Name: Mapeamento QTL e edição CRISPR / Cas9 para identificar um gene de resistência a medicamentos em Toxoplasma gondii (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Aprenda mapeamento QTL e edição CRISPR/Cas9 para identificar genes de resistência a sinefungina em Toxoplasma gondii. Este método combina sequenciamento genômico e manipulação genética precisa para estudos em parasitologia.

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Gostaríamos de agradecer L. David Sibley e Asis Khan por sua contribuição para a publicação original sobre a qual esses protocolos se baseiam. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health grant AI108721.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Estes protocolos apresentam vários métodos que, quando combinados, permitem a identificação de um gene de resistência a fármacos em T. gondii . Dois em particular eram parte integrante do projeto, o método relativamente temperado de mapeamento QTL e o método recentemente desenvolvido de edição de genes CRISPR / Cas9. Lander e Botstein publicaram seu papel influente em 1989, demonstrando mapeamento QTL que correlaciona loci genéticos com fenótipos 36 . Mais recentemente, em 2012, Dounda e Charpentier descreveram o sistema de edição CRISPR / Cas9 em Streptococcus pyogenes 22 que foi rapidamente adaptado como uma ferramenta genética em muitos modelos diferentes, incluindo T. gondii 13 , 17 . Ambos os métodos foram úteis aqui, onde o mapeamento QTL definiu o locus que contém a mutação de resistência ao fármaco que foi finalmente identificada usando a detecção SNP baseada em WGS, e a edição CRISPR / Cas9 forneceu o eu<html> Para confirmar SNR1 é o gene de resistência a fármacos de sinefungina. O ME49-FUDR r X VAND-SNF r cross 8 foi desenvolvido originalmente para interrogar um fenótipo de virulência 19 , mas as cepas parentais também tiveram uma diferença fenotípica adicional para a qual o gene causal não era conhecido, a resistência à senofungina no pai VAND. Isso destaca um benefício de cruzamentos na medida em que eles podem ser repurposados ​​quando diferenças fenotípicas adicionais nos pais são observadas. Este foi o caso de outra cruz de Toxoplasma , tipo 2 x tipo 3, onde vários genes envolvidos em virulência foram encontrados pelo mapeamento de múltiplos fenótipos 37 , 38 , 39 , 40 . Até à data, quatro cruzamentos diferentes de T. gondii foram descritos e utilizados para mapear genes responsáveis ​​por fenótiposSs = &quot;xref&quot;&gt; 8 , 37 , 41 , 42 , todos os quais podem ser reutilizados para mapear novos fenótipos para os quais a base genética é desconhecida. Nessa linha, os genomas para 62 cepas de T. gondii que representam a diversidade genética global conhecida foram sequenciados 43 . Novas cruzes poderiam ser feitas a partir deste grupo para cepas que diferem em fenótipos interessantes. Tendo exalado as vantagens do mapeamento QTL, é preciso dizer que gerar uma cruz não é uma empresa menor. Existem outros métodos que podem ser usados ​​para identificar genes causais. Uma técnica poderosa usa mutagênese química para criar mutantes que podem ser rastreados para fenótipos. Para encontrar o gene causal, os mutantes podem ser complementados com bibliotecas de cosmídeos 44 ou os métodos de reséquitância do genoma podem ser usados ​​para encontrar a mutação causal 45 . Por moVeja isso, veja dois artigos JoVE de Coleman et al. E Walwyn et al. Que descrevem essas abordagens 46 , 47 . Muitas das etapas que conduzem à identificação da mutação SNF causal (Protocolos 2 e 3) dependem de métodos computacionais realizados com software livremente disponível para uso acadêmico. Os comandos detalhados para cada passo são fornecidos e, quando executados com os arquivos adequados, o usuário poderá recriar os conjuntos de dados necessários para encontrar SNF causal SNP. Tenha em mente que algumas das sintaxe nos comandos referem-se a nomes de arquivos ou estrutura de diretório ($ PATH) que podem ser modificados para a preferência do usuário. Embora os comandos fornecidos aqui certamente não esgrimem as formas em que se pode analisar uma cruz com análise QTL e identificação SNP baseada em WGS, eles são suficientemente abrangentes para repetir a experiência descrita neste artigo e devem permitir que o usuário se torne m<html> Saiba como essas abordagens são utilizadas de forma gradual. Embora o mapeamento QTL e a detecção de SNP baseada em seqüência WGS fossem suficientes para identificar um gene SNF r candidato, são necessárias experiências adicionais para confirmar seu papel na resistência a medicamentos. Isso pode ser demonstrado de forma convincente através de técnicas de interrupção do gene ou knockout, ambas as quais podem ser alcançadas usando a edição de genes CRISPR / Cas9. Métodos detalhados para usar CRISPR / Cas9 para gerar mutações de indel ou inserir construções transgênicas em um gene alvo em T. gondii são fornecidos. A especificidade de segmentação que o CRISPR / Cas9 fornece aumenta a eficiência da edição de genes em relação aos métodos tradicionais. Além disso, isso aumentou de forma eficiente possibilitou a utilização de estirpes não laboratoriais adaptadas para estudos genéticos que anteriormente eram difíceis de modificar 13 . Embora em sua infância, CRISPR / Cas9 já foi usado para fazer interrupções de genesLass = &quot;xref&quot;&gt; 2 , 13 , 17 , 18 , 48 , 49 , marcam os genes 17 e fazem os knockouts de genes 16 , 19 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 em T. gondii , prometendo ser uma ferramenta útil Para muitos outros estudos no futuro. A descoberta de que a inativação de SNR1 leva à resistência a sinefungina torna o locus SNR1 um site promissor para inserção de transgenes ou complementação genética. Para maximizar o sucesso da utilização da segmentação gênica mediada por CRISPR / Cas9 para direcionar a integração do transgene no locus SNR1 , os seguintes aspectos devem ser consideradosVermelho durante o desenho experimental. Primeiro, recomenda-se que um marcador de seleção seja incluído na construção transgênica para aumentar a eficiência da construção da deformação. Se um marcador de seleção estiver incluído, pode-se usar seleção positiva e negativa, resultando em quase 100% dos parasitas duplamente selecionados sendo transgênicos com o GOI integrado no locus SNR1 . Em contraste, se a construção transgênica não contém traços selecionáveis ​​adicionais e depende da seleção negativa no locus SNR1 , a eficiência da transgênese bem sucedida depende em grande parte da eficiência da cotransfecção do plasmídeo CRISPR e da construção transgênica. Em segundo lugar, embora a integração direta do local mediada pelo CRISPR / Cas9 de um fragmento de DNA não homólogo seja freqüentemente utilizada para a complementação e transgênese, deve-se notar que a orientação da inserção não pode ser garantida em casos tais que qualquer direção seja possível. Isso pode representar problemasMs para algumas aplicações. Por exemplo, para complementar um mutante com diferentes alelos de genes, é difícil garantir que todos os alelos sejam inseridos na mesma orientação e discrepâncias na orientação podem causar diferenças de expressão. Para este tipo de aplicação, são recomendadas construções de DNA com sequências homólogas ao locus SNR1 , o que conduzirá a orientação de integração adequada ( Figura 6 ). Em terceiro lugar, durante a transfecção, a relação entre o plasmídeo CRISPR e a molécula de DNA transgênico é crítica para o sucesso da construção de deformação transgênica. Essa relação precisa ser ajustada de acordo com as estratégias de seleção. Recomenda-se as seguintes diretrizes: 1) Se a construção transgênica contém um marcador resistente ao medicamento e a droga correspondente é a única seleção usada para gerar parasitas transgênicos, ou seja , a sinefungina não é utilizada, a proporção molar sugerida entre a construção transgênica e o plasmídeo CRISPRId é 1: 5. O uso de mais plasmídeo CRISPR neste caso aumenta a probabilidade de que os parasitas que recebem a construção transgênica também receberão o plasmídeo CRISPR, portanto, os parasitas resistentes a fármacos são mais propensos a ter o marcador inserido no site de direcionamento CRISPR. Se a razão for invertida, a maioria dos parasitas que receberão a construção transgênica não receberá o plasmídeo CRISPR. Como conseqüência, a grande maioria dos parasitas resistentes aos fármacos obtém a construção transgênica por meio de integração aleatória não associada à inserção específica do site mediada por CRISPR / CAS9. 2) Se a construção transgênica contém um marcador resistente ao fármaco e o medicamento correspondente é usado junto com a sinefungina para selecionar parasitas transgênicos, a proporção molar sugerida entre a construção transgênica e o plasmídeo CRISPR é de 1: 1. Esta estratégia fornece a maior eficiência de construção de deformação transgênica. 3) Se a construção transgênica não contiver um criador selecionável, dependendo da seleção negativaPor sinefungin sozinho para obter parasitas transgênicos, a proporção molar sugerida entre a construção transgênica e o plasmídeo CRISPR é de 5: 1. O raciocínio para este projeto é o mesmo que na primeira diretriz acima. Uma vez que tanto a pirimetamina quanto a sinefungina foram utilizadas para seleção no Protocolo 5, a proporção entre o mini-gene DHFR * e o plasmídeo CRISPR visando SNR1 foi estabelecida como 1: 1. Em conjunto, os métodos descritos aqui têm um nível de detalhe que não foi possível transmitir na publicação original que identificou SNR1 2 . Esses protocolos; Especificamente, a sintaxe da linha de comando, o layout seqüencial dos programas utilizados e o uso de CRISPR / Cas9 devem ajudar futuros esforços para identificar novos genes responsáveis ​​por fenótipos.

O intervalo de hospedagem determina a extensão da prevalência de parasitas. Alguns parasitas possuem requisitos de host muito específicos que limitam a área a partir da qual são encontrados, outros são generalistas. Um desses generalistas é Toxoplasma gondii ( T. gondii) . Este parasita é encontrado em todo o mundo, pois pode infectar todos os mamíferos e muitas aves. Os seres humanos também são suscetíveis e estima-se que cerca de 1/3 da população global tenha sido infectada. Felizmente, uma resposta imune robusta normalmente controla o crescimento do parasita, mas em situações onde o sistema imunológico está comprometido, o parasita pode crescer sem controle e causar doenças, muitas vezes encefálicas. Além disso, este parasita pode causar doenças congênitas se as mulheres previamente não infectadas estiverem infectadas durante a gravidez, pois não possuem memória imune para limitar rapidamente a disseminação do parasita. Além disso, há uma carga de toxoplasmose ocular que pode resultar em perda de visão 1 . Para estes reasoNs T. gondii tornou-se um foco de estudo, e devido aos muitos métodos moleculares desenvolvidos para o seu estudo, um modelo para parasitas Apicomplexan. Dois métodos que serão discutidos aqui são o mapeamento do Locus de Traço Quantitativo (QTL) e as Repetições de Palindromus Curto (CRISPR) / Cas9 Regularmente Interspaced Clustered Regularmente (CRISPR) / Cas9. O mapeamento QTL e a edição CRISPR / Cas9 são, respectivamente, abordagens genéticas diretas e reversas que foram utilizadas em estudos anteriores para identificar e / ou caracterizar os genes de virulência de T. gondii . Aqui, esses métodos são combinados para identificar e confirmar a função de um gene de resistência a sinefungina (SNF r ), TgME49_290860 e seus orthologs (anotado como SNR1 ) 2 . Embora T. gondii possa infectar uma grande variedade de hospedeiros intermediários, ele deve passar e infectar as células epiteliais intestinais de um felino para completar o ciclo de vida. Os gatos são os anfitriões definitivos do parasita onde o sSão produzidos estágios exuais e a recombinação genética via meiosis ocorre. Para realizar um estudo QTL, é necessário criar uma cruz genética e, no caso do Toxoplasma, isso significa passar por duas cepas parasitárias diferentes que diferem em um traço fenotípico, as manchas parentais, através de um gato para produzir progênies recombinantes 3 . Antes de serem alimentados com gatos, as cepas parentais são resistentes a drogas separadas para permitir uma identificação mais eficiente de recombinantes por seleção de drogas duplas da progênie 4 . Três drogas foram usadas em T. gondii para esse propósito; Fluorodeoxirribose (FUDR) para o qual a uracilo fosforibosil transferase ( UPRT ) é o gene de resistência 5 , adenosina arabinósido (ARA) para o qual a adenosina quinase ( AK ) é o gene de resistência 6 e a sinefungina (SNF) para a qual o gene de resistência era desconhecido 7 . Várias cruzes genéticas foramCriado para T. gondii , mas apenas a progênie 24 da cruz ME49-FUDR r X VAND-SNF r foram genotipadas usando seqüenciamento do genoma completo (WGS) 8 . Isso abriu a possibilidade de mapear e identificar o gene de resistência SNF usando esta cruz, pois o pai VAND foi feito resistente a sinefungina por mutagênese química da cepa VAND (VAND-SNF s ) sensível a fármaco e o genoma de referência VAND foi sequenciado utilizando o VAND- Estirpe de SNF, permitindo assim a identificação de todos os polimorfismos entre a progênie WGS e o genoma de referência do VAND-SNF, incluindo a mutação VAND-SNF r herdada que resultou em alguma resistência à sinefungina da progênie. Para identificar o polimorfismo causal de nucleotídeo único (SNP) na progênie SNF r , vários recursos de fonte aberta baseados em computação podem ser usados ​​para analisar os dados. Para criar o mapa genético para ME49-FUDR r X VAND-SNF r cruzou o conjunto de software REDHORSE 9, que usa os alinhamentos do WGS dos pais e progênies para detectar com precisão as posições genômicas de crossoversos genéticos. Esta informação de mapeamento pode então ser combinada com os dados fenotípicos (SNF r na progênie) para formatar um conjunto de dados compatível com o pacote &#39;qtl&#39; 10 no software de programação estatística R onde uma varredura QTL pode ser executada para revelar loci significativo correlacionado com o Fenótipo. Para identificar o SNP causal localizado dentro do locus QTL, as leituras WGS da progênie podem ser alinhadas individualmente ao genoma VAND sensível ao sinefungina usando o programa de alinhamento Bowtie 2 11, do qual os SNPs podem ser chamados usando o programa variador do VarScan mpileup2snp 12 . Usando estes SNPs, o locus QTL pode então ser escaneado para polimorfismos que estão presentes no SNF r, mas nãoNa progênie do SNF. Com o SNP causal identificado na região de codificação de um gene, a modificação genética do gene SNF r candidato pode ser realizada em uma estirpe SNF para verificar a função de resistência ao fármaco. O sistema de edição do genoma CRISPR / Cas9 foi recentemente estabelecido no Toxoplasma 13 , que adicionou ferramentas importantes para a exploração da biologia complexa desse parasita, particularmente para estudos genéticos em estirpes não laboratoriais adaptadas. Devido à atividade altamente ativada de união de extremidade não homóloga (NHEJ) em células de WT Toxoplasma , a modificação de genoma direcionada é difícil de conseguir, uma vez que o DNA introduzido de forma exógena é integrado aleatoriamente ao genoma em alta freqüência 14 . Para aumentar a taxa de sucesso da modificação específica do locus, foram utilizadas diferentes abordagens para aumentar a eficiência da recombinação homóloga e / ou diminuirE atividade do NHEJ 15 , 16 . Uma dessas abordagens é o sistema CRISPR / Cas9. Comparado com outros métodos, o sistema CRISPR / Cas9 é eficiente na introdução de modificações específicas do site e é fácil de desenhar 13 , 17 , 18 . Além disso, pode ser usado em qualquer estirpe de Toxoplasma sem modificação extra ao parasita 13 , 19 . O sistema CRISPR / Cas9 originou-se do sistema imune adaptativo de Streptococcus pyogenes , que o usa para defender a invasão de elementos genéticos móveis, como os fagos 20 , 21 , 22 . Este sistema utiliza a enzima endonuclease de DNA guiada por RNA Cas9 para introduzir a ruptura de DNA de duas vertentes (DSB) no alvo, que é subsequentemente reparadoEnvolvidos pelo NHEJ propenso a erros para inativar genes alvo através de mutações curtas de indel, ou por recombinação direta de homologia para alterar o locus alvo exatamente como projetado 23 , 24 . A especificidade do alvo é determinada por uma molécula de RNA pequena chamada ARN de guia único (gRNA), que contém uma seqüência de 20 nt projetada individualmente que possui 100% de homologia com o DNA alvo 22 . A molécula de gRNA também contém assinaturas reconhecidas por Cas9 que orientam a nuclease para o site alvo, que inclui um Motivo Adjacente Protospacer especial (PAM, sequência é &#39;NGG&#39;) 25 , 26 . Portanto, a molécula de gRNA e a sequência PAM trabalham em conjunto para determinar o local de clivagem Cas9 no genoma. Pode-se mudar facilmente a sequência gRNA para segmentar diferentes sites para clivagem. Quando o sistema CRISPR / Cas9 foi desenvolvido pela primeira vez em ToxopLasma, um único plasmídeo que expressa a nuclease Cas9 e a molécula de ARNt foi usado para introduzir DSB no local de direcionamento 13 , 17 . Demonstrou-se que o sistema CRISPR / Cas9 aumenta drasticamente a eficiência da modificação do genoma específico do local, não apenas por recombinação homóloga, mas também a integração não homóloga do DNA exógeno 13 . Ele faz isso em cepas de tipo selvagem que contêm atividade de NHEJ. Portanto, esse sistema pode ser usado essencialmente em qualquer estirpe Toxoplasma para a edição eficiente do genoma. Num experimento típico, o plasmídeo CRISPR específico do alvo e o fragmento de DNA utilizado para modificar o alvo são co-transfectados em parasitas. Se o fragmento de DNA usado para modificar o alvo contém sequências homólogas para o locus alvo, a recombinação homóloga pode ser usada para reparar o DSB introduzido por CRISPR / Cas9 para permitir uma modificação precisa do alvo. Por outro lado, se o intO fragmento de DNA roduzido não contém sequência homóloga, ainda pode ser integrado no site de segmentação CRISPR / Cas9. Este último é usado frequentemente para interromper genes por inserção de marcadores selecionáveis ​​ou complementar mutantes em loci que permitem a seleção negativa 13 . Aqui o locus SNR1 serve como um exemplo para mostrar como CRISPR / Cas9 pode ser usado para a ruptura de genes e a geração de parasitas transgênicos.

<table><tbody><tr><td>Frascos T25</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos do Prepúcio Humano (HFF)</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1041</td><td></td></tr><tr><td>T. gondii ME49 cepa</td><td>ATCC</td><td>50840</td><td></td></tr><tr><td>T. gondiiVAND cepa</td><td>ATCC</td><td>PRA-344</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Sem Bicarbonato de Sódio)</td><td>Ciências da Vida</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S5761</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS) Grau Premium</td><td>VWR International</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina&nbsp; 200</td><td>mM Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina (10 mg/mL)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td>Raspador de</td></tr><tr><td>Células 15710064 para Frascos</td><td>VWR International</td><td>10062-904</td><td></td></tr><tr><td>Seringa 10 mL</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas rombas 22 G x 1"</td><td>Produtos BRICO</td><td>BN2210</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Nucleporos 3.0 &micro; m, 25 mm</td> Suporte <td>de</td> Filtro Swin-Lok 110612 <td></td><td>GE Healthcare</td></tr><tr><td>25 mm</td><td>Propper de</td> Hemacitômetro GE Healthcare <td>420200</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MFG</td><td>90001</td><td></td></tr><tr><td>Sinefungin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>380-070-M001</td><td></td></tr><tr><td>R&nbsp;</td><td>A Fundação R</td><td>https://www.r-project.org/</td><td></td></tr> <tr><td>J/qtl</td><td>O Grupo Churchill</td><td>http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml</td><td></td></tr><tr><td>Gravata Borboleta2</td><td>Universidade John Hopkins</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td><td></td></tr><tr><td>NCBI SRA Toolkit</td><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc</td><td></td></tr><tr><td>SAMtools</td><td>Instituto Wellcome Trust Sanger</td><td>http://www.htslib.org/</td><td></td></tr> <tr><td>VarScan</td><td>Universidade de Washington, St Louis</td><td>http://varscan.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>MUMmer</td><td>JCVI & Univ Hamburg</td><td>http://mummer.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #54467</td><td>T. gondii Plasmídeo CRISPR para cortar o gene UPRT</td></tr><tr><td>pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #59855</td><td>T. gondii Plasmídeo CRISPR para cortar o gene TG*_290860 SNR1</td></tr><tr><td>pUPRT::D HFR-D</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #58528</td><td>Modelo para DHFR* mini gene</td></tr><tr><td>Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E0552S</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>Aldrich E5134</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Trilossato de adenosina (ATP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>L-glutationa (GSH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 Sistema de Eletroporação</td><td>BTX</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de Eletroporação&nbsp; 4 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0126</td><td></td></tr><tr><td>Crytal Violet</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21932-14</td><td></td></tr><tr><td>Placa TC de 6 poços</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Placa TC de 24 poços</td><td>Corning</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura redondo de 12 mm</td><td>VWR International</td><td>89015-724</td><td></td></tr><tr><td>Placa TC de 96 poços</td><td>Corning</td><td>353075</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Clonagem de Montagem Gibson (Multi-fragmento)</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Polimerase de Alta Fidelidade&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Pirimetamina</td><td>TCI AMÉRICA</td><td>P2037-1G</td><td>Use cuation ao usar parasitas resistentes à pirimetamina - consulte o protocolo</td></tr></tbody></table>

mapeamento qtl e edição crispr / cas9 para identificar um gene de resistência a medicamentos em<em&gt; toxoplasma gondii</em

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

O conhecimento científico está intrinsecamente ligado às tecnologias e métodos disponíveis. Este artigo apresentará dois métodos que permitiram a identificação e verificação de um gene de resistência ao fármaco no parasita de Apicomplexan Toxoplasma gondii , o método de mapeamento quantitativo de locus de traço (QTL) usando um mapa genético baseado em Seqüência de Genoma Inteiro (WGS) e o método De repetições palindromicas curtas em intervalos regulares e irregulares (CRISPR) / edição de genes com base em Cas9. A abordagem do mapeamento QTL permite testar se existe uma correlação entre uma (s) região (s) genômica e um fenótipo. Dois conjuntos de dados são necessários para executar um exame QTL, um mapa genético baseado na progênie de uma cruz recombinante e um fenótipo quantificável avaliado em cada uma das progênies dessa cruz. Esses conjuntos de dados são então formatados para serem compatíveis com o software R / qtl que gera uma varredura QTL para identificar locus significativos correlacionados com o fenótipo. Embora isso possa reduzir muito a pesquisa wIndependentemente de possíveis candidatos, as QTLs abrangem regiões que contêm uma série de genes dos quais o gene causal precisa ser identificado. Ter WGS da progênie foi crítico para identificar a mutação causal de resistência ao medicamento no nível do gene. Uma vez identificada, a mutação candidata pode ser verificada por manipulação genética de parasitas sensíveis a fármacos. O método mais fácil e eficiente para modificar geneticamente T. gondii é o sistema CRISPR / Cas9. Este sistema compreendeu apenas 2 componentes ambos codificados em um único plasmídeo, um RNA de guia único (gRNA) contendo uma sequência de 20 pb complementar ao alvo genômico e a endonuclease Cas9 que gera uma ruptura de DNA de dupla cadeia (DSB) no alvo, Cujo reparo permite a inserção ou exclusão de seqüências ao redor do local de quebra. Este artigo fornece protocolos detalhados para usar as ferramentas de edição de genoma baseadas em CRISPR / Cas9 para verificar o gene responsável pela resistência à sinefungina e para construir parasitas transgênicos.

Este artigo descreve detalhadamente vários métodos que podem ser usados ​​em sucessão para identificar um gene responsável pela resistência aos medicamentos ( Figura 1 ). A progênie 24 do cruzamento ME49-FUDR r X VAND-SNF r foi avaliada quanto à resistência ao fármaco sinefungina como descrito no Protocolo 1. Usando o mapa genético e o fenótipo SNF r da progênie, uma varredura QTL foi administrada em R / Qtl - Protocolo 2 ( Figura 2 ). Isso resultou em um pico significativo no cromossomo IX que abrange aproximadamente 1 Mbp. É nessa região que a mutação causal está localizada. Para identificar a mutação causal, as leituras WGS da progênie foram alinhadas ao genoma de referência do VAND-SNF usando Bowtie2 - Protocolo 3.1, os SNPs foram chamados usando VarScan mpileup2snp - Protocolo 3.2 e o locus QTL no genoma VAND foi identificado usando MUMmer - ProtocOl 3.3. Os SNPs de progênie dentro do locus QTL foram extraídos e escaneados para um padrão em que a progênie do SNF possui SNP e SNFs não, o que é viável porque os SNP de progênie foram obtidos em comparação com o genoma de referência do VAND-SNF ( Figura 3 ) . Apenas um SNP corresponde a este padrão que resulta em um codão de parada precoce em um gene transportador de aminoácidos putativo chamado SNR1 . A confirmação de que SNR1 é o gene da resistência SNF foi realizada usando o sistema CRISPR / Cas9. Um novo plasmídeo CRISPR / Cas9 projetado para a edição de genes de T. gondii foi feito contendo um gRNA visando o gene SNR1 perto da mutação SNF r identificada na progênie - Protocolo 4 ( Figura 4A ). O plasmídeo CRISPR / Cas9 de SNR1 foi submetido a electroporação em uma estirpe de parasita WT de SNF e foram obtidos mutantes resistentes quando o cultoEm 0,3 μM de sinefungina. Nenhum parasita SNF foi obtido quando eletroporizado com o UPRT visando o plasmídeo CRISPR / Cas9. Vários mutantes SNF r CRISPR foram clonados e a região em torno do alvo SNR1 gRNA foi sequenciada. Cada mutante tinha um indel que interrompeu a sequência de codificação do gene SNR1 ( Figura 4B ). Este método também pode ser usado para inserir uma construção de segmentação no locus SNR1 via NHEJ ( Figura 5), ou por HR ( Figura 6 ) - Arquivo Suplementar 2 . <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig1.jpg" /> Figura 1: Fluxo de trabalho esquemático para experiências descritas nos protocolos. Os principais passos na identificação e confirmação do gene SNF r usando a cruz ME49-FUDR r X VAND-SNF r são mostrados com referência aos protocolos apropriados descritos em tSeu artigo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig2.jpg" /> Figura 2: Comandos R / qtl para executar o QTL Scan no fenótipo SNF r . Os comandos descritos no Protocolo 2 foram executados em R usando o pacote qtl. Os comandos representativos e o enredo são mostrados. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig3.jpg" /> Figura 3: Localização do SNP causal. Progênie As leituras WGS foram alinhadas ao genoma de referência do VAND-SNF com Bowtie 2, os SNPs foram chamados com VarScan e os correspondentes<html> Localizador VAND QTL identificado com MUMmer. Os SNP localizados dentro do locus QTL foram importados para uma planilha e o SNP causal foi identificado. SNF r progênie (amarelo), SNF s progênie (verde), SNF r SNP (vermelho) (consulte o Arquivo de Dados 3 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig4.jpg" /> Figura 4: Confirmação de SNR1 como SNF r Gene usando CRISPR / Cas9. ( A ) mutações indel induzidas por CRISPR / Cas9 (verde) no locus SNR1 . ( B ) Indels representativos em SNR1 causados ​​por dois plasmídeos CRISPR específicos de SNR1 (C5 e C6, respectivamente). RH é a estirpe WT e C5 e C6 são mutantes SNF r . (B é retirado da referênciaS = &quot;xref&quot;&gt; 2). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig5.jpg" /> Figura 5. Mutagênese Insertiva usando CRISPR / Cas9. ( A ) Inserção de genes complementares ou transgênicos no locus SNR1 pela integração com o site mediado pelo CRISPR / Cas9. Duas possíveis orientações do mini gene DHFR * inserido e os iniciadores utilizados para identificação, F1 / 2 e R1 / 2 representam os locais de iniciação de oligos utilizados em PCRs de diagnóstico. ( B ) PCRs de diagnóstico de um clone snr1 :: DHFR * , RH é usado como um controle WT. O PCR do GRA1p é incluído como um controle que verifica a qualidade do DNA genômico como modelos. Os asteriscos indicam pistas com bandas inespecíficas (a Figura 5B é retirada da referênciaCe 2 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig6.jpg" /> Figura 6: Knockout de genes usando CRISPR / Cas9. Um design clássico para CRISPR / Cas9 mediada em substituição de genes homólogos em T. gondii . A orientação do transgene inserido é fixada neste caso. F1 / R1, F2 / R2 e F3 / R3 representam os locais de iniciação de oligos utilizados em PCRs de diagnóstico. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Arquivo de dados 1: ME49-FUDR r X VAND-SNF r Arquivo cruzado fOu use em formato R / qtl, &quot;csv&quot;. Um arquivo .csv que pode ser carregado em R / qtl com a opção format = &quot;csv&quot;. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_1.csv" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a> Arquivo de dados 2: (chrid txt, genotype txt, markerpos.txt, mname.txt, phenonames.txt e phenos.txt). ME49-FUDR r X VAND-SNF r Arquivos cruzados para uso no formato R / qtl, &quot;gary&quot;. Seis arquivos .txt que podem ser carregados em R / qtl com a opção format = &quot;gary&quot;. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_2.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a> Arquivo de dados 3. Folha de cálculo com SNP de progênie através do SNF r <stronG&gt; QTL Locus. Contém uma planilha com SNP de progênies e uma segunda planilha com os dados fenotípicos dos pais e progenitura da cruz. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_3.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a> Arquivo suplementar 1: Detalhes adicionais do protocolo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_1_-_101916.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a> Arquivo Suplementar 2: Protocolo 5 - Utilização de Seleção Negativa no Locus SNR1 para Complementação Genética ou Construção de Cotações Transgênicas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_2_-_101916.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a></a>

Os detalhes são apresentados sobre como o mapeamento de QTL com um mapa genético baseado em seqüências genômicas inteiras pode ser usado para identificar um gene de resistência a drogas em Toxoplasma gondii e como isso pode ser verificado com o sistema CRISPR / Cas9 que edita eficientemente um alvo genômico, neste caso o Gene de resistência a drogas.

Mapeamento QTL e edição CRISPR / Cas9 para identificar um gene de resistência a medicamentos em<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

O objetivo geral desta metodologia de mapeamento de locos de características quantitativas e edição do genoma com CRISPR/Cas9 é identificar e, posteriormente, verificar um gene envolvido na resistência à sinefungina em Toxoplasma. Esses métodos podem ajudar a responder perguntas fundamentais em parasitologia, como as bases genéticas de variantes, patogênese e resistência a medicamentos. A principal vantagem dessas técnicas é o uso de dados de sequenciamento completo do genoma para análise precisa de QTL e a edição do genoma com CRISPR/Cas9 para manipulação genética eficiente em Toxoplasma.Quem demonstrará o procedimento será o Dr. Robin Powell, pesquisador associado do meu laboratório. Os parasitas Toxoplasma gondii são cultivados em células de fibroblasto de prepúcio humano ou células HFF confluente, semeadas em frascos T25 com meio D10. Para testar clones individuais de progênie quanto à resistência à sinefungina, cultive cada clone até alta densidade parasitária, até que a maioria dos parasitas comece a lisar as células hospedeiras.Após preparar a solução de parasitas conforme descrito no protocolo textual, utilize uma pipeta para transferir 2,5 vezes 10 à quinta parasitas para um novo frasco de cultura T25 com fibroblastos de HFF contendo meio D10, com uma concentração de trabalho de 0,3 micromolar da droga sinefungina. Incube os parasitas a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por sete a dez dias. Observe a monocamada de células HFF em microscópio invertido de contraste de fase e avalie a prole quanto ao fenótipo de crescimento na presença da droga sinefungina.Por exemplo, atribua pontuação zero para ausência de crescimento e pontuação um para crescimento e lise da monocamada. Após a pontuação de toda a prole, os dados serão utilizados como um fenótipo binário para mapeamento de locos de características quantitativas ou QTL. Para identificar a mutação causal, as leituras de sequenciamento completo do genoma da prole são alinhadas ao genoma de referência sensível à sinefungina da linhagem van, são identificadas SNPs e o locus QTL é analisado em busca de uma SNP associada à resistência à sinefungina.A confirmação de que SNR1 é o gene de resistência à sinefungina será realizada por meio da inativação de SNR1 em um linhagem selvagem sensível à sinefungina utilizando mutações do tipo indel induzidas por CRISPR/Cas9. Para construir o plasmídeo específico para CRISPR direcionado a SNR1, o plasmídeo de CRISPR direcionado a UPRT é usado como molde em mutagênese direcionada por PCR com primers especificamente desenhados. Os produtos da mutagênese, contendo os plasmídeos de CRISPR específicos para o gene de interesse, são transformados em células de E. coli.Em seguida, clones individuais são selecionados e cultivados em meio LB, e os plasmídeos extraídos são analisados por eletroforese em gel de DNA para verificar seu tamanho. Os plasmídeos são posteriormente sequenciados para confirmar a sequência específica do RNA guia. Quando o plasmídeo CRISPR específico para o alvo é introduzido em uma célula de Toxoplasma, o RNA guia direciona a Cas9 ao local-alvo, provocando uma quebra de dupla fita no DNA de um locus específico no alvo.A quebra do DNA é então corrigida por uma atividade propensa a erros, não homóloga e de ligação, levando a mutações do tipo inserção-deleção (indel) no gene alvo. Dois a três dias antes de transfectar os parasitas com o plasmídeo CRISPR específico para SNR1, adicione parasitas suficientes a um frasco T25 contendo uma monocamada de células HFF confluente para atingir 70% a 80% de lise das células HFF em dois a três dias. Examine a cultura em microscópio invertido de contraste de fase para confirmar que a monocamada de HFF está 70% a 80% lisada pelos parasitas.Remova cuidadosamente o meio com uma pipeta e lave as células da superfície do frasco com cinco mililitros de tampão cytomix. Transfira a solução de parasitas para um tubo cônico de 15 mililitros. Passe a solução de parasitas através de uma seringa de 10 mililitros com agulha romba de calibre 22, duas a três vezes.Para remover as células HFF e os detritos celulares, filtre a solução de parasitas através de uma membrana com tamanho de poro de três mícrons em um novo tubo cônico. Pelote os parasitas filtrados por centrifugação a 400 vezes G durante 10 minutos. Descarte o sobrenadante e re-suspenda os parasitas pelotizados com 10 mililitros de tampão cytomix.Retire uma alíquota de 10 microlitros para determinar a concentração de parasitas com um hemocitômetro. Pelize o restante da suspensão novamente por centrifugação a 400 × g durante 10 minutos. Remova o sobrenadante e re-suspenda o pellet no tampão de mistura para obter uma densidade de 4 × 10⁷ parasitas por mililitro.Em uma cubeta com entreferro de quatro mililitros, misture 250 a 300 microlitros da solução de parasitas com 7,5 microgramas do plasmídeo CRISPR, seis microlitros de ATP e seis microlitros de glutationa. Eletropore os parasitas, seguindo um procedimento padrão para transvecção de T gondii. Inclua uma eletroporação separada como controle negativo, na qual um plasmídeo CRISPR tenha como alvo outra região.Cultive os parasitas eletroporados em um frasco T25, semeado com células HFF a 37 graus Celsius por dois dias. Para iniciar o procedimento de análise das mutações induzidas, primeiramente substitua o meio no frasco por cinco mililitros de D10, contendo 0,3 micromolares de sinefungina. Mantenha os parasitas e o meio de seleção por pelo menos três passagens até que o pool resistente se torne estável.Conforme indicado pela ausência de crescimento do parasita no grupo controle negativo, mas crescimento robusto do parasita no grupo experimental. Subclonar o pool resistente à sinefungina para obter linhagens coloniais. Coletar parasitas recém-egressos, purificar por filtração em membrana de três mícrons e subclonar em placas de 96 poços, semeadas com células HFF confluentes em 150 microlitros de meio D10.Cultive as culturas de subclonagem em uma incubadora de CO2 a 37 graus Celsius por sete a 10 dias, sem perturbar as placas. Após sete a 10 dias, examine as placas de 96 poços em um microscópio invertido de contraste de fase. Procure por poços que contenham apenas uma placa e marque esses poços.Transfira as células de cada poço para placas de 24 poços, semeadas com células HFF. Incube a 37 graus Celsius. Quando os parasitas começarem a lisar a monocamada, transfira 50 microlitros da solução de parasitas para um novo poço para manter a linhagem e colete o restante para o isolamento de DNA genômico.Centrifugue o restante da solução de parasitas a 1000 × g durante 10 minutos. Lave os parasitas centrifugados com PBS e centrifugue-os novamente. Isole o DNA genômico de células centrifugadas usando um kit comercial ou por ebulição e re-suspenda os parasitas em 50 a 100 microlitros de PBS.Por fim, realize a PCR conforme descrito no protocolo textual para obter um fragmento do gene SNR1 para sequenciamento. A prole derivada do cruzamento, utilizando as linhagens parentais ME49 resistentes ao FUDR e van resistentes à sinefungina, foi avaliada quanto à resistência à droga sinefungina, indicada pelo crescimento e lise da monocamada de HFF. Uma análise de QTL resultou em um pico significativo no cromossomo nove, abrangendo aproximadamente um MBP.A mutação causal está localizada nesta região. O sequenciamento completo do genoma levou à identificação da mutação. Os SNPs da prole dentro do locus QTL foram importados para uma planilha e analisados em busca de um padrão no qual a prole resistente à sinefungina, mostrada em amarelo, possui um SNP, enquanto a prole sensível à sinefungina, mostrada em verde, não possui.Apenas um SNP indicado em vermelho correspondeu a esse padrão, resultando em um códon de parada precoce em um gene putativo de transportador de aminoácidos denominado SNR1. Quando o plasmídeo CRISPR Cas9 direcionado ao SNR1 foi eletroporado em uma linhagem selvagem de parasita sensível à sinefungina, obtiveram-se mutantes resistentes ao serem cultivados na presença de sinefungina. Em contraste, nenhum parasita resistente à sinefungina foi obtido com um plasmídeo CRISPR que direcionava outro local.Vários mutantes resistentes à sinefungina foram clonados e a região ao redor do alvo do RNA guia SNR1 foi sequenciada. Representantes dos resultados obtidos com a linhagem selvagem RH e os mutantes C5 e C6 resistentes à sinefungina mostram que cada mutante apresentava uma inserção ou deleção (indel) que interrompeu a sequência codificadora do gene SNR1. Não se esqueça de que trabalhar com Toxoplasma gondii pode ser perigoso, pois é infeccioso para os seres humanos.Devem ser tomadas precauções durante este procedimento, como o manuseio adequado de materiais perfurocortantes que possam entrar em contato com o parasita. Após este procedimento, outros métodos, como a inserção exógena de genes mediada por CRISPR/Cas9 em locais específicos, podem ser realizados, a fim de responder perguntas adicionais, como complementação genética ou construção de parasitas transgênicos. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de parasitologia molecular explorarem a biologia complexa e os mecanismos de patogênese em Toxoplasma gondii.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a análise de QTL, utilizando dados de sequenciamento genômico, bem como da manipulação genética de Toxoplasma gondii usando edição gênica com CRISPR/Cas9.

qtl-mapping-crisprcas9-editing-to-identify-drug-resistance-gene

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Encaminhar a genética é um método poderoso para desvendar a nível molecular de...

A tela de genética para isolar Toxoplasma gondii Host de células mutantes egresso

Aqui nós relatamos um método para usar tipo I e tipo...

Manipulação genética em<em&gt; Δku80</em&gt; Cepas para Análise Genômica Funcional de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Descreve-se um método para realizar a análise genética baseada em Chlamydia mutagénese química e sequenciação do genoma inteiro. Além disso, um sistema de intercâmbio de ADN no interior das células infectadas está descrito que pode ser usado para o mapeamento genético. Este método pode ser largamente aplicável a sistemas microbianos sem sistemas de transformação e técnicas de genética molecular.

Abordagens para a frente genéticos em<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

A genética avançada é uma abordagem poderosa para identificar genes em patógenos intracelulares importantes para a resistência à imunidade autônoma celular. A abordagem atual usa células imunes inatas, especificamente macrófagos, para identificar novos genes de Toxoplasma gondii importantes para a evasão imunológica.

Atacante Genetics telas usando macrófagos para Identificar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; genes importantes celular para Resistance to-IFN-γ Dependente Immunity Autónoma

Nós descrevemos um método para gerar MLG-baseado condicionais "knockdown" mutantes do Plasmodium falciparum usando CRISPR/Cas9 edição do genoma.

CRISPR/Cas9 Gene edição para fazer condicional mutantes de humano parasita da malária por p. falciparum

Aqui, nós descrevemos um protocolo para introduzir um nocaute do gene no amastigotas extracelular de Trypanosoma cruzi, usando o sistema de crispr/Cas9. O phenotype do crescimento pode ser seguido acima pela contagem da pilha da cultura axênicos do amastigotas ou pela proliferação de amastigotas intracelular após a invasão da pilha de anfitrião.

Introduzindo um nocaute genético diretamente no estágio Amastigote do Trypanosoma cruzi usando o sistema crispr/Cas9

Descrito aqui é um método para exclusão genética direcionada e sem marcadores em Chlamydia trachomatis usando mutgênese de troca de floxed, FLAEM.

Exclusão genética sem marcadores por Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagênese em Chlamydia trachomatis

Apresentado aqui é um protocolo para avaliar a eficácia da inibição de compostos químicos contra o crescimento intracelular in vitro de Toxoplasma gondii usando um ensaio de crescimento à base de luciferase. A técnica é usada para confirmar a especificidade da inibição pela exclusão genética do gene alvo correspondente. A inibição do LHVS contra a protease TgCPL é avaliada como um exemplo.

Determinação da eficiência do inibidor químico contra o crescimento intracelular toxoplasma Gondii usando um ensaio de crescimento baseado em luciferase

O objetivo deste protocolo é permitir a edição perfeita do genoma C. elegans usando complexos de ribonucleoproteína montados e o marcador co-CRISPR dpy-10 para triagem. Este protocolo pode ser usado para fazer uma variedade de modificações genéticas em C. elegans incluindo inserções, exclusões, substituições genéticas e substituições de codon.

CRISPR/Cas9 Edição do Gene C. elegans rbm-3.2 utilizando o marcador de triagem co-CRISPR dpy-10 e complexos de ribonucleoproteína montados.

A Biotinilação Iluminada Restrita por Localização específica (ALIBi) é um método optogeneticamente ativado inovador desenvolvido para marcar e purificar populações subcelulares de ribossomos para sequenciamento a jusante e análise proteômica.

Isolamento de Subpopulações Subcelulares de Ribossomo Baseado em Biotinilação Iluminada Aprimorada por Localização Específica de Etiquetas Peptídicas Recombinantes

A genética química envolve a substituição de um resíduo de gatekeeper por um aminoácido contendo uma cadeia lateral diferente no locus alvo. Aqui, geramos um parasita mutante contendo um alelo hipomórfico de cdpk1 e identificamos vias compensatórias adotadas pelo parasita no fundo mutante.

Compreendendo o desenvolvimento de vias compensatórias em um parasita mutante da malária que abriga alelo hipomórfico de quinases semelhantes a plantas

Aprenda mapeamento QTL e edição CRISPR/Cas9 para identificar genes de resistência a sinefungina em Toxoplasma gondii. Este método combina sequenciamento genômico e manipulação genética precisa para estudos em parasitologia.

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