Desenvolvimento de um Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Ensaio com um controlo positivo interno

O objetivo geral do experimento a seguir é usar a simplificação quantitativa da polimerase recombinase para quantificar a concentração de DNA de amostras desconhecidas. Isso é obtido adicionando primeiro o controle positivo interno do DNA alvo, primers de DNA e sondas marcadas com fluorescência à reação. Como segunda etapa, as reações são colocadas na máquina de PCR em tempo real, que aquece as reações para ativar as enzimas e monitora a fluorescência das sondas para detectar a geração de amplicons alvo e controle.

Em seguida, os dados fluorescentes são analisados usando um script para gerar a curva padrão e validar o ensaio. Os resultados mostram que as amostras de DNA podem ser quantificadas com precisão dentro de uma ordem de magnitude da concentração correta com base nos experimentos de validação usados para quantificar um DNA alvo do HIV. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como PCR quantitativo em tempo real, é que o RPA é isotérmico, portanto, não é necessário um termociclador caro.