Desenvolvimento de um Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Ensaio com um controlo positivo interno

O objetivo geral do experimento a seguir é usar a simplificação quantitativa da polimerase recombinase para quantificar a concentração de DNA de amostras desconhecidas. Isso é obtido adicionando primeiro o controle positivo interno do DNA alvo, primers de DNA e sondas marcadas com fluorescência à reação. Como segunda etapa, as reações são colocadas na máquina de PCR em tempo real, que aquece as reações para ativar as enzimas e monitora a fluorescência das sondas para detectar a geração de amplicons alvo e controle.

Em seguida, os dados fluorescentes são analisados usando um script para gerar a curva padrão e validar o ensaio. Os resultados mostram que as amostras de DNA podem ser quantificadas com precisão dentro de uma ordem de magnitude da concentração correta com base nos experimentos de validação usados para quantificar um DNA alvo do HIV. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como PCR quantitativo em tempo real, é que o RPA é isotérmico, portanto, não é necessário um termociclador caro.

O RPA também requer uma amplificação mais baixa à temperatura, é tolerante a amostras sujas, amplifica o alvo a níveis detectáveis em minutos e utiliza enzimas lly para permitir fácil transporte e armazenamento em temperatura ambiente. Para começar a limpar todas as superfícies da bancada e do equipamento com uma solução de alvejante a 50% para criar um espaço de trabalho de pré-amplificação limpo, remova a solução de acetato de magnésio a 280 milimolares, o tampão de reidratação e os pellets de reação do freezer de 20 graus Celsius negativos e descongele as soluções em temperatura ambiente. Em seguida, monte uma mistura mestre transferindo 383,5 microlitros do tampão de reidratação para um novo tubo de microfuga a 41,6 microlitros de água livre de nuclease para o tampão e vórtice para misturar a 35 microlitros de acetato de magnésio para um tubo separado.

Retorne o acetato de magnésio nas soluções de reserva de reidratação ao freezer. Em seguida, obtenha o primer e o problema no refrigerador de quatro graus Celsius. Coloque-os no espaço de trabalho de pré-amplificação e desligue as luzes para minimizar a exposição à luz em 27,3 microlitros de cada um dos 10 primers micromolares para frente e para trás na mistura principal.

Em seguida, com 7,8 microlitros do hexadecimal de 10 micromolares rotulados com HIV 1D NA. Sonde a mistura principal e o vórtice do tubo. Em seguida, retorne o primer e as soluções de estoque da sonda para reagentes de armazenamento para o controle positivo interno pode ser adicionado aqui, conforme indicado no protocolo de texto para montar as reações QRPA. Primeiro, coloque os pellets de enzima liofilizados em tubos individuais de duas tiras de tubo de PCR de oito poços de baixo crescimento pipetas 37,5 microlitros da mistura principal em um tubo contendo um pellet.

Mexa suavemente o conteúdo do tubo com a ponta da pipeta para dissolver o pellet sem criar bolhas. Remova a ponta da reação com cuidado para evitar perda de volume e certifique-se de trocar as pontas da pipeta entre cada tubo. Transfira os tubos para um bloco frio de 96 poços resfriado por pelo menos cinco minutos para resfriar a mistura principal.

Enquanto isso, carregue o software do termociclador com o protocolo e o layout da placa é indicado no protocolo de texto. Em seguida, corte duas tiras de adesivos de micros selagem de plástico transparente para que fiquem um pouco mais largos que os tubos de PCR. E também obtenha duas tampas planas de tiras de tubos de PCR, alíquota do molde de um plasmídeo do HIV, conforme indicado no protocolo de texto.

Em seguida, adicione 10 microlitros do modelo ao tubo de PCR apropriado. Novamente, mexa suavemente a mistura com a ponta da pipeta. Em seguida, adicione 2,5 microlitros de acetato de magnésio a cada tampa do tubo e, em seguida, coloque suavemente as tampas em cima dos tubos de reação para que não fiquem totalmente selados.

O acetato de magnésio deve ser claramente visível através da tampa. Coloque as tiras de tubo de PCR em uma microcentrífuga e centrifugue os tubos por 10 segundos para coletar todo o líquido no fundo do tubo e remover quaisquer bolhas. A combinação da solução de acetato de magnésio com a mistura principal inicia a reação QRPA.

Remova rapidamente os tubos de PCR para o bloco frio para interromper a reação. Em seguida, remova lentamente as tampas para evitar contaminar as reações e sele os tubos com um filme de vedação micros transparente. Transfira os tubos para o termociclador de acordo com os locais no layout da placa.

Feche a tampa do termociclador e clique em iniciar execução. Certifique-se de designar um nome de arquivo para o experimento quando a execução for concluída. Visualize os dados brutos de fluorescência e exporte-os para uma planilha que criará um arquivo chamado resultados de amplificação de quantificação.

Para construir a curva padrão. Primeiro, baixe o script de curva padrão e, em seguida, abra o MATLAB ou um programa de análise de dados semelhante. Abra o script e pressione executar para executá-lo.

Digite o número de arquivos de dados a serem analisados quando solicitado. Em seguida, digite o número de amostras e o número de réplicas em cada arquivo de treinamento. Na janela de comando.

Digite a menor concentração de DNA em 10 cópias baseadas em log que foi usada para construir a curva padrão e pressione enter. No exemplo aqui. A concentração mais baixa é de 10 cópias baseadas em um log.

Em seguida, digite a diferença de concentração entre cada padrão de DNA no prompt de comando e pressione enter aqui. O intervalo de concentração é de um log baseado em 10 cópias. Em seguida, insira o valor do limite de inclinação na janela de comando e pressione Enter.

Esse valor normalmente está entre três e cinco. Digite o número de desvios padrão acima do plano de fundo para o limite positivo, também conhecido como Z, e pressione Enter Os valores Z típicos variam de um a cinco. Em seguida, especifique o equipamento que foi usado para coletar os dados neste caso.

Digite um para o termociclador e pressione Enter. Se houver um controle positivo interno, selecione o valor padrão ou um novo valor para o limite digitando Y ou N, dependendo se um novo limite é necessário. Por fim, selecione todos os arquivos de planilha que serão usados para criar a curva padrão.

O script importará e analisará automaticamente todos os dados. O QRPA em tempo real foi realizado em amostras duplicadas contendo diferentes números de cópias do HIV 1D NA. O início da amplificação detectável indicado por um aumento na fluorescência ocorre mais cedo para amostras com números de cópias de DNA mais altos do que para amostras com números de cópias mais baixos. Os dados brutos de fluorescência foram usados para gerar uma curva padrão a partir da amplificação de concentrações conhecidas de HIV 1D NA. Esses dados foram ajustados a uma curva exponencial, e o valor de R ao quadrado indica uma alta qualidade de ajuste.

A curva padrão foi usada para prever as concentrações de amostras adicionais de DNA de concentração conhecida. Ajustar o valor de Z para um permite a previsão precisa de baixas concentrações de DNA. Em contraste, altas concentrações de DNA são melhor previstas com um valor Z de cinco.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o RPA carece de ciclos verdadeiros para limitar a taxa de amplificação do DNA. Portanto, a taxa de amplificação deve ser controlada com precisão. A consistência entre os experimentos é crucial, portanto, certifique-se de usar as mesmas alíquotas de primer para todos os experimentos.

Proteja os componentes da reação do calor e da luz. Adicione acetato de magnésio imediatamente antes do início da coleta de dados e mantenha as reações no bloco frio até o início. O experimento.