Name: Desenvolvimento de um Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Ensaio com um controlo positivo interno (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a quantificar DNA usando amplificação por recombinase polimerase com controle positivo interno. Este método isotérmico oferece alternativa acessível ao PCR em tempo real para biologia molecular.

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Esta pesquisa foi financiada por uma bolsa da Fundação Bill &amp; Melinda Gates através dos Grandes Desafios em Iniciativa de Saúde Global.

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</ol>

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

A fim de obter dados de quantificação significativas usando o algoritmo MATLAB, o usuário deve selecionar os valores de entrada apropriados quando solicitado. Depois de iniciar cada script nos pontos 5 e 6, todas as variáveis ​​de entrada são automaticamente solicitado na janela de comandos e saídas são gerados automaticamente. Na Seção 5.7 o usuário é solicitado a selecionar um limite de inclinação. O valor do limiar de inclinação afecta o quadrado do coeficiente de correlação (r2) do encaixe. Ao usar dados ...

Quantitativo de amplificação de ácido nucleico é uma técnica importante para a detecção do meio ambiente, de origem alimentar, e agentes patogénicos de origem da água, bem como para diagnósticos clínicos. Em tempo real da reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) é o método padrão de ouro para a detecção sensível, específico, e quantitativa de ácidos nucleicos, por exemplo, para o HIV-1 de teste de carga virai, a detecção de agentes patogénicos bacterianos, e rastreio para muitos outros organismos 1 - 3. Durante qPCR em tempo real, os iniciadores de amplificação de ADN patógeno em ciclos, e um sinal de fluorescência que é gerada é proporcional à quantidade de ADN amplificado na amostra em cada ciclo. Uma amostra contendo uma concentração desconhecida de DNA agente patogénico pode ser quantificada utilizando uma curva padrão que relaciona a concentração inicial de ADN de amostras padrão e a hora em que o sinal fluorescente atinge um determinado limiar (ou seja, o ciclo limiar, C ou T). <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Porque qPCR em tempo real requer equipamento caro ciclos térmicos e várias horas, para receber os resultados de amplificação isotérmica técnicas alternativas, tais como a amplificação com polimerase recombinase (APR), têm sido desenvolvidos 4. Estas plataformas geralmente proporcionar resultados mais rápidos e amplificar ácidos nucleicos em, uma única temperatura mais baixa, que pode ser realizada com equipamento menos dispendioso, mais simples. RPA, o que é particularmente atractivo para aplicações de ponto de cuidados, amplifica o DNA em minutos, exige uma temperatura baixa de amplificação (37 ° C), e permanece activa na presença de impurezas de 5,6. Ensaios de RPA foram desenvolvidos para uma ampla gama de aplicações, incluindo a análise de alimentos, detecção de agentes patogénicos, o rastreio de fármacos do cancro, e a detecção de agentes biothreat 7-12. No entanto, o uso de RPA para a quantificação de ácidos nucleicos tem sido limitada 13,14. Em trabalhos anteriores, foi shown que em tempo real quantitativo RPA (qRPA) é viável 15. Aqui, um protocolo mais detalhada é fornecida para a utilização em tempo real para quantificar a RPA quantitativa amostras desconhecidas utilizando uma curva padrão, um método que é análogo à quantificação utilizando qPCR. Este protocolo descreve como realizar uma reacção de APR num termociclador para detectar ADN do VIH-1 como uma prova de conceito, bem como desenvolver um controlo positivo interno (IPC) para assegurar está a funcionar adequadamente no sistema. A coleta de dados usando um termociclador ou microscópio e análise de dados para a construção de uma curva padrão, utilizando dados de treinamento também é detalhado. Por fim, o método para quantificar amostras desconhecidas por meio de curva padrão com um script personalizado é demonstrada. Esta técnica permite qRPA quantificação de amostras com concentrações desconhecidas e tem muitas vantagens em relação a tempo real tradicional qPCR.

<table><tbody><tr>Ensaio <td></td><td></td><td></td><td>qRPA</td></tr><tr><td>HIV-1 primer avançado</td><td>Tecnologias de DNA integradas</td><td>oligos de DNA personalizados</td><td>5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>Oligos feitos sob encomenda</td> 5' do <td>ADN das tecnologias integradas do ADN das tecnologias</td> do <td>VIH-1</td> - <td>CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3 ' &nbsp;</td></tr><tr><td>Sonda HIV-1</td><td>BioSearch Technologies&nbsp;</td><td>oligos de DNA personalizados</td><td>5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3' &nbsp;</td></tr><tr><td>Sonda IPC</td><td>BioSearch Technologies&nbsp;</td><td>oligos de DNA personalizados</td><td>5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3'</td></tr><tr><td>Reagentes exo RPA (pellets, tampão de reidratação, acetato de magnésio</td><td>TwistDx</td><td>TwistAmp exo</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de tubo PCR</td><td>BioRad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>PCR tiras de tubo de tampa plana</td><td>BioRad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo Micro-selo</td><td>BioRad</td><td>558/MJ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alvo do HIV-1 (pHIV-IRES- eYFP&Delta; Env&Delta; Vif&Delta; Vpr)</td><td></td><td></td> <td>plasmídeo personalizado, ver: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Caracterização e detecção de lentivírus competente para replicação artificial de gama de hospedeiros alterada. Terapia Molecular 8, 118&ndash; 129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).</td></tr><tr><td>O ADN genómico masculino humano</td><td>aplicou Biosystems</td><td>360486</td><td></td></tr><tr><td>o frio-bloco de 96 poços</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-36700-48</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>MiniFuge</td><td>VWR</td><td>93000-196</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Tris 1,0 M, pH 8,0</td><td>EMD Millipore</td><td>648314</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH 8,0</td><td>Promega</td><td>V4321</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>IPC Desenvolvimento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryptosporidium parvum Modelo IPC</td><td>Waterborne Inc</td><td>P102C</td><td>Também é possível solicitar um alvo sintético de fita dupla da IDT se o usuário não estiver equipado para trabalhar com C. parvum (um agente infeccioso BSL-2). Os primers PCR e RPA para C. parvum foram projetados usando o número de acesso GenBank AF115377.1</td></tr><tr><td>PCR long forward primer</td> Integrated <td>DNA Technologies</td><td>oligos de DNA personalizados</td><td>5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3'</td></tr><tr><td>PCR longo reverso primer</td> Integrated <td>DNA Technologies</td><td>personalizado DNA oligos</td><td>5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3'</td></tr>Kit de extração de gel <tr><td>Phusion High-Fidelty DNA Polimerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X buffer</td><td>EMD Millipore</td><td>574797</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A9539</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Experimentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência vertical</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Imager.J1</td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor de palco</td><td>Ferramentas de biociência</td><td>TC-GSH</td><td></td></tr><tr><td>1 canal Precisão Controlador de temperatura de alta estabilidade</td><td>Ferramentas de biociência</td><td>TC-1100S</td><td></td></tr><tr><td>FAM / GFP cubo de filtro</td><td>Zeiss</td><td>conjunto de filtros 38 (000000-1031-346)</td> <td>excitação BP 470/40 nm, emissão BP 520/50 nm</td></tr><tr><td>cubo de filtro HEX</td><td>Chroma</td><td>49014</td><td>excitação BP 530/30 nm, emissão BP 575/40 nm</td></tr><tr><td>Cortador a laser</td><td>Engraver's Network</td><td>VLS3.60</td><td></td></tr><tr><td>1/8" acrílico preto</td><td>McMaster Carr</td><td>8505K113</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm acrílico transparente</td><td>McMaster Carr</td><td>PD-72268940&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Super cola</td><td>Office Depot</td><td>Duro super cola&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral de grau PCR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8662-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Análise de</td><td></td><td></td><td></td>Dados</tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MATLAB MATLAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>script MATLAB: "JoVE_qRPA_standard_curve.m"</td><td>Incluído no script SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m"</td><td>Incluído no script SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m"</td><td>Incluído no SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_well.ai</td><td>Incluído no SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_base.ai</td><td>Incluído no SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software AxioVision</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_AxioVision_Script.ziscript</td><td>Incluído no SI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de um quantitative recombinase polymerase amplification ensaio com um controlo positivo interno

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Recentemente, foi demonstrado que a amplificação da polimerase recombinase (RPA), uma plataforma de amplificação isotérmica para detecção de patógenos, pode ser usada para quantificar a concentração de amostras de DNA usando uma curva padrão. Neste manuscrito, é fornecido um protocolo detalhado para desenvolver e implementar um ensaio de amplificação da polimerase recombinase quantitativa em tempo real (ensaio qRPA). Usando a quantificação do DNA do HIV-1 como exemplo, a montagem de reações de RPA em tempo real, o design de uma sequência de controle positivo interno (IPC) e a co-amplificação do IPC e do alvo de interesse são todos descritos. São fornecidas instruções e scripts de processamento de dados para a construção de uma curva padrão usando dados de vários experimentos, que podem ser usados para prever a concentração de amostras desconhecidas ou avaliar o desempenho do ensaio. Finalmente, é descrito um método alternativo para coletar dados de fluorescência em tempo real com um microscópio e um aquecedor de platina como um passo para o desenvolvimento de um ensaio qRPA no local de atendimento. O protocolo e os scripts fornecidos podem ser usados para o desenvolvimento de um ensaio qRPA para qualquer alvo de DNA de interesse.

Antes de escolher uma sequência para servir como o IPC em experiências com qRPA alvo (HIV-1) de ADN, de controlo positivo interno (IPC) candidatos são gerados e rastreados quanto à sua capacidade para amplificar em reacções qRPA sem VIH-1 ADN presente. Candidatos IPC são mais longos do que o alvo (HIV-1) para impedir a formação de ADN de IPC competindo com o HIV-1 formação de amplicão. Como mostrado na Figura 2A, a geração de duas C. candidatos parvum IPC foi verificada pela presença d...

Fornecido é um protocolo para o desenvolvimento de um ensaio de amplificação da polimerase recombinase em tempo real para quantificar a concentração inicial de amostras de DNA usando um termociclador ou um microscópio e aquecedor de platina. Também é descrito o desenvolvimento de um controle positivo interno. Os scripts são fornecidos para processar dados brutos de fluorescência em tempo real.

Desenvolvimento de um Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Ensaio com um controlo positivo interno

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar a amplificação isotérmica mediada por recombinase quantitativa para quantificar a concentração de DNA de amostras desconhecidas. Isso é alcançado primeiramente pela adição do DNA alvo, controle interno positivo, iniciadores de DNA e sondas marcadas com fluoróforo à reação. Em um segundo passo, as reações são colocadas na máquina de PCR em tempo real, que aquece as reações para ativar as enzimas e monitora a fluorescência das sondas para detectar a geração de amplicons alvo e de controle.Em seguida, os dados fluorescentes são analisados usando um script para gerar a curva padrão e validar o ensaio. Os resultados mostram que amostras de DNA podem ser quantificadas com precisão dentro de uma ordem de grandeza da concentração correta, com base nos experimentos de validação utilizados para quantificar o DNA alvo do HIV-1. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a PCR quantitativa em tempo real, é que a RPA é isotérmica, não sendo necessário um termociclador caro.A RPA também exige uma temperatura de amplificação mais baixa, é tolerante a amostras impuras, amplifica o alvo até níveis detectáveis em minutos e utiliza enzimas liofilizadas, permitindo transporte e armazenamento fáceis à temperatura ambiente. Para começar, limpe todas as superfícies da bancada e dos equipamentos com uma solução de hipoclorito a 50% para criar um ambiente limpo antes da amplificação. Remova a solução de acetato de magnésio a 280 milimolar, o tampão de reidratação e os pelotas de reação do congelador a menos 20 graus Celsius e deixe as soluções descongelarem à temperatura ambiente. Em seguida, prepare uma mistura-mestra transferindo 383,5 microlitros do tampão de reidratação para um novo tubo microcêntrifuga, adicione 41,6 microlitros de água livre de nucleases ao tampão e vortexie para homogeneizar. Adicione 35 microlitros de acetato de magnésio a um tubo separado.Devolver o acetato de magnésio nas soluções estoque do tampão de reidratação ao congelador. Em seguida, obter o iniciador e a sonda quase do refrigerador a quatro graus Celsius. Colocá-los na área de pré-amplificação e desligar as luzes para minimizar a exposição à luz, adicionando 27,3 microlitros de cada um dos iniciadores direto e reverso a 10 micromolar à mistura mestra.A seguir, adicione 7,8 microlitros da sonda de HIV 1D NA marcada com hex, a 10 micromolar, à mistura-mestra e vórtex o tubo. Em seguida, devolva os estoques do iniciador e da sonda ao armazenamento; os reagentes para o controle interno positivo podem ser adicionados aqui conforme indicado no protocolo textual para montar as reações de QRPA. Primeiro, coloque os comprimidos enzimáticos liofilizados em tubos individuais de tiras de PCR de oito poços, com paredes baixas; pipete 37,5 microlitros da mistura-mestra em um tubo contendo um comprimido.Agite suavemente o conteúdo do tubo com a ponta da pipeta para dissolver o precipitado sem formar bolhas. Retire a ponta da reação cuidadosamente para evitar perda de volume e certifique-se de trocar as pontas da pipeta entre cada tubo. Transfira os tubos para um bloco frio de 96 poços refrigerado por pelo menos cinco minutos para resfriar a mistura mestra.Enquanto isso, carregue o software do termociclador com o protocolo e o layout da placa indicado no protocolo textual. Em seguida, corte duas tiras de adesivos plásticos transparentes micros seláveis de modo que fiquem ligeiramente mais largas que os tubos de PCR. Também obtenha duas tampas planas para tiras de tubos de PCR e alíquota o plasmídeo modelo HIV um conforme indicado no protocolo textual.Em seguida, adicione 10 microlitros do molde ao tubo de PCR apropriado. Novamente, misture suavemente o conteúdo com a ponteira da pipeta. A seguir, adicione 2,5 microlitros do acetato de magnésio em cada tampa de tubo e, depois, coloque delicadamente as tampas sobre os tubos de reação, de modo que não fiquem completamente fechadas.O acetato de magnésio deve estar claramente visível através da tampa. Coloque as tiras de tubos PCR em uma microcentrífuga e centrifugue os tubos por 10 segundos para reunir todo o líquido no fundo do tubo e remover quaisquer bolhas. A combinação da solução de acetato de magnésio com a mistura mestra inicia a reação de QRPA.Retire rapidamente os tubos de PCR para o bloco frio para interromper a reação. Em seguida, remova lentamente as tampas para evitar contaminar as reações e feche os tubos com uma película adesiva transparente para microplacas. Transfira os tubos para o termociclador de acordo com as posições indicadas no esquema da placa.Feche a tampa do ciclador térmico e clique em iniciar corrida. Certifique-se de designar um nome de arquivo para o experimento quando a corrida for concluída. Visualize os dados brutos de fluorescência e exporte-os para uma planilha, o que criará um arquivo chamado resultados de amplificação de quantificação.Para construir a curva padrão. Primeiro, baixe o script da curva padrão, depois abra o MATLAB ou um programa similar de análise de dados. Abra o script e pressione executar para rodar o script.Digite o número de arquivos de dados a serem analisados quando solicitado. Em seguida, digite o número de amostras e o número de réplicas em cada arquivo de treinamento na janela de comando.Digite a menor concentração de DNA em cópias por base logarítmica de 10 que foi usada para construir a curva padrão e pressione enter. No exemplo aqui, a menor concentração é uma cópia por base logarítmica de 10.Em seguida, digite a diferença na concentração entre cada padrão de DNA no prompt de comando e pressione enter aqui. O intervalo de concentração é de um log base 10 cópias. A seguir, insira o valor para o limite da inclinação na janela de comando e pressione enter.Esse valor é tipicamente entre três e cinco. Digite o número de desvios padrão acima do fundo para o limiar positivo, também conhecido como Z, e depois pressione enter; valores típicos de Z variam de um a cinco. Em seguida, especifique o equipamento que foi utilizado para coletar os dados neste caso.Digite um para o ciclador térmico e, em seguida, pressione enter. Se houver um controle positivo interno, selecione o valor padrão ou um novo valor para o limiar digitando S ou N, dependendo se é necessário um novo limiar. Por fim, selecione todos os arquivos de planilha que serão usados para construir a curva padrão.O script então importará e analisará automaticamente todos os dados. A PCR quantitativa em tempo real foi realizada em amostras duplicadas contendo diferentes números de cópias de DNA do HIV 1D. O início da amplificação detectável, indicado por um aumento na fluorescência, ocorre mais cedo em amostras com números mais altos de cópias de DNA do que em amostras com números mais baixos de cópias. Os dados brutos de fluorescência foram utilizados para gerar uma curva padrão a partir da amplificação de concentrações conhecidas de DNA do HIV 1D. Esses dados foram ajustados a uma curva exponencial, e o valor de R quadrado indica um alto grau de ajuste.A curva padrão foi utilizada para prever as concentrações de amostras adicionais de DNA com concentração conhecida. Ajustar o valor de Z para um permite a previsão precisa de baixas concentrações de DNA. Em contraste, altas concentrações de DNA são melhor previstas com um valor de Z igual a cinco.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a RPA não possui ciclos reais para limitar a taxa de amplificação do DNA. Portanto, a taxa de amplificação deve ser controlada com precisão. A consistência entre experimentos é crucial, então certifique-se de usar as mesmas alíquotas de iniciadores para todos os experimentos.Proteja os componentes da reação contra calor e luz. Adicione acetato de magnésio imediatamente antes do início da coleta de dados e mantenha as reações no bloco frio até o início. O experimento.

development-quantitative-recombinase-polymerase-amplification-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um barato, o método de elevada capacidade para detecção simultânea de até 43 alvos moleculares é descrito. Aplicações de mPCR / RLB incluem digitando microbiana e detecção de patógenos múltiplos a partir de amostras clínicas.

Multiplex PCR e hibridação reversa Linha Assay Blot (mPCR / RLB)

O estudo descreve um método de baixo custo para a identificação da fonte de contaminação fecal / urinária ou contaminação por nitratos na água usando qPCR para a quantificação específica de vírus de DNA humano / suínos / bovinos, adenovírus e polyomaviruses, propostos como ferramentas de MST.

Relação custo-benefício Método de Rastreamento Fonte microbiana, utilizando específicas Vírus Humano e Animal

Neste vídeo, demonstramos a técnica de PCR digital duplex (ddPCR) - uma modificação da técnica tradicional de PCR que é útil na detecção de dois marcadores genéticos diferentes simultaneamente. Uma única reação de PCR é particionada em gotículas emulsionadas do tamanho de nanolitros que são amplificadas independentemente, e a detecção de sinais de amplificação de fluorescência de cores diferentes da fração de gotículas é usada para calcular a concentração inicial das sequências alvo.

PCR digital duplex para quantificação simultânea de marcadores genéticos duplos

Aqui, descrevemos um método para quantificação simultânea de círculos de excisão de receptores de células T (TRECs) e círculos de excisão de recombinação de exclusão de K (KRECs). O ensaio TREC/KREC pode ser usado como marcador de débito tímico e de medula óssea.

Quantificação simultânea de T-célula receptora Excisão Circles (TRECs) e K-Excluindo Recombinação Excisão Circles (KRECs) por PCR em tempo real

Aqui, apresentamos um protocolo para o desenvolvimento e validação de um método de PCR quantitativo utilizado para a detecção e quantificação do DNA do EHV-2 em fluidos respiratórios equinos. O protocolo de validação EHV-2 qRT-PCR envolve um procedimento de três partes: desenvolvimento, caracterização do ensaio qRT-PCR sozinho e caracterização de todo o método analítico.

Desenvolvimento e validação de um método PCR quantitativa para equídeo herpesvírus 2 Diagnostics em fluidos respiratórios

Um sistema integrado para sequenciamento direcionado de próxima geração de amostras oncológicas é descrito. Este sistema multiplataforma é otimizado para biópsias tumorais de baixa qualidade e baixa quantidade, acomoda baixas entradas de DNA, inclui controles multivariantes bem caracterizados e apresenta um novo chamador de variante que é informado por medidas quantitativas de controle de qualidade pré-analítica.

Integração de Wet and Processes bancada secos Otimiza alvejado Seqüenciamento Next-geração de baixa qualidade e biópsias de tumores de baixa quantidade

Este manuscrito descreve o procedimento experimental e análise de software para um ensaio de site de integração bidirecional que pode simultaneamente analisar DNA de junção vetor-hospedeiro a montante e a jusante. Os produtos de PCR bidirecionais podem ser usados ​​para qualquer plataforma de seqüência a jusante. Os dados resultantes são úteis para uma comparação quantitativa de alto rendimento de alvos de DNA integrados.

Método de Implementação de Retroviral Bidirecional e Metodologia de PCR e Análise Quantitativa de Dados Workflow

Os ensaios de DNA ambiental requerem um design rigoroso, testes, otimização e validação antes que a coleta de dados de campo possa começar. Aqui, apresentamos um protocolo para levar os usuários através de cada etapa de projeto de um ensaio qPCR específico da espécie, baseado em sonda para a detecção e quantificação de dna de uma espécie-alvo a partir de amostras ambientais.

Desenvolvimento e teste de ensaios quantitativos de PCR específicos para aplicações de DNA ambiental

Instruções detalhadas são fornecidas para construir um fluorímetro modular de código aberto compatível com muitos aquecedores de baixo custo para realizar a amplificação de ácido nucleico isotérmico quantitativo em tempo real.

Fluorímetro em miniatura de código aberto para monitorar reações de amplificação de ácido nucleico isotérmico em tempo real em configurações limitadas de recursos

Os ensaios de captura de loop D (DLC) e extensão de loop D (DLE) utilizam o princípio da ligadura de proximidade juntamente com a PCR quantitativa para quantificar a formação de D-loop, a extensão de D-loop e a formação de produtos no local de uma ruptura induzível de fita dupla em Saccharomyces cerevisiae.

Detecção de Intermediários de Recombinação Homóloga via Ligadura de Proximidade e PCR Quantitativa em Saccharomyces cerevisiae

Para facilitar a detecção rápida e precisa de Acinetobacter baumannii, apresentamos um protocolo que emprega a amplificação da polimerase recombinase (RPA) em conjunto com a endonuclease LbaCas12a para identificar infecções por A. baumannii .

Detecção rápida e específica de infecções por Acinetobacter baumannii usando um sistema baseado em amplificação da polimerase recombinase/Cas12a

Aprenda a quantificar DNA usando amplificação por recombinase polimerase com controle positivo interno. Este método isotérmico oferece alternativa acessível ao PCR em tempo real para biologia molecular.

Desenvolvimento de um Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Ensaio com um controlo positivo interno

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