Mapeamento QTL e edição CRISPR / Cas9 para identificar um gene de resistência a medicamentos em Toxoplasma gondii

O objetivo geral deste mapeamento de locus de características quantitativas e da metodologia de edição do genoma CRIPR/Cas9 é identificar e posteriormente verificar um gene envolvido na resistência à sinefungina em Toxoplasma. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave em parasitologia, como as bases genéticas para variantes, patogênese e resistência a medicamentos. A principal vantagem dessas técnicas é o uso de dados de sequenciamento do genoma completo para análise precisa de QTL e edição do genoma CRISPR/Cas9 para manipulação genética eficiente em Toxoplasma.

Demonstrando o procedimento estará o Dr. Robin Powell, um pesquisador associado do meu laboratório. Os parasitas Toxoplasma gondii são cultivados em fibroblastos humanos confluentes do prepúcio ou células HFF, semeados em frascos T25 com meio D10. Para testar clones de progênie individuais quanto à resistência à sinefungina, cultive cada clone até alta densidade de parasitas até que a maioria dos parasitas comece a lisar as células hospedeiras.

Depois de preparar a solução do parasita conforme descrito no protocolo de texto, use um pipetador, para passar 2,5 vezes 10 para o quinto parasita para um novo frasco de cultura T25 HFF contendo meio D10, com uma concentração de trabalho de 0,3 micromolar do medicamento sinefungina. Cultive os parasitas a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por sete a 10 dias. Observe a monocamada de células HFF sob um microscópio de contraste de fase invertida e marque a progênie para o fenótipo de crescimento na droga sinefungina.

Por exemplo, pontuação zero para nenhum crescimento e pontuação um para crescimento e lise da monocamada. Uma vez que toda a progênie tenha sido pontuada, os dados serão usados como um fenótipo binário para locus de características quantitativas ou mapeamento de QTL. Para identificar a mutação causal, as leituras de sequenciamento do genoma completo da progênie são alinhadas ao genoma de referência da fita van sensível à sinefungina, os SNPs são chamados e o locus QTL é escaneado em busca de um SNP associado à resistência à sinefungina.

A confirmação de que SNR1 é o gene de resistência à sinefungina será realizada pela inativação de SNR1 em um fundo sensível à sinefungina do tipo selvagem usando mutações indel induzidas por CRISPR/Cas9. Para construir o plasmídeo CRISPR específico de SNR1, o plasmídeo CRISPR direcionado a UPRT é usado como modelo na mutagênese dirigida ao local baseada em PCR usando primers específicos projetados. Os produtos de mutagênese contendo o gene de interesse plasmídeos CRISPR específicos são transformados em células E.Coli.

Os clones individuais são então colhidos e cultivados em meio LB e os plasmídeos extraídos são analisados por eletroforese em gel de DNA para verificar seu tamanho. Os plasmídeos são subsequentemente sequenciados para confirmar a sequência de RNA guia específica do alvo. Quando o plasmídeo CRISPR específico do alvo é introduzido em uma célula de Toxoplasma, o RNA guia direciona o núcleo Cas9 para o alvo para causar uma quebra de DNA de fita dupla para fora do locus específico no alvo.

A quebra do DNA é então corrigida por atividade propensa a erros, não homóloga e de união, levando a mutações indel no gene alvo. Dois a três dias antes da transvecção de parasitas com o plasmídeo CRISPR específico para SNR1, adicione parasitas suficientes a um frasco T25 contendo uma monocamada de células HFF confluente para atingir a lise de células HFF de 70% a 80% em dois a três dias. Examine a cultura em um microscópio de contraste de fase invertida para confirmar que a monocamada de HFF é 70% a 80% lisada pelos parasitas.

Remova suavemente o meio com uma pipeta e lave as células da superfície do frasco com cinco mililitros de tampão citomix. Transferir a solução do parasita para um tubo cónico de 15 mililitros. Passe a solução parasitária por uma seringa de 10 mililitros com uma agulha romba de calibre 22, duas a três vezes.

Para remover células HFF e detritos celulares, filtre a solução parasitária através de uma membrana com um tamanho de poro de três mícrons em um novo tubo cônico. Palete os parasitas filtrados por centrifugação a 400 vezes G por 10 minutos. Despeje o sobrenadante e ressuspenda os parasitas paletados com 10 mililitros de tampão citomix.

Remova uma alíquota de 10 microlitros para determinar a concentração do parasita com um hemocitômetro. Preparar novamente o resto da suspensão por centrifugação a 400 vezes G durante 10 minutos. Remover o sobrenadante e ressuspender a paleta no interior do tampão de mistura para obter uma densidade de quatro vezes 10 elevado ao sétimo parasitas por mililitro.

Em uma cubeta de quatro mililitros, misture 250 a 300 microlitros da solução do parasita com 7,5 microgramas de plasmídeo CRISPR, seis microlitros de ATP e seis microlitros de glutationa. Eletroporar os parasitas, seguindo um procedimento padrão para transvecção de T gondii. Inclua uma eletroporação separada como controle negativo, na qual um plasmídeo CRISPR tem como alvo outro lugar.

Cultive os parasitas eletroporados em um frasco T25, semeado com células HFF a 37 graus Celsius por dois dias. Para iniciar o procedimento de exame das mutações induzidas, primeiro substitua o meio no frasco por cinco mililitros de D10, contendo 0,3 micromoles de sinefungina. Manter os parasitas e o meio de seleção por pelo menos três passagens até que a poça resistente se torne estável.

Como indicado pela ausência de crescimento do parasita no grupo de controle negativo, mas crescimento robusto do parasita no grupo experimental. Subclonar o pool resistente à sinefungina para obter filamentos coloniais. Colete parasitas recém-saídos, purifique por filtração por membrana de três mícrons e subclone em placas de 96 poços, semeadas com células HFF confluentes em 150 microlitros de meio D10.

Cultive as culturas de subclonagem em uma incubadora de CO2 a 37 graus Celsius por sete a 10 dias, sem perturbar as placas. Após sete a 10 dias, verifique as placas de 96 poços em um microscópio de contraste de fase invertida. Procure poços que contenham apenas uma placa e marque esses poços.

Transfira as células de cada poço para placas de 24 poços, semeadas com células HFF. Incubar a 37 graus Celsius. Quando os parasitas começarem a lisar a monocamada, passe 50 microlitros da solução do parasita para um novo poço para manter a cepa e colha o restante para isolamento do DNA genômico.

Aplique uma paleta no restante da solução parasita a 1000 vezes G por 10 minutos. Lave os parasitas com PBS e penteie-os novamente. Isole o DNA genômico de células paletadas usando um kit comercial ou fervendo e ressuspendendo parasitas em 50 a 100 microlitros de PBS.

Por fim, realizar PCR conforme descrito no protocolo de texto para obter um fragmento do gene SNR1 para sequenciamento. A progênie da derivada cruzada, usando cepas de van resistentes a FUDR parentais ME49 e sinefungina, foi acessada quanto à resistência à droga, sinefungina, conforme indicado pelo crescimento e lise da monocamada de HFF. Uma varredura de QTL resultou em um pico significativo no cromossomo nove, abrangendo aproximadamente um MBP.

A mutação causal está localizada nesta região. O sequenciamento do genoma completo levou à identificação da mutação. Os SNPs da progênie dentro do locus QTL foram importados para uma planilha e escaneados para um padrão em que a progênie resistente à sinefungina mostrada em amarelo tem um SNP e a progênie sensível à sinefungina, mostrada em verde, não.

Apenas um SNP indicado em vermelho, correspondeu a esse padrão que resulta em uma codona de parada precoce em um suposto gene transportador de aminoácidos denominado SNR1. Quando o plasmídeo SNR1 direcionado ao caso nove de CRISPR foi eletroporado em uma cepa de parasita do tipo selvagem sensível à sinefungina, mutantes resistentes foram obtidos quando cultivados em sinefungina. Em contraste, nenhum parasita resistente à sinefungina foi obtido com um plasmídeo CRISPR direcionado a outro lugar.

Vários mutantes CRISPR resistentes à sinefungina foram clonados na região ao redor do alvo de RNA guia SNR1 foi sequenciado. Representativos dos resultados da cepa RH do tipo selvagem e mutantes resistentes à sinefungina C5 e C6 mostram que cada mutante tinha um indel que interrompeu a sequência codificadora do gene SNR1. Não se esqueça de que trabalhar com Toxoplasma gondii pode ser perigoso, pois é infeccioso para os seres humanos.

Precauções devem ser tomadas durante este procedimento, como o manuseio adequado de perfurocortantes que possam entrar em contato com o parasita. Após este procedimento, outros métodos como a inserção de genes exógenos específicos do local mediado por CRISPR/Cas9 podem ser realizados, a fim de responder a perguntas adicionais como complementação genética ou construção de parasitas transgênicos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da parasitologia molecular explorarem a complexa biologia e os mecanismos de patogênese do Toxoplasma gondii.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a análise de QTL, usando dados de sequenciamento do genoma. Bem como, metabulação genética de Toxoplasma gondii usando edição de genes CRISPR/Cas9.