Hibridização In Situ para a localização precisa de transcrições em Plantas

O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar os padrões de expressão de mRNA no nível celular com alta sensibilidade e especificidade. Isso é conseguido primeiro tomando seções de tecido formais, fixas e embebidas em parafina através de uma série de soluções para remover a cera permanente nos tecidos e bloquear grupos menores carregados positivamente nos tecidos que podem produzir um sinal de fundo. Posteriormente, uma sonda de RNA marcada com DIG específica para o gene de interesse é infiltrada nas seções de tecido e as lâminas são hibridizadas durante a noite.

Em seguida, as lâminas são tratadas com RNAs. A para remover a sonda não especificamente ligada das seções e, em seguida, incubada com anticorpo anti-DIG. Isso permite a visualização da sonda hibridizada por uma reação química métrica colorida.

Os resultados mostram um sinal azul escuro detectável por microscopia de luz especificamente nas células do tecido em que o gene de interesse é expresso. A principal vantagem desta técnica de nossa outra análise de expressão, como R-T-P-C-R, microray ou Next Generation Sequencing é que o protocolo de hibridização I mostrado aqui revela o padrão de expressão de um gene de interesse em seu contexto tecidual. Esses métodos incluem muitas etapas que são melhor aprendidas por demonstrações visuais.

Mostraremos como seccionar e incorporar tecidos, bem como as principais etapas do protocolo profissional de hibridização de Al que são difíceis de dominar por conta própria. O método de incorporação de tecidos fixados com paraldeído varia de acordo com o tipo de tecido a ser analisado. O ponto mais importante aqui é garantir que as amostras sejam orientadas corretamente para seccionamento posterior.

Um método de incorporação é usar moldes e anéis de plástico. Para iniciar este procedimento, aqueça os moldes em uma placa de aquecimento de 60 graus Celsius e, em seguida, despeje a parafina derretida nos moldes. Em seguida, use uma pinça aquecida para transferir uma amostra de tecido para cada molde e orientá-la para a posição desejada.

Mova cuidadosamente o molde da placa para a bancada e coloque o anel branco no molde. Adicione mais mol e cera. Deixe a cera esfriar e endurecer gradualmente antes de seccionar.

Aqueça os blocos à temperatura ambiente e, em seguida, corte cada bloco em forma de trapézio, deixando cerca de um milímetro de cera ao redor da amostra. Coloque o bloco aparado no micrótomo de forma que a mais longa das duas faces paralelas fique na parte inferior. Traga cuidadosamente o bloco para a frente da lâmina e certifique-se de que a superfície do bloco esteja paralela à seção da lâmina.

Como uma espessura de oito a 10 mícrons. Alinhe as fitas de cera em uma superfície antiaderente, como papel alumínio, e selecione as seções de interesse em um escopo de dissecação. Em seguida, marque os slides prob bon plus com um lápis.

Não use canetas em marcadores porque elas serão apagadas durante o protocolo de hibridização INI dois. Distribua um mililitro de água limpa mili Q em cada lâmina. Flutue cuidadosamente as seções de interesse na superfície da água em temperatura ambiente.

Certifique-se de que o lado brilhante esteja voltado para a água. Transfira a corrediça lentamente para um aquecedor de lâminas. Definido em 35 a 37 graus Celsius.

Esta faixa de temperatura, ao contrário dos 42 graus Celsius comumente usados, evita a formação de bolhas sob as seções. Após cinco minutos, despeje a água com cuidado, mas em um movimento suave, de modo que a fita seja abaixada sobre a lâmina. Deixe as lâminas secarem por pelo menos várias horas ou durante a noite a 37 graus Celsius para que o tecido adira para preparar as seções de tecido.

Para hibridização in situ, eles são primeiro depa e reidratados para finalização de depa. Incubar as lâminas em duas trocas de solução hística transparente por 10 minutos cada. Para reidratar as secções de tecido, passar as lâminas por uma série de concentrações decrescentes de etanol durante 30 segundos cada.

Durante o tratamento com protease, que não é mostrado neste vídeo, prepare um prato de vidro com solução de amina de triatlo 0,1 molar e coloque-o em uma placa de agitação em uma capela de exaustão. Imediatamente antes de colocar o rack deslizante de metal na solução, adicione 1,25 mililitros de anidrido acético na amina do triatlo, no tampão e na escada. Além disso, configure o clampsistema de fixação e suporte para segurar o rack deslizante.

Reduza a velocidade do Starr clamp o rack deslizante no suporte e abaixe o rack na solução, mantendo-o elevado acima da barra de agitação. Continue a mexer lentamente por 10 minutos após ser enxaguado em PBS e desidratado novamente por meio de uma série de etanol. As seções de tecido estão prontas para hibridização.

Coloque as lâminas em uma superfície limpa e deixe o ar secar completamente por cinco a 10 minutos. Prepare a mistura de tampão de hibridização da sonda adicionando a sonda desnaturada a 80 microlitros de tampão de hibridização. Para cada lâmina, misture bem pipetando e evite fazer bolhas.

Pipetar o tampão de hibridização da sonda. Misture na borda direita do slide. Abaixe gradualmente uma lamínula na lâmina, certificando-se de que a solução de hibridização cubra todas as seções sem bolhas.

Bata levemente no recorte da capa com o dedo onde as bolhas se formam para deslocá-las de todas as seções do tecido. Não puxe o recorte da tampa, pois isso danificará as seções. Coloque as lâminas em uma câmara de umidade contendo papel watman umedecido com água UE e amplamente coberto com param.

Feche bem a caixa e incube as lâminas na temperatura de hibridização desejada, normalmente de 50 a 55 graus Celsius por 16 a 20 horas. Na conclusão do protocolo de hibridização, remova cuidadosamente as lamínulas das lâminas. A lamínula pode simplesmente cair quando a corrediça é colocada na vertical, mas se não, não puxe a lamínula, pois isso danificará as seções.

Em vez disso, mergulhe a lâmina em 0.2 vezes SSC morno por um ou dois minutos para lavar a lamínula após remover as lamínulas, coloque as lâminas em um rack e lave várias vezes em 0.2 vezes SSC a 55 graus Celsius. Após o tratamento de RNAs, transfira as lâminas do rack para o fundo de uma caixa plástica plana e cubra com um volume mínimo de solução de bloqueio. Bloqueie as lâminas por 45 minutos em temperatura ambiente em uma plataforma que treme lentamente.

Em seguida, aplique um volume mínimo de solução de anticorpos diretamente em cada lâmina. Incube as lâminas no escuro por duas a três horas em temperatura ambiente. Quando a incubação estiver concluída, transfira as lâminas para uma caixa plana limpa e lave as lâminas quatro vezes com um volume mínimo de tampão de lavagem em uma plataforma agitada à temperatura ambiente.

Enxágue as lâminas uma vez em TBS e duas vezes em TN para aplicar uma solução de coloração recém-preparada nas lâminas. Primeiro, despeje a solução de coloração em um pequeno prato de pesagem de plástico. Em seguida, coloque duas lâminas juntas com as seções voltadas uma para a outra.

Mergulhe o sanduíche na solução, permitindo que a ação capilar puxe a solução. Escorra as lâminas em um lenço umedecido. Encha as lâminas com solução de coloração.

Novamente, as lâminas podem precisar ser batidas à medida que a solução flui para evitar bolhas, coloque as lâminas em uma caixa de plástico e armazene a temperatura ambiente no escuro. Os resultados representativos obtidos com diferentes sondas e tecidos de arabidopsis são mostrados aqui. O sinal roxo fornece uma visualização direta na resolução celular do padrão de expressão do gene de interesse.

O painel A mostra a localização dos transcritos do caule Meli um no ápice vegetativo do caule. Observe a presença de sinal azul roxo no indeterminado do meristema e a falta de sinal nas folhas circundantes. Os painéis B 2D são seções de embriões em estágio de torpedo de arabidopsis, onde B mostra a expressão da covata três nas poucas células-tronco embrionárias.

C mostra uma expressão de T ML um na camada epidérmica e D mostra a falta de sinal em seções sondadas com um RNA de controle negativo aleatório. As próximas imagens mostraram resultados obtidos com diferentes sondas em tecidos de labirintos. O painel E mostra a localização do nó STM Humalog no embrião do labirinto em desenvolvimento.

Observe que o forte sinal especificamente nas seções longitudinais embrionárias do caule e da raiz através do ápice da calha vegetativa mostra que ARF três A é expresso na superfície axial da folha inferior no painel F e o A T ML um homólogo OCL quatro é expresso especificamente na epiderme. No painel G.As esperado, nenhum sinal de hibridização foi observado para a sonda de controle negativo no painel H. Os resultados esperados dos diferentes pontos de verificação durante a transcrição in vitro das sondas são mostrados aqui. As sondas de hibridização in situ são verificadas em um gel ARAZ padrão após a transcrição in vitro após o tratamento com DNA e subsequente purificação da reação de transcrição in vitro Após a hidrólise de carbonato e quando prontas para uso em sondas com mais de 250 pares de bases de comprimento, como a sonda um, a hidrólise de carbonato produzirá uma variedade de fragmentos de sonda menores.

Esta figura mostra os resultados da qualificação de cores e métricas de sondas por diluições de análise de dot blot variando de 10 a menos um a 10 a menos cinco de uma sonda de controle de 100 nanogramas por microlitro e de três, sondas marcadas com DIG recém-marcadas são localizadas em uma membrana de transferência incubada com anticorpo anti DIG e ensaio. A análise sugere uma concentração estimada de 100 nanogramas por microlitro para a sonda dois, 10 nanogramas por microlitro para a sonda três e um nanograma por microlitro para a sonda quatro, indicando que é improvável que a sonda quatro produza um bom sinal de hibridização. Finalmente, essas seções longitudinais através do ápice da calha vegetativa de Mace fornecem uma comparação entre um sinal de fundo não específico e um painel de sonda que funciona bem.

A mostra um sinal de fundo não específico, enquanto o painel B mostra um sinal específico de hibridização in situ dois para a sonda OC cinco na camada celular externa. Depois de assistir a isso, você deve ter uma boa noção de como executar muitas das etapas complicadas nos protocolos de hibridização init, de modo que possa determinar os padrões precisos de expressão temporal de pressão de seus adolescentes favoritos.