De alta resolução Mapping Optical do mouse nó sino-atrial

O objetivo geral deste protocolo experimental é realizar o mapeamento óptico do nó sinoatrial de camundongo a partir de um coração perfundido por Langendorff intacto ou de uma preparação atrial isolada. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo eletrofisiopatológico e fisiopatológico do nó sinoatrial sobre os mecanismos de anormalidades do marcapasso, síndrome do nódulo sinusal e várias arritmias atriais associadas a doenças. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a investigação de múltiplos parâmetros nos tecidos intactos com resolução espacial e atemporal muito alta.

Depois de confirmar o nível apropriado de anestesia por pinça do dedo do pé, use uma tesoura Mayo curva de 5,5 polegadas e uma pinça hemostática Kelly de 5,5 polegadas para fazer uma incisão de um centímetro na frente do tórax. Usando uma pinça de íris curva de quatro polegadas, segure rapidamente o tecido pulmonar e use uma tesoura de íris de quatro terços de polegada para cortar o pulmão, o timo e o coração juntos, junto com o pericárdio. Lave os tecidos em solução oxigenada de Tyrode modificada a 37 graus Celsius.

Em seguida, use uma tesoura Vannas Tubingen curva de três polegadas e uma pinça número cinco de quatro terços de polegada para remover o pulmão, o timo e o tecido adiposo do coração. Em seguida, use uma cânula de calibre 21 feita sob medida e duas pinças curvas de 4,3 polegadas número cinco B para caninar a aorta e, simultaneamente, perfundir e superfundir o coração com solução de Tyrode de 37 graus Celsius direcionando a solução através de um filtro de náilon de 11 mícrons em linha antes da perfusão para evitar o entupimento da circulação coronária. Em seguida, conecte um transdutor de pressão a uma trava Luer na linha de perfusão por meio de uma torneira de três vias para monitorar a pressão aórtica, ajustando a velocidade de perfusão para manter a pressão aórtica entre 60 a 80 milímetros de mercúrio, conforme necessário.

Para o mapeamento óptico do nó sinoatrial de um coração perfundido por Langendorff, posicione o órgão na orientação horizontal com o lado posterior voltado para cima em uma câmara de banho de órgão de tecido de vidro e use pinos de 0,1 milímetro de diâmetro para fixar o ápice ventricular ao fundo revestido de silicone da câmara para evitar movimento induzido por fluxo durante o experimento. Insira um pequeno tubo de silicone no ventrículo esquerdo através da veia pulmonar, dos átrios esquerdos e da válvula mitral e use uma sutura de seda 40 para fixar o tubo ao tecido conjuntivo circundante. Em seguida, use outra sutura de seda 40 para amarrar as veias cavas superior e inferior e prenda a borda do apêndice atrial direito no fundo da câmara.

Estique e prenda a outra extremidade da sutura no fundo da câmara e coloque um eletrodo de estimulação personalizado na borda do apêndice atrial direito. Em seguida, coloque dois eletrodos monopolares de agulha de 12 milímetros de eletrocardiograma perto da base dos ventrículos direito e esquerdo e coloque o eletrodo de eletrocardiograma terra próximo ao ápice do ventrículo. Para corar o tecido, injete o corante diluído em uma porta de perfusão em linha da linha de perfusão coronária para administração em um período de cinco a sete minutos.

Após 20 minutos de estabilização, adicione 0,5 mililitros de blebbitatina a 37 graus Celsius no perfusato seguido pela injeção de 0,1 mililitros de blebistatina diluída em 1 mililitro de solução de tirado a 37 graus Celsius na linha de perfusão coronária por mais cinco a sete minutos usando uma porta de injeção Luer lock em linha. A blebbitatina deve ser usada com cautela. Para evitar a precipitação do inibidor, primeiro dissolva a blebbitatina em meio que tenha sido aquecido a 37 graus e agite vigorosamente a mistura.

Para mapear opticamente a amostra, primeiro fixe um pequeno vidro coberto na superfície da solução sobre o tecido para reduzir quaisquer artefatos de movimento da solução vibratória. Em seguida, usando um guia de luz bifurcado flexível com uma luz de excitação fornecida por uma lâmpada halógena de corrente constante e baixo ruído, direcione o feixe de luz filtrado para o tecido e obtenha uma imagem do sinal fluorescente resultante. Depois de canular o coração como acabamos de demonstrar, disseque os ventrículos para longe do lado anterior e abra o átrio direito através da válvula tricúspide ao longo do eixo da veia cava superior da válvula tricúspide, seguido de uma incisão através do ramo medial da crista terminal.

Para abrir a parede livre do átrio anterior, faça uma incisão da linha média da incisão do membro medial até a borda do canto inferior direito do apêndice atrial direito e fixe a parede livre do átrio achatado na parte inferior de uma câmara revestida de silicone. Para abrir o apêndice atrial esquerdo, corte a válvula mitral ao longo do canto superior da válvula mitral do apêndice atrial esquerdo. Em seguida, fixe o átrio esquerdo aberto como foi feito anteriormente para o átrio direito.

Em seguida, remova parcialmente o tecido ventricular. Preserve uma borda de tecido ventricular para fixar a preparação para evitar danos aos átrios e prenda o tecido no fundo de uma câmara revestida de Sylgard. Agora levante a preparação final em cerca de 0,5 milímetros do fundo da câmara revestida de silicone para permitir a superfusão das superfícies epicárdica e endocárdica e superfunda a amostra com solução de tirado a 37 graus Celsius.

Em seguida, coloque um eletrodo de cloreto de prata de estimulação personalizado na borda do apêndice atrial direito dissecado. Coloque um eletrodo monopolar de agulha de 12 milímetros de eletrocardiograma próximo a cada um dos apêndices atriais direito e esquerdo e coloque o eletrodo de eletrocardiograma terra próximo à junção ventricular atrial. Para corar o tecido cardíaco, use uma pipeta de 1 milímetro para liberar lentamente o corante sensível à voltagem diluído em solução de Tyrode a 37 graus Celsius diretamente no tecido.

Em seguida, imobilize a amostra com a aplicação direta de blebistatina diluída no tecido, seguida pela administração de mais 0,5 mililitros de blebistatina através do perfusato e mapeie opticamente a amostra como acabamos de demonstrar. As etapas de coloração tecidual e inibição da blebistatina são críticas, exigindo implementação precisa e um procedimento de coloração preciso para que os parâmetros fisiológicos do atri, incluindo a frequência cardíaca, a alocação do marcapasso principal e a condução atrial, não sejam afetados. Aqui, um mapa típico do contorno de ativação do átrio direito reconstruído para ritmo sinusal espontâneo para um coração de camundongo perfundido por Langendorff com dois mapas de contorno do átrio direito correspondentes adquiridos em taxas de amostragem de 1 e 0,5 milissegundos são mostrados.

O ponto de ativação precoce está localizado na região intercava perto da veia cava superior, onde o nó sinoatrial é anatomicamente definido. Neste experimento, após estimulação do apêndice atrial direito por pelo menos um minuto a 10 a 12 Hertz, a estimulação elétrica foi interrompida e o tempo de recuperação do nó sinoatrial foi calculado como o intervalo de tempo entre o último potencial de ação capturado e o primeiro potencial de ação espontâneo. A ativação do preparo atrial isolado durante o ritmo sinusal espontâneo permite identificar a área precisa da localização do marcapasso principal.

Se os procedimentos de cirurgia e carregamento de corante forem seguidos adequadamente, nenhuma alteração significativa nas características fisiológicas do átrio deve ser observada. Embora a coloração arterial possa exigir uma quantidade maior de corante, o sinal fluorescente no tecido da área do nó sinoatrial parece ser mais estável por este método de carga, com um tempo de decaimento da intensidade do sinal após a coloração coronária quase duas vezes maior do que após a coloração da superfície. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 30, 40 minutos se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, tome cuidado para localizar a anatomia atrial antes de fazer um corte para evitar danos ao tecido atrial e ao nó sinusal. Após este procedimento, outras medidas, como registros convencionais de eletrodos mitrais de vidro, podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais sobre as características do potencial transmembrana comutativo. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da fisiologia do intelecto explorarem arritmias atriais, incluindo disfunção do nó sinoatrial no coração.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar o mapeamento óptico de alta resolução de uma preparação de nó sinusal de camundongo.