Name: Triagem para Endocrine Atividade em Água Utilizando disponíveis comercialmente In Vitro Transativação Bioensaios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprenda a rastrear produtos químicos endócrinos em amostras de água utilizando bioensaios de transativação in vitro baseados em receptores. Este método padronizado oferece uma alternativa mais rápida e eficiente para o monitoramento da qualidade da água.

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O financiamento foi fornecido pelo Conselho Estadual de Controle de Recursos Hídricos (Acordos nº 10-096-250 e 14-090-270). Agradecemos a S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi e J. Printen. Os autores declaram não haver conflito de interesses, e a referência a nomes comerciais não implica endosso.

1. Recolha e da Amostra de Água de Processo (Modificado de Escher et al. 9) <ol><li> Encha uma garrafa de vidro âmbar 1 L limpo contendo 1 g de azida de sódio e 50 mg de ácido ascórbico ao topo com amostra de água de interesse. amostra Armazenar a 4 ° C e processo dentro de 72 h. NOTA: A azida de sódio é altamente tóxico e devem ser manuseados com cuidado. Use equipamento de proteção (para os olhos / rosto, luvas, roupas) e pesar em um fume-hood que funcione correctamente. Não use uma espátula de metal para pesagem. </li><li> Fazer passar a amostra através de um filtro de fibra de vidro de 1,6 uM e, em seguida, através de um cartucho de pré-condicionados Fase de extracção sólido (SPE) com um caudal de 5-10 ml / min. Ajustar a pressão da bomba de vácuo, para controlar a taxa de fluxo. </li><li> Vácuo secar o cartucho durante 15 min. </li><li> Elui-se o cartucho com 10 ml de metanol, seguido por 10 mL de acetona: hexano (1: 1, v / v). </li><li> Concentre-se eluído até ~ 1 ml sob uma corrente suave de azoto de elevada pureza. Solventetroca por adição de 500 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) e evaporar o extracto até à 500 ul. </li><li> Transfira o extrato para um frasco de amostrador automático de vidro âmbar. Armazenar a -20 ° C. </li></ol> 2. Preparar diluições do ensaio específico Chemical Referência e Extrato de Água <ol><li> Preparar diluições 9 para a curva de calibração. <ol><li> Faça uma solução estoque do produto químico referência específica ensaio em DMSO a 100%. A concentração final deve ser de 2 uM 17β-estradiol ER para o ensaio, e 100 ^ M de dexametasona para o ensaio de GR. Armazenar as soluções de reserva a -20 ° C. </li><li> Adicionar 15 ul de estoque a química de referência apropriado para 285 ul de meio de ensaio em um tubo estéril (tubo # 1). Misturar a amostra pipetando para cima e para baixo. </li><li> Adicionar 200 ul de uma solução de 5% de DMSO em meio de ensaio em 8 tubos adicionais (tubos # 2-9). </li><li> Transferir uma alíquota de 100 ul de tubo para tubo # 1 # 2 através de banheiraE # 9 para realizar uma série de diluições de 3 vezes. Cada amostra diluída deve ser misturado com uma pipeta antes de tomar uma alíquota e adicioná-lo para o próximo tubo. </li></ol></li><li> Prepara-se uma amostra de controlo de solvente por mistura de 10 ul de DMSO em 190 ul de meio de ensaio. </li><li> Prepare quatro diluições para cada extracto de água. <ol><li> No primeiro tubo, adicionam-se 5 ul de extracto de água em 95 mL de meio de ensaio e misturar completamente. Adicionar 50 ul de 5% de DMSO em meio de ensaio em três outros tubos. </li><li> Efectuar uma diluição de 2 vezes, transferindo 50 ul de solução a partir de um tubo para o outro. </li></ol></li></ol> 3. Prepare a suspensão de células para conduzir a FRET Bioensaio <ol><li> Prepara-se o meio específico de ensaio de acordo com as instruções do fabricante. O meio de ensaio devem ser armazenados a 4 ° C e aquecida até 37 ° C num banho de água antes da utilização. </li><li> Tome um frasco de células prendeu-divisão ER ou GR fora do livre criogênicozador e descongelar as células rapidamente, colocando o frasco num banho de água a 37 ° C durante 2 min com agitação suave. Descontaminar o frasco com 70% de etanol e colocá-lo em uma cabine de segurança biológica Classe II. </li><li> Abrir o frasco utilizando técnicas assépticas e transferência das células para 10 ml de meio de ensaio. </li><li> Centrifuga-se a 200 x g durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante utilizando uma pipeta de vidro estéril e ressuspender o sedimento de células em 6 ml de meio de ensaio. </li><li> Misturar 5 ul de suspensão de células com 5 ul de uma solução de corante vital e adiciona-se uma alíquota para uma câmara de contagem. </li><li> Contar o número de células vivas utilizando um microscópio de luz ou contador de células automatizado e estimar a densidade de células vivas na suspensão de células. Dilui-se necessário para se obter uma densidade final de 550.000 células vivas por ml de meio de ensaio. </li></ol> 4. Células placa numa placa com 96 poços Black Wall Clear-fundo e adicione o extrato de água diluído <ol><li> Criar uma placalayout que inclui uma curva de 9 pontos ensaio de calibração específica, as amostras de QA / QC e múltiplas diluições para cada extracto de água. Um exemplo de uma disposição da placa de 96 poços é mostrado na Figura 1. </li><li> Adicionar 90 ul de meio de ensaio para os poços de controlo isentos de células em duplicado. </li><li> Verter a suspensão de células em um reservatório de pipetagem estéril e adicionar 90 ul de suspensão de células para os outros poços utilizando uma pipeta multicanal. </li><li> Adicionam-se 10 ul das amostras diluídas preparada durante o passo 2 aos poços apropriados. A concentração final de DMSO por poço deverá ser de 0,5%, no máximo. </li><li> Cobrir a placa com uma tampa e coloca-se numa incubadora de CO2 a 5% a 37 ° C durante 16 horas. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54725/54725fig1.jpg" /> Figura 1:. Exemplo de uma disposição da placa de 96 poços A placa de multi-poços é concebido para incluir uma curva de calibração específica ensaio, 3 tiposde controles de QA / QC (mídia só, células em meio limpo e células em DMSO cravado média) e 4 diluições por extrato de água. Cada controle e diluição do extrato de água é analisada em poços em triplicado. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54725/54725fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 5. Prepare o Loading Solution e adicione a cada poço <ol><li> Após a incubação, permitem que a placa equilibrar à temperatura ambiente. Para este ensaio biológico FRET, os passos 5.2 através de 5.6 deve ser realizada na ausência de luz direta. </li><li> Prepara-se uma solução de 6x carregamento de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Adicionar 20 ul da solução de carregamento 6x a cada poço. </li><li> Adicionar 10 ul de reagente de viabilidade celular para cada poço, para avaliar a citotoxicidade do extracto aquoso diluído. </li><li> Selar a placa com película adesiva de alumínio. </li><li> Incubar a placa no escuro à temperatura ambiente durante 2 h. </li></ol> 6. A citotoxicidade Medir e Endocrine Atividade Response <ol><li> Configurar o leitor de microplacas com capacidade de leitura de baixo para seguir as instruções do fabricante. </li><li> Para a transativação bioensaio FRET, medir a fluorescência no azul (409/460 nm, excitação (Ex) / emissão (Em) comprimento de onda) e verde (409 Ex / 530 nm) o Em canais. </li><li> Para o ensaio de citotoxicidade, medir a fluorescência a 560 Ex / 590 Em nm. </li></ol> 7. Avaliar QA / QC verificações para determinar a qualidade dos dados <ol><li> Compare a fluorescência em bruto médio da livre de células (media only) controles e as células-only (células em meio de ensaio limpo). O fundo de fluorescência só de meios de comunicação deve ser de pelo menos 25% menor do que a resposta de células de controlo apenas. </li><li> Processar os dados FRET-primas. Para ambos os &quot;azuis&quot; e conjuntos de dados &quot;verdes&quot;, subtrair a fluorescência média dos poços de controlo sem células de toda célula que contém também. Calcula-se arácio azul / verde para cada poço experimental. </li><li> Compare rácio azul / verde de células-only e células com controles DMSO. valores de fluorescência destes controlos deve estar dentro de 15% desvio padrão relativo (RSD). </li><li> Traçar a curva de calibração específica ensaio como azul rácio / verde contra a concentração da amostra expresso como uma massa molecular (log M). Calcular a inclinação, R 2 e EC 50 (50% Concentração de efeito) log. Os parâmetros de calibração deve estar dentro do intervalo esperado listados na Tabela 1. </li><li> Calcular o RSD para todos os poços em triplicado. A variabilidade entre as repetições deve ser inferior a 20%. </li><li> Para os dados de citotoxicidade (560 Ex / Em 590 nm), subtrair a média de controlo isenta de células (isto é, meios de fundo) a partir de todas as cavidades contendo células. </li><li> Calcula-se a fluorescência média subtraído-fundo para cada amostra. Plotar os dados de fluorescência resultantes como uma percentagem do controlo DMSO. diluições de amostras não deveexibem mortalidade celular mais do que 20% em comparação com os controlos de células únicas e DMSO. </li></ol> 8. Análise de Dados <ol><li> Calcular o limite de detecção do ensaio (LOD) como o mínimo de resposta de calibração mais dois desvios padrão da média do que a resposta. </li><li> Para amostras que apresentam uma resposta à dose, derivar o EC50 &#160; o extracto de água utilizando a inclinação de uma regressão linear da curva de calibração entre 10 e 50% concentrações efeito dos químicos de referência. </li><li> Calcular a concentração bioanalíticos Equivalent (BEQ) utilizando a fórmula: BEQ = EC 50 de química de referência / CE de 50 de amostra de água. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A potência bem documentado de estrogênios ambientais, tais como 17β-estradiol (E2), triagem mandados para esses produtos químicos em / L concentrações ng 23,24. Neste estudo, a resposta ER para os efluentes de águas residuais (gama BEQ: 2,3-17 ng E2 / G) era um pouco mais elevada do que a relatada para o efluente secundário de ETAR Australiana 20, ao passo que os BEQ para as águas superficiais (&lt;0,5 a 4 ng E2 / G ) estavam dentro da faixa relatada para a superfície e águas pluviais em outros lug...

monitoramento da qualidade da água corrente baseia-se na capacidade de medir com precisão e precisamente a ocorrência de contaminantes químicos como um proxy para a exposição a animais selvagens e seres humanos. No entanto, esta monitorização química-by-químicas e paradigma de avaliação não pode manter o ritmo com o universo química em constante mudança que enfrentamos. À medida que aprendemos mais sobre o destino e os efeitos dos produtos químicos sintéticos e naturais, continuamos a procurar instrumentos de medição que tratem esperados impactos biológicos, e que ao mesmo tempo são imunes às mudanças na produção de químicos, uso e entrada ambiental. Tais ferramentas são especialmente relevantes para a compreensão se os produtos químicos desconhecidos ou novos, e produtos de transformação, merecem a nossa atenção. Além disso, misturas complexas de produtos químicos presentes na água são pouco abordado pela monitorização química individual. Assim, enfrentamos o desafio de modernizar a caixa de ferramentas de monitoramento existente para melhor enfrentar estas questões nas águas de superfície that receber a descarga de efluentes de esgoto tratado e do escoamento / águas pluviais urbanas. Nos últimos anos, as técnicas bioanalíticos mostraram-se promissores como ferramentas de triagem para avaliação da qualidade da água. Em particular, os bioensaios, in&#39;vitro que respondem a produtos químicos que actuam via conhecida, modos de acção específicos 1,2 são de grande interesse para a comunidade de monitoramento ambiental 3. Numerosas investigações têm empregado em bioensaios in vitro para quantificar a atividade endócrina de beber, de superfície e águas residuais 4 -6. Além disso, uma série de bioensaios alvo eventos iniciadores moleculares (por exemplo, a activação do receptor), que pode, potencialmente, ser associados a efeitos deletérios através de via adverso resultado analisa 7,8. A evolução da bioscreening para a avaliação da qualidade da água foi relativamente rápida, com centenas de diferente em endpoints bioensaios in vitro tendo sido avaliados quanto à sua9,10 utilidade. Atualmente, apenas um punhado de bioensaios foram mostrados para alcançar uma boa precisão da medição (em laboratórios), demonstrando a capacidade de diferenciar entre qualidades de água 5,6. Para efluentes de esgoto tratado em particular, a ocorrência de estrogénios e esteróides glicocorticóides tem sido com sucesso contabilizado usando em ensaios de transactivação in vitro 11,12. bioensaios No entanto, a maioria dos estudos até à data têm empregados cujas linhas celulares são proprietários (e, portanto, não estão amplamente disponíveis), requerem cuidados continuados e manipulação, ou ambos. Como resultado, a capacidade de padronizar protocolos, realizar exercícios de calibração inter-laboratoriais, e, finalmente, para transferir essa tecnologia de triagem para os recursos hídricos da Comunidade permanece prejudicada. Pelo menos um fornecedor de bioensaios in vitro controlados através do programa US ToxCast está disponível comercialmente 13 em fácil de usar &quot;de congelação e descongelação4; formatos. Estes &quot;kits&quot; de células-preso divisão foram mostrados para ser robusto para medir a actividade de produtos químicos extraído da água que representam diferentes níveis de tratamento 14. Embora os protocolos do fornecedor estão disponíveis para pesquisar a bioactividade de produtos químicos individuais ou misturas, alguns deles necessitam de modificação antes de poderem ser aplicados a amostras de água. Efluente tratado de águas residuais 15, escoamento de águas pluviais 16, águas receptoras 17,18 e, mais recentemente reciclado 19,20 água são exemplos de meios aquosos que são de interesse para a comunidade de qualidade da água. Este estudo apresenta um protocolo único, padronizado para medir a atividade endócrina em amostras de água usando comercialmente disponíveis, por divisão de presos em bioensaios de transactivação in vitro. Nós demonstramos robustez do protocolo através de uma avaliação abrangente de fundo, a dose de responsividade e repetibilidade da resposta para twO endpoints de particular estrogênio juros e glicocorticóides Receptor transativação (ER e GR, respectivamente). O protocolo foi aplicado em amostras de tela de efluentes de esgoto tratado e das águas superficiais de sistemas de água doce na Califórnia.

<table><tbody><tr><td>Kit de ensaio GeneBLAzer ER alpha DA</td><td>O kit ThermoFisher</td><td>K1393</td><td>inclui células presas por divisão ER (DA) e kit de carregamento LiveBLAzer FRET.</td></tr><tr><td>Kit de ensaio GeneBLAzer GR DA O kit</td><td>ThermoFisher</td><td>K1391</td><td>inclui células presas por divisão GR (DA) e kit de carregamento LiveBLAzer FRET.</td></tr><tr><td>Reagente de viabilidade celular PrestoBlue&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4% em PBS</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T8154</td><td>Também disponível na ThermoFisher</td></tr><tr><td>Corning 96-well black wall, clear-bottom plate</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Embalado individualmente, estéril com tampa</td></tr><tr><td>Filtros de fibra de vidro Whatman, GF/A, 1.6 &micro; M</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>WHA1820025</tr><tr><td>Filme de vedação de alumínio Microplate</td><td>E & K Scientific</td><td>T592100</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB cartucho de 6 cc, sorvente de 200 mg</td><td>Waters</td><td>WAT106202</td><td></td></tr><tr><td>17&beta; Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>E2758</td><td>CAS #50-28-2</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A61-100</td><td>Também disponível na Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Dexametasona&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D4902</td><td>CAS #50-02-2</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D8418</td><td>Solventes de grau molecular</td></tr><tr><td>(acetona, hexano, metanol)</td> <td>Fisher Scientific</td><td></td><td>HPLC grau</td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td>O produto químico <td>S2002</td><td>é altamente tóxico e deve ser manuseado com cautela. Use roupas de proteção e pese sob um exaustor. Também disponível na EMD Millipore.</td></tr><tr><td>Contador de células automatizado ou hemocitômetro</td><td>Vários*</td><td></td><td>Os fornecedores incluem Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich e ThermoFisher.</td></tr><tr><td>Gabinete de segurança biológica Classe II</td><td>Vários*</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubadora</td><td>Vários*</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Congelador criogênico&nbsp;</td><td>Vários*</td><td></td><td>Recomenda-se o armazenamento de nitrogênio líquido.&nbsp;</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas de fluorescência</td><td>vários*</td><td></td><td>&nbsp; O leitor deve ter recursos de leitura inferior.</td></tr><tr><td>* Nenhuma fonte recomendada, a escolha deste equipamento depende do orçamento, frequência de uso e espaço do laboratório.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

triagem para endocrine atividade em Água utilizando disponíveis comercialmente<em&gt; in vitro</em&gt; transativação bioensaios

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Em bioensaios de transactivação in vitro mostraram promissores como ferramentas de monitoramento de qualidade da água, no entanto a sua adopção e aplicação generalizada tem sido dificultada em parte devido à falta de métodos padronizados e disponibilidade de tecnologia robusta, fácil de usar. Neste estudo, as linhas celulares, prendeu-divisão comercialmente disponíveis foram utilizados para rastrear quantitativamente para a actividade endócrina de produtos químicos presentes em amostras de água de interesse para os profissionais de qualidade ambiental. Um protocolo único, padronizado, que incluiu garantia de qualidade / controlo de qualidade (QC / QA) controlos foi desenvolvido para actividade de estrogénio e Receptor de Glucocorticóides (ER e GR, respectivamente), utilizando um ensaio baseado em células de Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência (TERF). Amostras de efluente tratado municipal de águas residuais e das águas superficiais de sistemas de água doce na Califórnia (EUA), foram extraídos utilizando extração em fase sólida e analisados ​​para a atividade endócrina usando o proto padronizadocol. Antecedentes e dose-resposta para as substâncias químicas de referência específicos do endpoint conheceu diretrizes QA / QC consideradas necessárias para a medição confiável. A resposta de rastreio de bioensaio para as amostras de água de superfície não foi detectável em grande parte. Em contraste, amostras de efluentes de estações de tratamento secundário teve a maior actividade mensurável, com concentrações equivalentes bioensaios estimado (BEQ) até 392 ng dexametasona / L para o GR e 17 ng 17β-estradiol / L para ER. O bioensaio de resposta para uma amostra de efluente terciário foi menor do que o medido para os efluentes secundários, indicando uma residual menor de produtos químicos activos endócrinos após o tratamento avançado. Este protocolo mostrou que em bioensaios de transactivação in vitro que utilizam comercialmente disponíveis, células preso por divisão &quot;kits&quot;, pode ser adaptado para o rastreio de actividade endócrina em água.

No presente estudo, foram selecionadas amostras de 4x 24 hr compostas de efluentes de águas residuais municipais tratadas, 6 amostras de caçamba de águas de superfície de sistemas de água doce no sul da Califórnia e um campo em branco que consiste em água ultrapura para ilustrar este protocolo. 3 das amostras 4 de efluentes eram de plantas convencionais de tratamento de lamas activadas de águas residuais ( &quot;efluente secundário&quot;), e o quarto a partir de uma estação de tratamento...

Um protocolo para rastrear a atividade endócrina em extratos orgânicos de amostras de água, incluindo efluentes de águas residuais tratadas e águas superficiais (receptoras), foi adaptado usando bioensaios de transativação in vitro com prisão por divisão ("congelamento e descongelamento") disponíveis comercialmente.

Triagem para Endocrine Atividade em Água Utilizando disponíveis comercialmente<em&gt; In Vitro</em&gt; Transativação Bioensaios

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

O objetivo geral deste procedimento padronizado é triar amostras de água em busca de substâncias com atividade endócrina, utilizando ensaios celulares baseados em receptores comercialmente disponíveis. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de monitoramento da qualidade da água, como, por exemplo: substâncias com atividade endócrina estão realmente presentes na amostra? A principal vantagem desta técnica é que ela pode analisar um grupo de compostos com atividade endócrina muito mais rapidamente do que os métodos químicos atuais.Essa técnica pode ajudar a diagnosticar problemas de qualidade da água decorrentes da presença de produtos químicos que interferem no sistema endócrino. Este método fornece informações sobre contaminantes na água, mas também pode ser aplicado a outras matrizes ambientais, como sedimentos e tecidos. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica podem ter dificuldades, porque ela exige alta precisão no uso de técnicas de pipetagem.Para iniciar este procedimento, prepare a amostra de água em soluções estoque de meio específico para o ensaio e produto químico de referência, conforme detalhado no protocolo textual. Armazene o meio específico para o ensaio a quatro graus Celsius para armazenamento de longo prazo. Em seguida, adicione 15 microlitros da solução estoque do produto químico de referência apropriado a 285 microlitros de meio de ensaio em um tubo estéril.Agite a amostra pipetando para cima e para baixo. Em seguida, adicione 200 microlitros de DMSO 5% no meio do ensaio a oito tubos adicionais. Transfira uma alíquota de 100 microlitros do tubo um para o tubo dois, para iniciar uma série de diluição tripla.Misture bem a amostra diluída no tubo dois com uma pipeta. Em seguida, transfira uma alíquota de 100 microlitros do tubo dois para o tubo três. Continue este processo para cada tubo.Em seguida, prepare uma amostra controle de solvente misturando 10 microlitros de DMSO em 190 microlitros de meio de ensaio. Depois, colete e rotule quatro novos tubos. Adicione 95 microlitros de meio de ensaio ao primeiro tubo.Em seguida, adicione cinco microlitros de extrato aquoso e misture bem. Adicione 50 microlitros de DMSO 5% no meio de ensaio aos outros três tubos. Em seguida, realize uma diluição em duas vezes transferindo 50 microlitros de solução de um tubo para o próximo.Inicie retirando um frasco de células paradas na divisão ER ou GR do freezer criogênico. Descongele rapidamente as células colocando o frasco em um banho-maria a 37 graus Celsius, com agitação suave por dois minutos. Em seguida, descontamine o frasco com etanol 70%.Coloque-o em uma cabine de segurança biológica classe dois. Abra o frasco utilizando técnicas assépticas e transfira as células para 10 mililitros de meio de ensaio. Centrifugue a 200 × g durante cinco minutos.Quando a centrifugação estiver concluída, use uma pipeta de vidro estéril para aspirar o sobrenadante. Em seguida, re-suspenda o pellet celular em seis mililitros de meio de ensaio. Misture cinco microlitros de suspensão celular com cinco microlitros de solução de corante vital.Em seguida, adicione uma alíquota em uma câmara de contagem. Conte o número de células viáveis utilizando um microscópio óptico ou um contador automático de células. Em seguida, estime a densidade de células viáveis na suspensão celular.Dilua, se necessário, para obter uma densidade final de 550.000 células vivas por mililitro do meio do ensaio. Comece criando um esquema de placa que inclua uma curva de calibração específica do ensaio com nove pontos, amostras de QA/QC e múltiplas diluições para cada extrato aquoso. Adicione 90 microlitros de meio do ensaio aos poços controle sem células em replicata.Despeje a suspensão celular em um reservatório estéril para pipetagem. Em seguida, utilizando uma pipeta multicanal, adicione 90 microlitros da suspensão celular aos demais poços. Adicione 10 microlitros das amostras diluídas aos poços apropriados.Cubra a placa com uma tampa. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora com 5% de CO₂ a 37 graus Celsius por 16 horas. Após a conclusão da incubação, deixe a placa equilibrar à temperatura ambiente.Em seguida, os próximos passos devem ser realizados na ausência de luz direta. Prepare uma solução de carregamento 6 x de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, adicione 20 microlitros da solução de carregamento a cada poço.Adicione 10 microlitros do reagente de viabilidade celular a cada poço, para avaliar a citotoxicidade do extrato aquoso diluído. Sobreponha a placa com filme adesivo de alumínio. Em seguida, incube a placa no escuro, à temperatura ambiente, por duas horas.Após a conclusão da incubação, adicione a placa ao leitor de microplacas com capacidade de leitura na parte inferior. Meça a fluorescência e analise os dados conforme detalhado no protocolo descrito no texto. Neste estudo, foram analisadas quatro amostras compostas de 24 horas de efluente de esgoto municipal tratado, seis amostras pontuais de água superficial de sistemas de água doce no sul da Califórnia e um branco de campo composto por água ultrapura.A atividade de ER foi detectada em sete das 10 amostras representativas de água, enquanto a atividade de GR foi detectada em quatro. As diretrizes de desempenho de QA/QC para os ensaios de receptor de estrogênio e receptor de glicocorticoide podem ser vistas aqui. Os resultados do estudo para citotoxicidade e precisão das amostras estiveram bem dentro dos critérios de aceitação, validando as medições das amostras de água.As concentrações equivalentes mais altas em bioensaio foram encontradas nos efluentes secundários, enquanto a atividade da GR no efluente terciário esteve abaixo do limite de detecção do bioensaio. Da mesma forma, a maioria das amostras de água superficial não exibiu atividade da GR acima do limite de detecção e apresentou níveis muito mais baixos de atividade da ER do que os efluentes secundários. A maioria das amostras de efluentes de estações de tratamento de águas residuais mostrou resposta dose-dependente acima do limite de detecção para os bioensaios da ER e da GR.Os resultados representativos para a razão média de fluorescência azul/verde dessas amostras, plotados em função do fator de enriquecimento relativo, podem ser vistos aqui. Esta técnica pode ser realizada em 24 horas, se executada corretamente. Ao tentar realizá-la, é importante seguir todas as diretrizes de QA/QC.Essa técnica abriu caminho para que gestores explorassem abordagens alternativas para monitorar produtos químicos que interferem no sistema endócrino na água. Não se esqueça de que trabalhar com azida de sódio pode ser perigoso. Precauções devem ser tomadas, como trabalhar em uma capela de exaustão adequadamente funcionante.

screening-for-endocrine-activity-water-using-commercially-available

Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Neste artigo, embriões de peixe-zebra são usados para triagem de toxicidade química. A toxicidade química está correlacionada com as leituras de fenótipo. O protocolo de amostra mostra uma abordagem metodológica para a realização da triagem de toxicidade química.

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Ensaio de atividade do receptor-repórter de estrogênio para rastrear a atividade estrogênica do fitoestrogênio

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