Triagem para Endocrine Atividade em Água Utilizando disponíveis comercialmente In Vitro Transativação Bioensaios

O objetivo geral deste procedimento padronizado é rastrear amostras de água para produtos químicos endócrinos ativos, usando ensaios celulares baseados em receptores disponíveis comercialmente. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do monitoramento da qualidade da água, como: os produtos químicos endócrinos ativos estão realmente presentes na amostra? A principal vantagem dessa técnica é que ela pode analisar um grupo de compostos endócrinos ativos muito mais rápido do que os métodos químicos atuais.

Essa técnica pode ajudar a diagnosticar problemas de qualidade da água decorrentes da presença de produtos químicos desreguladores endócrinos. Este método fornece informações sobre contaminantes na água, mas também pode ser aplicado a outras matrizes ambientais, como sedimentos e tecidos. Geralmente, indivíduos novos nessa técnica podem ter dificuldades, porque requer alta precisão ao usar técnicas de pipetagem.

Para iniciar este procedimento, prepare a amostra de água em soluções de estoque de meio específico para ensaio e produto químico de referência, conforme detalhado no protocolo de texto. Armazene o meio específico do ensaio a quatro graus Celsius para armazenamento de longo prazo. Em seguida, adicione 15 microlitros do estoque químico de referência apropriado a 285 microlitros de meio de ensaio em um tubo estéril.

Misture a amostra pipetando para cima e para baixo. Em seguida, adicione 200 microlitros de 5% de DMSO em meio de ensaio a oito tubos adicionais. Transferir uma alíquota de 100 microlitros do tubo um para o tubo dois, para iniciar uma série de diluições triplas.

Misturar bem a amostra diluída no tubo dois com uma pipeta. Em seguida, transfira uma alíquota de 100 microlitros do tubo dois para o tubo três. Continue este processo para cada tubo.

Em seguida, prepare uma amostra de controle de solvente misturando 10 microlitros de DMSO em 190 microlitros de meio de ensaio. Em seguida, colete e rotule quatro novos tubos. Adicione 95 microlitros de meio de ensaio ao primeiro tubo.

Em seguida, adicione cinco microlitros de extrato aquoso e misture bem. Adicione 50 microlitros de 5% de DMSO em meio de ensaio aos outros três tubos. Em seguida, execute uma diluição dupla transferindo 50 microlitros de solução de um tubo para o outro.

Comece retirando um frasco de células presas por ER ou GR do freezer criogênico. Descongele as células rapidamente, colocando o frasco em banho-maria a 37 graus Celsius, com agitação suave por dois minutos. Em seguida, descontamine o frasco com 70% de etanol.

Coloque-o em um gabinete de segurança biológica de classe dois. Abra o frasco usando técnicas assépticas e transfira as células para 10 mililitros de meio de ensaio. Centrifugar a 200 vezes g durante cinco minutos.

Quando a centrifugação estiver completa, use uma pipeta de vidro estéril para aspirar o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em seis mililitros de meio de ensaio. Misture cinco microlitros de suspensão celular com cinco microlitros de solução de corante vital.

Em seguida, adicione uma alíquota em uma câmara de contagem. Conte o número de células vivas usando um microscópio óptico ou contador de células automatizado. Em seguida, estime a densidade de células vivas na suspensão celular.

Diluir, se necessário, para obter uma densidade final de 550.000 células vivas por mililitro de meio de ensaio. Comece criando um layout de placa que inclua uma curva de calibração específica do ensaio de nove pontos, amostras de QA/QC e várias diluições para cada extrato de água. Adicione 90 microlitros de meio de ensaio aos poços de controle livres de células replicadas.

Despeje a suspensão celular em um reservatório de pipetagem estéril. Em seguida, usando uma pipeta multicanal, adicione 90 microlitros de suspensão celular aos outros poços. Adicione 10 microlitros das amostras diluídas aos poços apropriados.

Cubra o prato com uma tampa. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de 5% de C02 a 37 graus Celsius por 16 horas. Quando a incubação estiver concluída, deixe a placa se equilibrar à temperatura ambiente.

Em seguida, as próximas etapas devem ser conduzidas na ausência de luz direta. Prepare uma solução de carregamento de seis x de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, adicione 20 microlitros da solução de carregamento a cada poço.

Adicione 10 microlitros de reagente de viabilidade celular a cada poço, para avaliar a citotoxicidade do extrato aquoso diluído. Sele a placa com filme adesivo de alumínio. Em seguida, incube a placa no escuro em temperatura ambiente por duas horas.

Quando a incubação estiver concluída, adicione a placa ao leitor de microplacas com recursos de leitura inferior. Meça a fluorescência e analise os dados conforme detalhado no protocolo de texto. Neste estudo, foram analisadas quatro amostras compostas de 24 horas de efluentes de águas residuais municipais tratadas, seis amostras de águas superficiais de sistemas de água doce no sul da Califórnia e um campo em branco composto por água ultrapura.

A atividade de ER foi detectada em sete das 10 amostras de água representativas, enquanto a atividade de GR foi detectada em quatro. As diretrizes de desempenho de QA/QC para os ensaios do receptor de estrogênio e do receptor de glicocorticóide podem ser vistas aqui. Os resultados do estudo para citotoxicidade e precisão da amostra se enquadraram bem nos critérios de aceitação, validando as medições da amostra de água.

As maiores concentrações equivalentes de bioensaio foram encontradas nos efluentes secundários, enquanto a atividade de GR do efluente terciário foi encontrada abaixo do limite de detecção do bioensaio. Da mesma forma, a maioria das amostras de água superficial não exibiu atividade de GR acima do limite de detecção e teve níveis muito mais baixos de atividade de ER do que os efluentes secundários. A maioria das amostras de efluentes de estações de tratamento de águas residuais mostrou uma resposta à dose acima do limite de detecção para bioensaios de ER e GR.

Os resultados representativos para a razão média de fluorescência azul / verde dessas amostras, plotados em relação ao fator de enriquecimento relativo, podem ser vistos aqui. Essa técnica pode ser feita em 24 horas, se realizada corretamente. Ao tentar, é importante seguir todas as diretrizes de controle de qualidade/controle de qualidade.

Essa técnica abriu caminho para os gerentes explorarem abordagens alternativas para monitorar produtos químicos desreguladores endócrinos na água. Não se esqueça de que trabalhar com azida sódica pode ser perigoso. Devem ser tomadas precauções, como trabalhar em um exaustor funcionando corretamente.