De alta resolução Mapping Optical do mouse nó sino-atrial

O objetivo geral deste protocolo experimental é realizar o mapeamento óptico do nó sinoatrial de camundongo em um coração intacto perfundido por Langendorff ou em uma preparação atrial isolada. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de eletrofisiologia e fisiopatologia do nó sinoatrial sobre os mecanismos de anormalidades marcapasso, síndrome do seio doente e várias doenças associadas a arritmias atriais. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a investigação de múltiplos parâmetros em tecidos intactos com resolução espacial muito alta e resolução temporal.

Após confirmar o nível apropriado de anestesia por meio da compressão dos dedos dos pés, utilize tesoura curva Mayo de 5,5 polegadas e pinça hemostática Kelly de 5,5 polegadas para fazer uma incisão de um centímetro na parte frontal do tórax. Usando pinça de Iris curva de quatro polegadas, segure rapidamente o tecido pulmonar e utilize tesoura de Iris de quatro terços de polegada para remover juntos o pulmão, o timo e o coração, junto com o pericárdio. Lave os tecidos em solução de Tyrode modificada oxigenada a 37 graus Celsius.

Em seguida, utilize tesoura curva Vannas Tubingen de três polegadas e pinça número cinco de quatro terços de polegada para remover os pulmões, o timo e o tecido adiposo do coração. A seguir, use uma cânula personalizada de 21 gauge e duas pinças curvas B número cinco de 4,3 polegadas para canular a aorta e simultaneamente perfundir e superfundir o coração com solução de Tyrode a 37 graus Celsius, direcionando a solução através de um filtro de náilon de 11 mícrons em linha antes da perfusão, a fim de evitar o entupimento da circulação coronariana. Em seguida, conecte um transdutor de pressão a um conector Luer lock na linha de perfusão por meio de uma torneira de três vias para monitorar a pressão aórtica, ajustando a velocidade de perfusão conforme necessário para manter a pressão aórtica entre 60 e 80 milímetros de mercúrio.

Para a mapeamento óptico do nó sinoatrial em um coração perfundido pelo método de Langendorff, posicione o órgão em orientação horizontal com a face posterior voltada para cima em uma câmara de banho de tecido de vidro e utilize pinos de diâmetro de 0,1 milímetro para fixar o ápice ventricular ao fundo revestido com silicone da câmara, evitando assim movimentos induzidos pelo fluxo durante o experimento. Insira um pequeno tubo de silicone no ventrículo esquerdo por meio da veia pulmonar, átrio esquerdo e válvula mitral e utilize um fio de seda 40 para fixar o tubo ao tecido conjuntivo circundante. Em seguida, utilize outro fio de seda 40 para amarrar as veias cavas superior e inferior e fixe a borda da orelha do átrio direito ao fundo da câmara.

Estique e fixe a outra extremidade da sutura na base da câmara e posicione um eletrodo de estimulação personalizado na borda da orelha atrial direita. Em seguida, posicione dois eletrodos agulha monopolar de eletrocardiograma de 12 milímetros próximos à base dos ventrículos direito e esquerdo e coloque o eletrodo de terra do eletrocardiograma próximo ao ápice do ventrículo. Para corar o tecido, injete o corante diluído em um orifício de perfusão em linha na tubulação de perfusão coronariana para entrega ao longo de um período de cinco a sete minutos.

Após 20 minutos de estabilização, adicione 0,5 mililitros de blebbistatina a 37 graus Celsius ao perfusato, seguido pela injeção de 0,1 mililitro de blebbistatina diluída em 1 mililitro de solução de Tyrode a 37 graus Celsius na linha de perfusão coronariana ao longo de mais cinco a sete minutos, utilizando um porto de injeção Luer lock em linha. A blebbistatina deve ser usada com cautela. Para evitar a precipitação do inibidor, dissolva primeiramente a blebbistatina em meio aquecido até ficar completamente claro a 37 graus e agite vigorosamente a mistura.

Para mapear opticamente a amostra, fixe primeiro um pequeno vidro de cobertura sobre a superfície da solução acima do tecido, a fim de reduzir quaisquer artefatos de movimento provocados pela vibração da solução. Em seguida, utilizando uma guia de luz bifurcada flexível com luz de excitação fornecida por uma lâmpada de halogênio de corrente constante e baixo ruído, direcione o feixe de luz filtrado sobre o tecido e capture a sinal fluorescente resultante. Após canular o coração conforme acabou de ser demonstrado, dissecar os ventrículos do lado anterior e abrir o átrio direito através da válvula tricúspide ao longo do eixo da válvula tricúspide-veia cava superior, seguido por uma incisão através do ramo medial da crista terminal.

Para abrir a parede livre anterior do átrio, faça uma incisão a partir da linha média do corte do ramo medial até a borda do canto inferior direito da orelha do átrio direito e fixe a parede livre atrial achatada na base de uma câmara revestida com silicone. Para abrir a orelha do átrio esquerdo, corte através da válvula mitral ao longo do canto superior da válvula mitral da orelha do átrio esquerdo. Em seguida, fixe o átrio esquerdo aberto da mesma forma que foi feito anteriormente para o átrio direito.

Em seguida, remova parcialmente o tecido ventricular. Preserve uma borda de tecido ventricular para fixar a preparação, evitando danos aos átrios, e fixe o tecido no fundo de uma câmara revestida com Sylgard. Agora, levante a preparação final cerca de 0,5 milímetros do fundo da câmara revestida com silicone para permitir a superfusão tanto das superfícies epicárdica quanto endocárdica e realize a superfusão da amostra com solução de Tyrode a 37 graus Celsius.

Em seguida, posicione um eletrodo personalizado de prata cloreto na borda do apêndice atrial direito dissecado. Coloque um eletrodo agulha monopolar de 12 milímetros para eletrocardiograma próximo a cada um dos apêndices atriais direito e esquerdo, e posicione o eletrodo de terra do eletrocardiograma próximo à junção átrio-ventricular. Para corar o tecido cardíaco, utilize uma pipeta de 1 milímetro para liberar lentamente o corante sensível à voltagem diluído em solução de Tyrode a 37 graus Celsius diretamente sobre o tecido.

Em seguida, imobilize a amostra com a aplicação direta de blebbistatina diluída sobre o tecido, seguida pela administração de mais 0,5 mililitros de blebbistatina por meio do perfusato e realize a mapeamento óptico da amostra conforme acabou de ser demonstrado. As etapas de coloração do tecido e inibição pela blebbistatina são críticas, exigindo implementação precisa e um procedimento de coloração exato para que os parâmetros fisiológicos atriais, incluindo a frequência cardíaca, a localização do marcapasso dominante e a condução atrial, não sejam afetados. Aqui é apresentado um mapa típico de contorno de ativação do átrio direito reconstruído para ritmo sinusal espontâneo de um coração de camundongo perfundido pelo método de Langendorff, juntamente com dois mapas de contorno correspondentes do átrio direito adquiridos com taxas de amostragem de 1 e 0,5 milissegundo.

O ponto de ativação inicial localiza-se na região intercaval próxima à veia cava superior, onde o nó sinoatrial é anatomicamente definido. Neste experimento, após a estimulação elétrica da orelha atrial direita por pelo menos um minuto a 10 a 12 hertz, a estimulação elétrica foi interrompida e o tempo de recuperação do nó sinoatrial foi calculado como o intervalo de tempo entre o último potencial de ação captado e o primeiro potencial de ação espontâneo. A ativação da preparação atrial isolada durante o ritmo sinusal espontâneo permite identificar com precisão a área exata da localização do marcapasso dominante.

Se os procedimentos cirúrgicos e de carregamento com corante forem seguidos adequadamente, nenhuma alteração significativa nas características fisiológicas do átrio deverá ser observada. Embora a coloração arterial possa exigir uma quantidade maior de corante, o sinal fluorescente no tecido da região do nó sinoatrial parece ser mais estável com este método de carregamento, apresentando um tempo de decaimento da intensidade do sinal após coloração coronariana quase duas vezes maior do que após coloração superficial. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em 30, 40 minutos, se realizada corretamente.

Ao realizar este procedimento, tenha cuidado para localizar a anatomia atrial antes de fazer um corte, a fim de evitar danos ao tecido atrial e ao nó sinusal. Após este procedimento, outras medidas, como gravações convencionais com eletrodos mitrais de vidro, podem ser realizadas para responder perguntas adicionais sobre as características do potencial transmembranar comutativo. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da fisiologia intelectiva explorarem arritmias atriais, incluindo disfunção do nó sinoatrial no coração.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar mapeamento óptico de alta resolução de uma preparação do nó sinusal de camundongo.