O Desenvolvimento da liofilizado Loop-mediadas isotérmicas de amplificação Reagentes para a detecção de

O objetivo geral deste experimento é desenvolver um método LAMP simples utilizando reagentes liofilizados para a detecção de C.burnetii em amostras de pacientes. A principal vantagem deste protocolo é que não é necessária nenhuma refrigeração para o armazenamento dos reagentes. Este método é ideal para uso em ambientes com recursos limitados onde a febre Q é endêmica.

A demonstração do procedimento será feita por Tatiana, uma técnica do nosso laboratório. Começando com o DNA do gene alvo IS1111a de C.burnetii RSA493, determine a concentração do plasmídeo com um espectrofotômetro em 260 nanômetros. Converta a concentração de DNA plasmidial em número de cópias utilizando os seguintes cálculos, em que 6330 corresponde ao comprimento em pares de bases do plasmídeo, e 34,2 nanogramas por microlitro é a concentração do plasmídeo, conforme determinado recentemente com o espectrofotômetro.

Em seguida, prepare diluições seriadas de 8 a 10 vezes do plasmídeo para obter o seguinte número de cópias por microlitro. Para preparar o molde de DNA para a reação de LAMP, inicie com 200 microlitros de amostras de plasma humano e, com o kit de miniprep de DNA, extraia o DNA de acordo com o protocolo do fabricante. Dilua a amostra final em um volume de 20 microlitros.

Prepare 1 mililitro do tampão de reação LAMP 2x combinando os seguintes reagentes. Misture por vortexagem rápida durante 10 segundos. Para realizar a reação LAMP padrão, em um tubo PCR de 0,2 mililitro, misture 12,5 microlitros do tampão LAMP 2x, 1,2 microlitros da mistura de iniciadores, 1 microlitro da polimerase Bst DNA e 5,3 microlitros de água.

Em seguida, adicione 5 microlitros de DNA à reação de 20 microlitros e misture bem, depois incube a 60 graus Celsius em banho-maria ou bloco aquecedor por 60 minutos. Após a incubação, interrompa a reação adicionando 5 microlitros de tampão de carregamento para gel 10x ao tubo. Em seguida, carregue 5 microlitros dos produtos da reação em um gel de agarose 2% corado com corante intercalante de ácidos nucleicos.

Execute o gel em TBE 1x a 100 volts durante 35 minutos, depois utilize luz UV para visualizar os resultados. Para realizar a reação LAMP com reagentes reconstituídos, prepare 1 mililitro de tampão de reconstituição combinando os seguintes reagentes. Misture com vortex de pulso por 10 segundos.

Em seguida, retire os tubos que continham os reagentes liofilizados do saco de folha de alumínio lacrado. Para a Etapa 4.2, é muito importante garantir que o saco de folha de alumínio esteja adequadamente selado antes de abri-lo. Não utilize os tubos se o saco de alumínio não estiver selado ou estiver danificado.

Adicione 20 microlitros de tampão de reconstituição a cada tubo de reagentes e misture pipetando para cima e para baixo cinco vezes. Certifique-se de que os reagentes liofilizados sejam completamente ressuspendidos. Em seguida, adicione 5 microlitros de molde de DNA aos reagentes reconstituídos e misture bem.

Incube a 60 graus Celsius em banho-maria ou bloco de aquecimento por 60 minutos. Para encerrar a reação após a incubação, adicione 5 microlitros de tampão de carregamento para gel 10x e, em seguida, adicione 5 microlitros dos produtos da reação em um gel de agarose 2% corado com corante intercalante de ácidos nucleicos. Execute o gel em tampão TBE 1x a 100 volts por 35 minutos e, então, visualize os resultados sob luz ultravioleta.

Para realizar a reação LAMP com azul de hidroxinaftol, ou HNB, ou corante intercalante, prepare 1 mililitro de tampão de reconstituição combinando os seguintes reagentes que incluem HNB ou um corante intercalante fluorescente. Misture por vortexagem rápida durante 10 segundos. Realize a reação LAMP conforme descrito acima e utilize luz ultravioleta ou olho nu para visualizar os resultados.

Para realizar a reação LAMP com um escâner de tubos, adicione 5 microlitros de DNA aos reagentes reconstituídos contendo o corante fluorescente intercalante, em seguida insira o tubo fechado no escâner de tubos. Ajuste a temperatura de incubação para 60 graus Celsius e meça a fluorescência em 520 nanômetros durante 60 minutos. Esta figura mostra os resultados da reação LAMP em géis de agarose com reagentes recém-preparados e reagentes liofilizados.

Observe que o reagente liofilizado mantém sua atividade. As reações de LAMP preparadas com ambos os reagentes detectaram 25 cópias do molde de DNA. Nesta figura, é mostrada a detecção dos produtos da reação com HNB ou corante fluorescente intercalante na reação.

A adição de HNB à reação produz uma mudança visual de cor, de roxo para azul, com 25, 50 e 100 cópias do molde de DNA presentes nas reações. Além disso, a inclusão de corante fluorescente intercalante na reação mostra um sinal fluorescente forte sob luz UV quando números semelhantes de cópias de DNA estão presentes. São apresentados aqui os resultados do uso do escâner de tubos para monitorar em tempo real os sinais fluorescentes com corante intercalante fluorescente.

Os sinais fluorescentes estão acima da linha de base após 14, 18, 21 e 23 minutos, com 10^6, 10^4, 10^3 e 100 cópias do molde de DNA nas reações. Uma vez dominado, este procedimento pode ser realizado em 90 minutos. Após seu desenvolvimento, este ensaio abriu caminho para o diagnóstico rápido da infecção por Coxiella burnetii em áreas com recursos limitados.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como reconstituir reagentes LAMP liofilizados. Não se esqueça de que amostras de pacientes podem ser infecciosas e que precauções de segurança devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.