O Desenvolvimento da liofilizado Loop-mediadas isotérmicas de amplificação Reagentes para a detecção de Burnetii Coxiella

O objetivo geral deste experimento é desenvolver um método LAMP simples usando reagentes liofilizados para a detecção de C. burnetii em amostras de pacientes. A principal vantagem deste protocolo é que não é necessário treinamento para o armazenamento dos reagentes. Esse método é ideal para uso em ambientes com recursos limitados, onde a febre Q é endêmica.

Demonstrando o procedimento estará Tatiana, uma técnica do nosso laboratório. Começando com o DNA para o gene alvo IS1111a de C. burnetii RSA493, determine a concentração de plasmídeo com um espectrofotômetro a 260 nanômetros. Converta a concentração de DNA do plasmídeo em número de cópias usando os seguintes cálculos, onde 6330 é igual ao comprimento e aos pares de bases do plasmídeo e 34,2 nanogramas por microlitro é a concentração do plasmídeo, conforme determinado usando o espectrofotômetro.

Em seguida, prepare diluições seriais de 8 a 10 vezes do plasmídeo para chegar ao seguinte número de cópias por microlitro. Para preparar o molde de DNA para a reação LAMP, comece com 200 microlitros de amostras de plasma humano e, com o kit de minipreparação de DNA, extraia o DNA de acordo com o protocolo do fabricante. Diluir a amostra final em um volume de 20 microlitros.

Prepare 1 mililitro de tampão de reação 2x LAMP combinando os seguintes reagentes. Misture por vórtice de pulso por 10 segundos. Para realizar a reação LAMP padrão, em um tubo de PCR de 0,2 mililitro, misture 12,5 microlitros de tampão 2x LAMP, 1,2 microlitros de mistura de primer, 1 microlitro de Bst DNA polimerase e 5,3 microlitros de água.

Em seguida, adicione 5 microlitros de DNA à reação de 20 microlitros e misture bem, depois incube a 60 graus Celsius em banho-maria ou bloco de aquecimento por 60 minutos. Após a incubação, termine a reação adicionando 5 microlitros de tampão de carregamento de gel 10x ao tubo. Em seguida, coloque 5 microlitros dos produtos da reação em um gel de agarose 2% corado com coloração de ácido nucleico intercalante.

Execute o gel em 1x TBE a 100 volts por 35 minutos e, em seguida, use luz ultravioleta para visualizar os resultados. Para realizar a reação LAMP com reagentes reconstituídos, prepare 1 mililitro de tampão de reconstituição combinando os seguintes reagentes. Misture por vórtice de pulso por 10 segundos.

Em seguida, remova os tubos que continham os reagentes liofilizados do saco de folha de alumínio lacrado. Para a Etapa 4.2, é muito importante certificar-se de que o saco de folha de alumínio esteja devidamente selado antes de abri-lo. Não use os tubos se o saco de alumínio não estiver selado ou estiver danificado.

Adicione 20 microlitros de tampão de reconstituição a cada tubo de reagentes e misture pipetando para cima e para baixo cinco vezes. Certifique-se de que os reagentes liofilizados sejam completamente ressuspensos. Em seguida, adicione 5 microlitros de molde de DNA aos reagentes reconstituídos e misture bem.

Incube a 60 graus Celsius em banho-maria ou bloco de aquecimento por 60 minutos. Para encerrar a reação após a incubação, adicione 5 microlitros de tampão de carregamento de gel 10x e, em seguida, adicione 5 microlitros dos produtos da reação a um gel de agarose a 2% corado com coloração de ácido nucleico intercalante. Execute o gel em 1x tampão TBE a 100 volts por 35 minutos e, em seguida, visualize os resultados por luz ultravioleta.

Para realizar a reação LAMP com azul de hidroxinatol, ou HNB, ou corante intercalante, prepare 1 mililitro de tampão de reconstituição combinando os seguintes reagentes que incluem HNB ou um corante intercalante fluorescente. Misture por vórtice de pulso por 10 segundos. Realize a reação LAMP conforme descrito e use luz ultravioleta ou a olho nu para visualizar os resultados.

Para realizar a reação LAMP com um scanner de tubo, adicione 5 microlitros de DNA aos reagentes reconstituídos contendo o corante intercalante fluorescente e, em seguida, insira o tubo fechado no scanner de tubo. Defina a temperatura de incubação para 60 graus Celsius e meça a fluorescência em 520 nanômetros por 60 minutos. Esta figura mostra os resultados da reação LAMP em géis de agarose com reagentes recém-preparados e reagentes liofilizados.

Observe que o reagente liofilizado mantém sua atividade. As reações LAMP preparadas por ambos os reagentes detectaram 25 cópias do molde de DNA. Nesta figura, é mostrada a detecção dos produtos da reação com HNB ou corante intercalante fluorescente na reação.

A adição de HNB à reação produz uma mudança visual de cor, de roxo para azul, com 25, 50 e 100 cópias do molde de DNA presentes nas reações. Além disso, a inclusão de corante intercalante fluorescente na reação mostra um forte sinal fluorescente com luz UV quando números semelhantes de cópias de DNA estão presentes. Aqui estão os resultados do uso do scanner de tubo para monitorar os sinais fluorescentes em tempo real com corante intercalante fluorescente.

Os sinais fluorescentes estão acima da linha de base após 14, 18, 21 e 23 minutos, com 10 ^ 6, 10 ^ 4, 10 ^ 3 e 100 cópias do molde de DNA nas reações. Uma vez dominado, este procedimento pode ser feito em 90 minutos. Após seu desenvolvimento, este ensaio abriu caminho para o diagnóstico rápido da infecção por Coxiella burnetii em áreas com recursos limitados.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como reconstituir reagentes LAMP liofilizados. Não se esqueça de que as amostras de pacientes podem ser infecciosas e precauções de segurança devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.