescente. Misture por vortexagem rápida durante 10 segundos. Realize a reação LAMP conforme descrito acima e utilize luz ultravioleta ou olho nu para visualizar os resultados.Para realizar a reação LAMP com um escâner de tubos, adicione 5 microlitros de DNA aos reagentes reconstituídos contendo o corante fluorescente intercalante, em seguida insira o tubo fechado no escâner de tubos. Ajuste a temperatura de incubação para 60 graus Celsius e meça a fluorescência em 520 nanômetros durante 60 minutos. Esta figura mostra os resultados da reação LAMP em géis de agarose com reagentes recém-preparados e reagentes liofilizados.Observe que o reagente liofilizado mantém sua atividade. As reações de LAMP preparadas com ambos os reagentes detectaram 25 cópias do molde de DNA. Nesta figura, é mostrada a detecção dos produtos da reação com HNB ou corante fluorescente intercalante na reação.A adição de HNB à reação produz uma mudança visual de cor, de roxo para azul, com 25, 50 e 100 cópias do molde de DNA presentes nas reações. Além disso, a inclusão de corante fluorescente intercalante na reação mostra um sinal fluorescente forte sob luz UV quando números semelhantes de cópias de DNA estão presentes. São apresentados aqui os resultados do uso do escâner de tubos para monitorar em tempo real os sinais fluorescentes com corante intercalante fluorescente.Os sinais fluorescentes estão acima da linha de base após 14, 18, 21 e 23 minutos, com 10^6, 10^4, 10^3 e 100 cópias do molde de DNA nas reações. Uma vez dominado, este procedimento pode ser realizado em 90 minutos. Após seu desenvolvimento, este ensaio abriu caminho para o diagnóstico rápido da infecção por Coxiella burnetii em áreas com recursos limitados.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como reconstituir reagentes LAMP liofilizados. Não se esqueça de que amostras de pacientes podem ser infecciosas e que precauções de segurança devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Domesle, K. J., et al. Amplificação isotérmica mediada por laços para triagem de Salmonella em alimentos de origem animal e confirmação de Salmonela por isolamento em cultura.  J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra a técnica de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) para detectar um gene bacteriano alvo amplificando o DNA a temperatura constante. A mistura de reação é preparada adicionando uma mistura mestre isotérmica, primers específicos para o gene-alvo e amostras contendo...

Amplificação isotérmica mediada por alça para detecção de genes bacterianos

Este vídeo demonstra um método para avaliar o crescimento intracelular de mutantes de Coxiella marcados com GFP dentro de células epiteliais cultivadas. O fenótipo mutante é visualizado por meio de imunocoloração e microscopia de epifluorescência, permitindo o estudo do efeito da mutação no crescimento intracelular.

Avaliação do crescimento intracelular de mutantes de Coxiella em células eucarióticas

O diagnóstico de infecção por Eimeria em galinhas continua exigente. As abordagens baseadas na morfologia do parasita e na patologia do hospedeiro são comumente inconclusivas, enquanto as abordagens moleculares baseadas em PCR provaram ser exigentes em custo e experiência. O objetivo deste protocolo é estabelecer a amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP) como um diagnóstico molecular direto para infecção eimeriana.

Isothermal amplificação (lâmpada), Ensaios mediada por loop para detecção específica da espécie os de<em&gt; Eimeria</em&gt; Que infectam Galinhas

Fornecido é um protocolo para o desenvolvimento de um ensaio de amplificação da polimerase recombinase em tempo real para quantificar a concentração inicial de amostras de DNA usando um termociclador ou um microscópio e aquecedor de platina. Também é descrito o desenvolvimento de um controle positivo interno. Os scripts são fornecidos para processar dados brutos de fluorescência em tempo real.

Desenvolvimento de um Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Ensaio com um controlo positivo interno

Coxiella burnetii é uma bactéria intracelular obrigatório Gram-negativa responsável pela febre Q doença zoonótica. Aqui, descrevemos métodos para a geração de mutantes por transposões Coxiella fluorescente, bem como a identificação e análise automatizada dos internalização, replicação e citotóxicos fenótipos resultantes.

Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

Aqui, apresentamos um protocolo para o desenvolvimento e validação de um método de PCR quantitativo utilizado para a detecção e quantificação do DNA do EHV-2 em fluidos respiratórios equinos. O protocolo de validação EHV-2 qRT-PCR envolve um procedimento de três partes: desenvolvimento, caracterização do ensaio qRT-PCR sozinho e caracterização de todo o método analítico.

Desenvolvimento e validação de um método PCR quantitativa para equídeo herpesvírus 2 Diagnostics em fluidos respiratórios

Investigar as interações entre patógenos bacterianos e seus hospedeiros é uma importante área de pesquisa biológica. Aqui, descrevemos as técnicas necessárias para medir efetoras translocação por Coxiella burnetii durante o silenciamento do gene siRNA usando substrato BlaM.

Aplicando Transferência de ressonância de fluorescência Energia (FRET) para examinar Eficiência Effector translocação pela<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA silenciamento

Este protocolo descreve a fabricação de uma gaveta pequena, ready-to-use que pode ser aplicada para a detecção visual de vários ácidos nucleicos em um teste único, que é fácil de operar. Nesta abordagem, uma matriz capilar foi usado para multiplex e altamente eficiente detecção de alvos de OGM.

Detecção visual de vários ácidos nucleicos em uma matriz capilar

Amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) é um teste isotémico de amplificação de ácido nucleico (iNAAT) que tem atraído amplo interesse no campo de detecção de patógenos. Aqui, apresentamos um protocolo salmonella LAMP validado em vários laboratórios como um método rápido, confiável e robusto para a triagem de Salmonella em alimentos animais e confirmando salmonela presuntiva do isolamento cultural.

Amplificação isotérmica mediada por loop para triagem de salmonela em alimentos animais e confirmando salmonela do isolamento cultural

O presente trabalho descreve as etapas para a produção de qPCR pronta para uso para detecção de DNA de T. cruzi que pode ser pré-carregada no vaso de reação e armazenada na geladeira por vários meses.

QPCR pronto para uso para detecção de DNA de Trypanosoma cruzi ou outros organismos patogênicos

Vários patógenos bacterianos podem causar infecções do trato respiratório e levar a sérios problemas de saúde se não forem detectados com precisão e tratados prontamente. A detecção rápida e precisa desses patógenos por meio de amplificação isotérmica mediada por loop fornece gerenciamento e controle eficazes de infecções do trato respiratório em ambientes clínicos.

Detecção rápida de patógenos bacterianos que causam infecções do trato respiratório inferior por meio de amplificação isotérmica mediada por loop baseada em chip microfluídico

Aprenda o método LAMP com reagentes liofilizados para detectar Coxiella burnetii em amostras de pacientes. Esta técnica simplificada é ideal para diagnóstico em regiões com recursos limitados onde a febre Q é endêmica.

O Desenvolvimento da liofilizado Loop-mediadas isotérmicas de amplificação Reagentes para a detecção de

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