Name: De alta resolução Mapping Optical do mouse nó sino-atrial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-02T11:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Aprenda mapeamento óptico de alta resolução do nó sino-atrial em corações de camundongo perfundidos por Langendorff. Esta técnica permite investigar anormalidades do marcapasso e arritmias atriais com resolução espacial e temporal elevada.

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Somos apoiados pela start-up da University of Wisconsin-Madison Medical School (A.V.G.).

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Pub. No. 80-23). Todos os métodos e protocolos utilizados nestes estudos foram aprovados pela Universidade de Wisconsin Animal Care e do Comitê Use Protocolo seguindo as Diretrizes para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo NIH (publicação No. 85-23, revista em 1996). Todos os animais utilizados neste estudo receberam cuidados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 1. Remoção Coração e Langendorff Perfusão <ol><li> Antes do isolamento do coração, a solução de Tyrode quente a 37 ° C usando um banho de água e uma camisa de água. </li><li> Anestesiar o rato com 5% de isoflurano / 95% de O 2. </li><li> Assegurar um nível adequado de anestesia, verificando a perda do reflexo dor. </li><li> Execute toracotomia. Abra o peito usando curvas 5.5 &quot;tesoura Mayo e 5,5&quot; hemostática Kelly paraceps para fazer um corte de 1 cm na parte dianteira do tórax. <ol><li> Rapidamente extrair o coração contra o peito (dentro de 30 seg). Use 4 &quot;forceps Iris curvas para agarrar o tecido pulmonar e cortar o pulmão, timo e coração juntamente com o pericárdio usando 4.3&quot; tesoura Iris. Não pegue o coração diretamente. </li><li> Lavá-lo em oxigenada (95% O2 / 5% de CO 2), a temperatura constante-(36,8 ± 0,4 ° C) modificada solução de Tyrode. Utilize a seguinte composição de solução (em mM): NaCl 128,2, KCl 4,7, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 de MgCl2, 1,3 de CaCl2, 20,0 de NaHCO3 e 11,1 de glucose (pH 7,35 ± 0,05). </li></ol></li><li> Enquanto mergulhando na mesma solução, identificar o pulmão, timo, gordura e tecido. Cuidadosamente dissecar-los a partir do coração. Use curva 3 &quot;Vannas-Tübingen tesoura e 4,3&quot; # 5 fórceps. </li><li> Em seguida, identificar a aorta e canular-lo em um 21 G cânula feitos sob medida. Usar duas curvas 4.3 &quot;força # 5Bps. </li><li> Após a canulação, perfundir simultaneamente (através da cânula, a uma taxa de fluxo de ~ 5 ml / min, o que deve ser ajustado com base na pressão aórtica, ver abaixo) e superfuse (no banho a uma taxa de fluxo de ~ 50 mL / min) o coração com solução de Tyrode aquecido e filtrou-se ao longo de toda a experiência. Passar a solução de perfusão através de um filtro de nylon de 11 ^ M em-linha para evitar o entupimento da circulação coronária. </li><li> Utilizando um transdutor de pressão (ou um medidor de pressão), ligado através de um bloqueio de 3 vias torneira de Luer para a linha de perfusão, monitorizar a pressão aórtica e mantê-lo entre 60 e 80 mmHg. Regule a velocidade de perfusão, se necessário para manter a pressão aórtica dentro desta gama. </li></ol> 2. Mapeamento óptica do SAN do coração inteiro perfusão-Langendorff <ol><li> Instrumentação <ol><li> Colocar o coração na horizontal e fixar o ápice ventricular para o fundo revestido de silicone da câmara utilizando 0,1 mm pinos de diâmetro para prevent movimento durante o experimento induzida por fluxo. 12 </li><li> Inserir um ( &quot;ID x 005&quot; .012) pequeno tubo de silicone para o ventrículo esquerdo (VE) através da veia pulmonar, os átrios esquerdo (AE) e da válvula mitral (VM). Fixar o tubo por um fio de seda (4-0) para o tecido conjuntivo soar. </li><li> Posicione o coração com o seu lado posterior virado para cima (Figura 1A, painel esquerdo). </li><li> Pin a borda do apêndice RA (RAA) para a parte inferior da câmara de silicone de 0,1 mm de diâmetro usando pinos minutien. Ajustar o seu nível, a fim de tornar a superfície posterior da RA plana e permitir que ele seja localizado plano focal da câmara. Isto irá permitir que as medições ópticas a partir da área de superfície máxima do átrio. </li><li> Soga superior (VCS) e inferior (IVC) da veia cava por um fio de seda (4-0), esticar e fixar a outra extremidade do fio de sutura para a parte inferior de uma câmara revestida de silicone (ver Figura 3A). Certifique-se de que as suturas não bloqueiam acampo de vista óptico. </li><li> Coloque o eletrodo de estimulação feito por encomenda na beira da RAA. Para fazer com que os eléctrodos, a utilização de silício revestidas de prata fios de diâmetro 0,25 mm, com distância inter-eléctrodo de 0,5 mm e desprovida de silício para um comprimento de 1 mm na extremidade de estimulação. Em seguida, coloque dois milímetros agulha ECG 12 (29 gauge) eletrodos monopolar perto da base dos ventrículos direito e esquerdo. Coloque o eletrodo ECG chão, perto do ápice dos ventrículos. </li></ol></li><li> coloração <ol><li> Desde ambos os corantes fluorescentes e blebbistatin desacoplador electro-mecânica são sensíveis à luz, execute todos os procedimentos descritos a seguir em um quarto escuro. Em primeiro lugar preparar corante sensível à tensão RH-237 ou di-4-ANNEPS como uma solução estoque, 1,25 mg / ml em sulfóxido de dimetilo (2,5 mM), que aliquota (30 mL cada) e armazenar as alíquotas a -20 ° C. </li><li> Dilui-se 5-10 uL de solução de corante em 1 ml de solução de Tyrode aquecido (37 ° C) e em seguida injectá-lo na linha de perfusão coronáriaao longo de um período de 5-7 min utilizando um Luer porta de injecção em-linha. </li><li> Prepare blebbistatin como uma solução-mãe (2 mg / ml em sulfóxido de dimetilo, 6,8 mM) com antecedência e armazená-lo a 4 ° C. </li><li> Depois de 20 min de estabilização, adicionar (C 37 °) blebbistatin 0,5 ml de aquecido no perfusado e diluir 0,1 ml de blebbistatin em 1 ml de solução (37 ° C) de Tyrode aquecido. Em seguida, injectar na linha de perfusão coronária ao longo de um período de 5-7 min utilizando um Luer porta de injecção em-linha. </li></ol></li></ol> 3. mapeamento óptico da SAN a partir da Preparação atrial isolada <ol><li> Instrumentação <ol><li> Para a preparação atrial isolada, isolar e canular o coração, tal como descrito acima nos passos 1,1-1,5 para a preparação de todo o coração. </li><li> Dissecar os ventrículos para longe do lado anterior. Veja a Figura 1A, painel direito, corte # 1 para detalhes. </li><li> Abra o RA, cortando através da va tricúspidelve (TV) ao longo do eixo TV-SVC. Veja a Figura 1A, painel direito, corte # 2 para mais detalhes. </li><li> Cortar o membro medial da crista terminal para abrir o RAA. Veja a Figura 1A, painel direito, corte # 3. </li><li> Abrir a parede livre do átrio anterior através da realização de um corte a partir da linha média do corte anterior # 3 para a aresta de canto inferior direito da RAA, achatar e fixar a parede livre do átrio ao fundo de uma câmara revestida de silicone. Ver a direcção indicada pela seta oca na Figura 1A, cortar # 4. Preservar um rebordo de tecido ventricular para fixar a preparação para evitar danos às aurículas. </li><li> Da mesma forma, aberta LA cortando o MV ao longo do canto MV-superior do apêndice LA (LAA). </li><li> Para abrir o LAA, cortado a partir do meio do AAE aberta, através da parede anterior livre do átrio até perto de uma borda do meio de AAE. </li><li> Abra a fibrilação alo parede livre anteriorng no mesmo sentido, em seguida, achatar e fixá-lo para a parte inferior de uma câmara de Sylgard revestido. </li><li> Parcialmente remover o tecido do septo interatrial. Isto irá reduzir a dispersão do sinal óptico a partir de tecido que não está em foco. Portanto, tanto a LA e RA, bem como a SAN e da junção atrioventricular (AVJ) são acessíveis nesta preparação (Figura 1B). </li><li> Levanta a preparação final de cerca de 0,5 mm a partir do fundo da câmara revestida de silicone, a fim de permitir que a superfusão de ambas as superfícies do epicárdio e endocárdio. </li><li> Superfuse com a preparação aquecido (37 ° C) solução de Tyrode a uma taxa constante de ~ 12 mL / min para um fluxo concentrado localizado perto do VPC e ~ 30 mL / min para um banho de superfusão. </li><li> Coloque a estimulação feita por medida de Ag / AgCl 2 eléctrodo (0,25 mm de diâmetro) na extremidade do RAA dissecados. Em seguida, coloque dois milímetros agulha ECG 12 (29G) eletrodos (monopolar) perto da RAA e LAA, respectivamente. Coloque no chão ECG eleitosmontou perto da AVJ. </li></ol></li><li> coloração <ol><li> Executar uma aplicação directa do corante sensível à tensão (RH-237 ou di-4-ANNEPS). Para isso, dilui-se 1-2 mL da solução stock de corante em 1 mm de solução de Tyrode aquecido (37 ° C) e, lentamente, libertar o corante diluída sobre a superfície da preparação usando uma pipeta de 1 mm. </li><li> Alternativamente, fibrilação realização da coloração com o corante sensível à tensão através de uma perfusão coronária do coração de Langendorff-perfundidos semelhante ao descrito acima para a preparação de todo o coração (passos 2.2.1-2.2.2). <ol><li> Após a coloração de perfusão coronária, isolar a preparação fibrilação tal como descrito. Realização da coloração de superfície adicional, quando necessário para atingir um nível satisfatório de fluorescência. isolamento atrial rápido não branquear o corante e não afeta a qualidade da coloração. </li></ol></li><li> Imobilizar a preparação com o eletro-mecânico desacoplador, blebbistatin. Diluir 3-5 ul blebbistatin solução estoque na solução de Tyrode aquecido (37 ° C) e, lentamente, libertar o blebbistatin diluída sobre a superfície da preparação e da solução circundante. Desde blebbistatin tem sido mostrado para ser leve, 13,14 evite exposição longa sensível à luz durante a preparação e coloração. </li><li> Executar aplicativo blebbistatin adicional, tanto quanto necessário para suprimir a contração. Normalmente até 3 aplicações adicionais (3-5 ul por cada aplicação) pode ser utilizado para suprimir o artefacto de movimento suficiente a fim de reconstruir com precisão SAN e de activação do átrio. </li><li> Adicionar mais 0,5 ml de blebbistatin aquecido no perfusado. Durante este procedimento, a pausa de superfusão durante 30 segundos para permitir que o corante / blebbistatin para corar o tecido atrial. </li></ol></li></ol> 4. Mapeamento óptica Configurar NOTA:. Uma descrição detalhada do sistema de mapeamento óptico é proporcionado noutro local 12 <ol><li> Use uma câmera com um TEMporal resolução de 2.000 frames / seg ou superior, e uma série de lentes de condensador para chegar a resolução espacial de 100 mm / pixel ou superior. Isso é necessário para reconstruir a ativação SAN e propagação intranodal. </li><li> Para reduzir o movimento artefato a partir da solução de vibração, corrigir uma pequena tampa de vidro sobre a superfície da solução sobre o coração / preparação atrial isolada. </li><li> Use luz de excitação (520 ± 45 nm de comprimento de onda) fornecido por um-corrente constante, lâmpada de halogéneo de baixo ruído. Direcionar o feixe de luz filtrada para a preparação usando um guia de luz flexível bifurcada. </li><li> Filtra-se a fluorescência emitida por um filtro passa longo (&gt; 715 nm). Recolha, digitalizar e salvar o sinal fluorescente adquirida em um software de computador usando fornecido pelo fabricante da câmera. </li></ol> 5. Processamento de Dados Nota: Os dados de mapeamento óptico é recolhido e armazenado como uma série de matrizes de intensidade de fluorescência em diferentes pontos de tempo. Cada represe pixelsnts uma medida da intensidade de fluorescência recolhido de um local específico na preparação de tecido em um ponto de tempo específico. fluorescência de fundo é automaticamente removido por pixel para permitir uma melhor visualização das mudanças de fluorescência produzidos por variações de tensão de membrana e invertida para corresponder com potenciais de ação (APs) medidos por sistemas de microeletrodos. Os detalhes dos diferentes passos no processamento de dados de imagens ópticas, incluindo segmentação de imagens, filtragem espacial, filtragem temporal e remoção de desvio da linha de base, são fornecidos na revisão focada 15. <ol><li> Manualmente ou usando o algoritmo especial (por exemplo, uma detecção de limiar ou a borda) 15 para determinar limites de tecido, criar uma máscara binária de 1 (pixels incluído) e 0 (pixels excluídos) e aplicar a máscara para cada quadro na seqüência. Este processo cria uma imagem binária que destaca as áreas de interesse para posterior processamento. </li><li> Para melhorar a relação sinal-ruído do optdados do iCal, filtrar os sinais dentro das áreas de interesse seleccionados. Para isso, use espacial (ou seja, a média de pixels fluorescentes vizinhos, tal como definido por um bin convolução desejado ou kernel, por exemplo, 3 x 3, ou, para os dados ruidosos, 5 x 5) e / ou filtro temporal (por exemplo, Butterworth, tipo Chebyshev 1, Chebyshov tipo 2, elíptico, etc.) (Figura 2). Tenha em mente a possibilidade de artefatos induzida por filtrados na interpretação dos dados. Para mais detalhes, veja o comentário. 15 </li><li> Remover desvio da linha de base em gravações ópticas quando necessário (usando a filtragem passa-alta ou ajuste polinomial ao sinal original) e, em seguida, normalizar a cada sinal de pixel de 0 (fluorescência mínimo) a 1 (fluorescência máxima). </li><li> Selecione uma janela de tempo que abrange os tempos de ativação de todos os pixels para um único propagação AP. Atribuir cada pixel seu tempo de activação como o tempo máximo de derivado movimento ascendente (df / dt max, onde F é fluorescenintensidade ce). Usando todos os tempos de ativação pixel, reconstruir o mapa de activação isócrono. Cada isocrônica mostrará assim os pixels activados ao mesmo tempo. </li><li> Para reconstituir o mapa de distribuição de duração do PA (DPA), para cada pixel calcular a duração entre o momento de activação e o tempo a um nível específico de repolarização (por exemplo, a 80% de repolarização, APD 80). Usando todos os valores de pixel de APD, reconstruir a distribuição Mapa isócrono de APD. Cada isochron vai mostrar, assim, os pixels com o mesmo APD. </li><li> Para calcular a velocidade de condução para a propagação AP, se ajustar à superfície da preparação dos dados de tempo de activação calculados em 5.4. Para isso, utilizar polinomial superfície de adaptação ou local alisamento da superfície do kernel e, em seguida, calcular os vectores de velocidade de condução do local a partir do gradiente da superfície equipada. </li><li> Para criar o mapa repolarização, atribua cada pixel seu tempo de repolarização, definida como a segunda derivada máxima (d 2 F / dt2) do sinal óptico no final do OAP, ou o tempo de 90% de repolarização. </li></ol>

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<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+sinoatrial+node+function+and+intra-atrial+conduction+in+murine+gain-of-function+Scn5a%2B%2FDeltaKPQ+hearts+suggest+an+overlap+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered sinoatrial node function and intra-atrial conduction in murine gain-of-function Scn5a+/DeltaKPQ hearts suggest an overlap syndrome.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (7), H1510-H1523 (2012).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesse é declarado.

Aqui, nós apresentamos dois tipos de preparações do rato san: 1) SAN intacta no coração toda Langendorff-perfundidos, e 2) SAN no isolado, abriu preparação atrial. Estes dois tipos de preparação servem diferentes propósitos experimentais. Na preparação do coração inteiro de Langendorff-perfundidos, a estrutura fibrilação intacta é preservado o que torna possível estudar arritmias atriais complexos, tais como fibrilação atrial, bem como as interacções entre o SAN e o átrio durante taquiarritmias reentrantes. 6...

Novos avanços científicos que levam a saltos na compreensão da fisiologia humana são frequentemente precedidos por avanços tecnológicos. O mapeamento óptico fluorescente, por exemplo, permite a investigação de múltiplos parâmetros fisiológicos em células e tecidos. 1,2 Melhorou significativamente nossa compreensão de como a estrutura anatômica está associada a funções e disfunções eletrofisiológicas. No coração, o marcapasso natural e os sistemas de condução, como o nó sinoatrial (SAN) e a junção atrioventricular, consistem em miócitos nodais que são isolados pelos miócitos atriais circundantes. 3-5 Essa organização cria estruturas tridimensionais complexas com propriedades elétricas especializadas. A remodelação estrutural e funcional dessas estruturas de marcapasso foi reconhecida por formar heterogeneidades eletrofisiológicas significativas. 6,7 Compreender o mecanismo subjacente a como tais heterogeneidades resultam em disfunções de SAN e arritmogênese atrial beneficiará drasticamente o tratamento clínico dessas doenças. Requer uma técnica para visualizar a propagação de sinais elétricos no nível do tecido, como o mapeamento óptico. 
Recentemente, evidências acumuladas comprovaram o avanço do mapeamento óptico em estudos de eletrofisiologia e patologia atrial. 2 No entanto, estudos novos e rigorosos dependem da interpretação precisa dos dados experimentais, cuja validade e estabilidade dependem de protocolos experimentais cuidadosos. Camundongos geneticamente modificados são amplamente utilizados para pesquisa como modelos animais de doenças humanas, incluindo síndrome do nódulo sinusal, anormalidades do marca-passo e arritmias atriais. 6,8-11 Assim, uma combinação de mapeamento óptico fluorescente com modelos de camundongos transgênicos fornece uma ferramenta poderosa para estudar anormalidades elétricas cardíacas associadas a várias patologias. Neste artigo, apresentamos um protocolo para mapeamento óptico de alta resolução da SAN e do átrio do mouse. Especificamente, discutimos e comparamos diferentes abordagens de carregamento de corante, efeitos do tempo no branqueamento do corante e estabilidade da frequência cardíaca durante o experimento.

<table><tbody><tr><td>camisa de água</td><td>Radnoti</td><td>1660 Series Banho de tecido para procedimentos de isolamento de órgãos grandes ou células únicas Banho-maria</td><td></td></tr><tr><td>/ circulador</td><td>Fisher Scientific</td><td>1016S</td><td></td></tr><tr><td>amplificador de pressão</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore Nylon Net Filters</td><td>Fisher Scientific</td><td>NY1102500</td><td></td></tr><tr><td>Transdutor de pressão</td><td>AD Instrumentos</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>Pinos Minutien de Aço Inoxidável - 0.1 mm de Diâmetro</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>26002-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de perfusão</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4LS</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de superfusão</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4HS</td><td></td></tr><tr><td>Tesouras Vannas Tubingen&nbsp;</td><td>Pinça World Precision Instruments</td><td>503379</td><td></td></tr><tr><td>Dumont</td> World <td>Precision Instruments</td><td>501201, tesoura Mayo 500085</td><td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>501750</td><td></td></tr><tr><td>Pinça hemostática Kelly</td> World <td>Precision Instruments</td><td>501241</td><td></td></tr><tr><td>pinça Iris</td><td>World Precision Instruments</td><td>15917</td><td></td></tr><tr><td>Iris tesoura</td><td>World Precision Instruments</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>ECG 12 mm agulha (29-gauge) eletrodos (monopolar)&nbsp;</td><td>AD Instruments</td><td>MLA1203</td><td></td></tr><tr><td>porta de injeção Luer em linha</td><td>Ibidi</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Ultima-L Câmera CMOS&nbsp;</td><td>SciMedia</td><td>MiCAM-05&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>lâmpada halógena</td><td>Moritex USA Inc</td><td>MHAB-150W</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (6H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 (H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Blebbitatina</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S1109</td><td></td></tr><tr><td>Sulfóxido de dimetila (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr></tbody></table>

de alta resolução mapping optical do mouse nó sino-atrial

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

As disfunções do nó sino-atrial (SAN) e as complicações associadas constituem importantes causas de morbidade em pacientes com doenças cardíacas. O desenvolvimento de novas terapias farmacológicas para curar esses pacientes depende da compreensão completa da fisiologia normal e da fisiopatologia do SAN. Dentre os estudos de marcapasso cardíaco, o SAN de camundongo é amplamente utilizado devido à sua viabilidade para modificações na expressão de diferentes genes que codificam canais iônicos SAN ou proteínas de manipulação de cálcio. Evidências emergentes de estudos eletrofisiológicos e histológicos também provaram a representatividade e semelhança da estrutura e funções do SAN de camundongos com mamíferos maiores, incluindo a presença de vias de condução especializadas do SAN para o átrio e uma hierarquia complexa de marcapassos dentro do SAN. Recentemente, a técnica de mapeamento óptico facilitou muito a exploração e investigação da origem da excitação e condução dentro e fora da SAN de camundongos, o que, por sua vez, ampliou a compreensão da SAN e beneficiou os tratamentos clínicos de doenças associadas à disfunção da SAN. Neste manuscrito, descrevemos em detalhes como realizar o mapeamento óptico da SAN do camundongo a partir do coração intacto perfundido por Langendorff e do preparado atrial isolado. Este protocolo é uma ferramenta útil para melhorar a compreensão da fisiologia e fisiopatologia do SAN de camundongos.

Mapeamento óptica do SAN Intact do coração perfundido-Langendorff Um exemplo típico de um mapa de contorno activação RA reconstruída para o ritmo sinusal espontânea é mostrado na Figura 3 para um coração de rato perfundido de Langendorff-. O ponto de activação precoce está localizada dentro da região perto do intercaval SVC onde o SAN é definido anatomicamente. 3,16 mapas de contorno activação Dois RA adquiridos a 1,0 e 0,5 ms taxa de a...

Aqui, apresentamos um protocolo para o mapeamento óptico da atividade elétrica do átrio direito do mouse e, especialmente, o nó sino-atrial, em uma alta resolução espacial e temporal.

De alta resolução Mapping Optical do mouse nó sino-atrial

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

O objetivo geral deste protocolo experimental é realizar o mapeamento óptico do nó sinoatrial de camundongo em um coração intacto perfundido por Langendorff ou em uma preparação atrial isolada. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de eletrofisiologia e fisiopatologia do nó sinoatrial sobre os mecanismos de anormalidades marcapasso, síndrome do seio doente e várias doenças associadas a arritmias atriais. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a investigação de múltiplos parâmetros em tecidos intactos com resolução espacial muito alta e resolução temporal.Após confirmar o nível apropriado de anestesia por meio da compressão dos dedos dos pés, utilize tesoura curva Mayo de 5,5 polegadas e pinça hemostática Kelly de 5,5 polegadas para fazer uma incisão de um centímetro na parte frontal do tórax. Usando pinça de Iris curva de quatro polegadas, segure rapidamente o tecido pulmonar e utilize tesoura de Iris de quatro terços de polegada para remover juntos o pulmão, o timo e o coração, junto com o pericárdio. Lave os tecidos em solução de Tyrode modificada oxigenada a 37 graus Celsius.Em seguida, utilize tesoura curva Vannas Tubingen de três polegadas e pinça número cinco de quatro terços de polegada para remover os pulmões, o timo e o tecido adiposo do coração. A seguir, use uma cânula personalizada de 21 gauge e duas pinças curvas B número cinco de 4,3 polegadas para canular a aorta e simultaneamente perfundir e superfundir o coração com solução de Tyrode a 37 graus Celsius, direcionando a solução através de um filtro de náilon de 11 mícrons em linha antes da perfusão, a fim de evitar o entupimento da circulação coronariana. Em seguida, conecte um transdutor de pressão a um conector Luer lock na linha de perfusão por meio de uma torneira de três vias para monitorar a pressão aórtica, ajustando a velocidade de perfusão conforme necessário para manter a pressão aórtica entre 60 e 80 milímetros de mercúrio.Para a mapeamento óptico do nó sinoatrial em um coração perfundido pelo método de Langendorff, posicione o órgão em orientação horizontal com a face posterior voltada para cima em uma câmara de banho de tecido de vidro e utilize pinos de diâmetro de 0,1 milímetro para fixar o ápice ventricular ao fundo revestido com silicone da câmara, evitando assim movimentos induzidos pelo fluxo durante o experimento. Insira um pequeno tubo de silicone no ventrículo esquerdo por meio da veia pulmonar, átrio esquerdo e válvula mitral e utilize um fio de seda 40 para fixar o tubo ao tecido conjuntivo circundante. Em seguida, utilize outro fio de seda 40 para amarrar as veias cavas superior e inferior e fixe a borda da orelha do átrio direito ao fundo da câmara.Estique e fixe a outra extremidade da sutura na base da câmara e posicione um eletrodo de estimulação personalizado na borda da orelha atrial direita. Em seguida, posicione dois eletrodos agulha monopolar de eletrocardiograma de 12 milímetros próximos à base dos ventrículos direito e esquerdo e coloque o eletrodo de terra do eletrocardiograma próximo ao ápice do ventrículo. Para corar o tecido, injete o corante diluído em um orifício de perfusão em linha na tubulação de perfusão coronariana para entrega ao longo de um período de cinco a sete minutos.Após 20 minutos de estabilização, adicione 0,5 mililitros de blebbistatina a 37 graus Celsius ao perfusato, seguido pela injeção de 0,1 mililitro de blebbistatina diluída em 1 mililitro de solução de Tyrode a 37 graus Celsius na linha de perfusão coronariana ao longo de mais cinco a sete minutos, utilizando um porto de injeção Luer lock em linha. A blebbistatina deve ser usada com cautela. Para evitar a precipitação do inibidor, dissolva primeiramente a blebbistatina em meio aquecido até ficar completamente claro a 37 graus e agite vigorosamente a mistura.Para mapear opticamente a amostra, fixe primeiro um pequeno vidro de cobertura sobre a superfície da solução acima do tecido, a fim de reduzir quaisquer artefatos de movimento provocados pela vibração da solução. Em seguida, utilizando uma guia de luz bifurcada flexível com luz de excitação fornecida por uma lâmpada de halogênio de corrente constante e baixo ruído, direcione o feixe de luz filtrado sobre o tecido e capture a sinal fluorescente resultante. Após canular o coração conforme acabou de ser demonstrado, dissecar os ventrículos do lado anterior e abrir o átrio direito através da válvula tricúspide ao longo do eixo da válvula tricúspide-veia cava superior, seguido por uma incisão através do ramo medial da crista terminal.Para abrir a parede livre anterior do átrio, faça uma incisão a partir da linha média do corte do ramo medial até a borda do canto inferior direito da orelha do átrio direito e fixe a parede livre atrial achatada na base de uma câmara revestida com silicone. Para abrir a orelha do átrio esquerdo, corte através da válvula mitral ao longo do canto superior da válvula mitral da orelha do átrio esquerdo. Em seguida, fixe o átrio esquerdo aberto da mesma forma que foi feito anteriormente para o átrio direito.Em seguida, remova parcialmente o tecido ventricular. Preserve uma borda de tecido ventricular para fixar a preparação, evitando danos aos átrios, e fixe o tecido no fundo de uma câmara revestida com Sylgard. Agora, levante a preparação final cerca de 0,5 milímetros do fundo da câmara revestida com silicone para permitir a superfusão tanto das superfícies epicárdica quanto endocárdica e realize a superfusão da amostra com solução de Tyrode a 37 graus Celsius.Em seguida, posicione um eletrodo personalizado de prata cloreto na borda do apêndice atrial direito dissecado. Coloque um eletrodo agulha monopolar de 12 milímetros para eletrocardiograma próximo a cada um dos apêndices atriais direito e esquerdo, e posicione o eletrodo de terra do eletrocardiograma próximo à junção átrio-ventricular. Para corar o tecido cardíaco, utilize uma pipeta de 1 milímetro para liberar lentamente o corante sensível à voltagem diluído em solução de Tyrode a 37 graus Celsius diretamente sobre o tecido.Em seguida, imobilize a amostra com a aplicação direta de blebbistatina diluída sobre o tecido, seguida pela administração de mais 0,5 mililitros de blebbistatina por meio do perfusato e realize a mapeamento óptico da amostra conforme acabou de ser demonstrado. As etapas de coloração do tecido e inibição pela blebbistatina são críticas, exigindo implementação precisa e um procedimento de coloração exato para que os parâmetros fisiológicos atriais, incluindo a frequência cardíaca, a localização do marcapasso dominante e a condução atrial, não sejam afetados. Aqui é apresentado um mapa típico de contorno de ativação do átrio direito reconstruído para ritmo sinusal espontâneo de um coração de camundongo perfundido pelo método de Langendorff, juntamente com dois mapas de contorno correspondentes do átrio direito adquiridos com taxas de amostragem de 1 e 0,5 milissegundo.O ponto de ativação inicial localiza-se na região intercaval próxima à veia cava superior, onde o nó sinoatrial é anatomicamente definido. Neste experimento, após a estimulação elétrica da orelha atrial direita por pelo menos um minuto a 10 a 12 hertz, a estimulação elétrica foi interrompida e o tempo de recuperação do nó sinoatrial foi calculado como o intervalo de tempo entre o último potencial de ação captado e o primeiro potencial de ação espontâneo. A ativação da preparação atrial isolada durante o ritmo sinusal espontâneo permite identificar com precisão a área exata da localização do marcapasso dominante.Se os procedimentos cirúrgicos e de carregamento com corante forem seguidos adequadamente, nenhuma alteração significativa nas características fisiológicas do átrio deverá ser observada. Embora a coloração arterial possa exigir uma quantidade maior de corante, o sinal fluorescente no tecido da região do nó sinoatrial parece ser mais estável com este método de carregamento, apresentando um tempo de decaimento da intensidade do sinal após coloração coronariana quase duas vezes maior do que após coloração superficial. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em 30, 40 minutos, se realizada corretamente.Ao realizar este procedimento, tenha cuidado para localizar a anatomia atrial antes de fazer um corte, a fim de evitar danos ao tecido atrial e ao nó sinusal. Após este procedimento, outras medidas, como gravações convencionais com eletrodos mitrais de vidro, podem ser realizadas para responder perguntas adicionais sobre as características do potencial transmembranar comutativo. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da fisiologia intelectiva explorarem arritmias atriais, incluindo disfunção do nó sinoatrial no coração.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar mapeamento óptico de alta resolução de uma preparação do nó sinusal de camundongo.

high-resolution-optical-mapping-of-the-mouse-sino-atrial-node

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo descreve uma técnica de alta resolução temporal e espacial, visualmente, movimento de ação potencial imagem sobre a superfície de corações de ratos perfundidos Langendorff-utilizando um corante potenciométrica (di-8-ANEPPS).

Mapeamento óptica de corações perfundidos Langendorff-Rat

Este relatório fornece uma descrição detalhada da metodologia e os resultados do mapeamento endocárdico e epicárdico simultâneos óptico de excitação elétrica no átrio esquerdo intacto de um coração de ovelha Langendorff-perfundidos durante o alongamento induzida por fibrilação atrial.

Alta Resolução Mapeamento endocárdico e epicárdico óptico em um modelo de Ovinos de Stretch Induzida por Fibrilação Atrial

Este artigo descreve os procedimentos básicos para a realização de experimentos de mapeamento óptico no coração de coelho Langendorff-perfundidos usando o sistema de imagem panorâmica, ea modalidade de imagem dupla (tensão e cálcio).

Multiparamétrico Mapping Optical do Coração Coelho Langendorff-perfundidos

Este artigo detalha o procedimento de dissecação, a configuração instrumental, e as condições experimentais durante o mapeamento óptico de potencial transmembrana (Vm) e transientes de cálcio intracelular (CAT) em Langendorff isolados intactos corações perfundidos mouse.

Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar o nó sinoatrial ou SAN do coração do camundongo. O SAN abriga as células sinoatriais que iniciam os batimentos cardíacos gerando potenciais de ação espontâneos.

Isolamento do nó sinoatrial do modelo de camundongo: um procedimento para colher o nó SA do coração murino

Este protocolo descreve a avaliação eletrofisiológica dos átrios murino utilizando um sistema óptico de mapeamento com alta resolução temporal e espacial, incluindo gravações duas da tensão da membrana e Ca2 + transitória sob programado estimulação através de um cateter eletrodo especializados.

Avaliação eletrofisiológica de murino átrios com mapeamento óptico de alta resolução

Fornecemos um protocolo passo-a-passo para a coloração por imunofluorescência de montagem completa do nó sinoatrial (SAN) e do nó atrioventricular (AVN) em corações murinos.

Coloração de Imunofluorescência de Montagem Inteira, Imagem Confocal e Reconstrução 3D do Nó Sinoatrial e Atrioventricular em Camundongo

Este protocolo visa descrever uma nova metodologia para medir a taxa de disparo cardíaco intrínseco usando o registro de matriz de microeletrínda de todo o tecido do nódulo sinoatrial para identificar defeitos de marcação de ritmo em camundongos. Agentes farmacológicos também podem ser introduzidos neste método para estudar seus efeitos no ritmo intrínseco.

Microelectrode Array Gravação da Taxa de Disparo de Nó Sinoatrial para identificar defeitos intrínsecos de marcação cardíaca em camundongos

Relatamos um método para reconstrução mesoscópica de todo o coração do rato, combinando novos avanços na transformação e coloração de tecidos com o desenvolvimento de um microscópio de folha de luz digitalizado axialmente.

Imagem óptica mesoscópica do coração de todo o rato

O protocolo utiliza microscopia avançada de folha de luz junto com métodos adaptados de limpeza de tecidos para investigar estruturas cardíacas intrincadas em corações de roedores, com grande potencial para a compreensão da morfogênese e remodelação cardíaca.

Imagem de folha de luz para revelar estrutura cardíaca em corações de roedores

Aprenda mapeamento óptico de alta resolução do nó sino-atrial em corações de camundongo perfundidos por Langendorff. Esta técnica permite investigar anormalidades do marcapasso e arritmias atriais com resolução espacial e temporal elevada.

De alta resolução Mapping Optical do mouse nó sino-atrial

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