Hibridização In Situ para a localização precisa de transcrições em Plantas

O objetivo geral do seguinte experimento é visualizar padrões de expressão de mRNA no nível celular com alta sensibilidade e especificidade. Isso é alcançado inicialmente submetendo cortes de tecido fixados em formalina e emblocados em parafina a uma série de soluções para remover a parafina, permeabilizar os tecidos e bloquear grupos menores com carga positiva nos tecidos, os quais podem gerar um sinal de fundo. Posteriormente, sondas de RNA marcadas com DIG, específicas para o gene de interesse, são infiltradas nos cortes de tecido e as lâminas são hibridizadas durante a noite.

Em seguida, as lâminas são tratadas com RNAses para remover a sonda ligada não especificamente das seções e então incubadas com anticorpo anti-DIG. Isso permite a visualização da sonda hibridizada por meio de uma reação química colorimétrica.

Os resultados mostram um sinal azul-escuro detectável por microscopia de luz especificamente nas células do tecido nas quais o gene de interesse é expresso. A principal vantagem desta técnica em relação a outras análises de expressão, como R-T-P-C-R, microrray ou abordagens de sequenciamento de nova geração, é que o protocolo de Hibridização in situ apresentado aqui revela o padrão de expressão de um gene de interesse no contexto do tecido. Esses métodos incluem várias etapas que são melhor aprendidas por meio de demonstrações visuais.

Vamos mostrar como seccionar e embutir tecidos, bem como os principais passos do protocolo de hibridização Al que são difíceis de dominar sozinho. O método de inclusão de tecidos fixados com paraformaldeído varia conforme o tipo de tecido a ser analisado. O ponto mais importante aqui é garantir que as amostras estejam corretamente orientadas para o seccionamento posterior.

Um método de inclusão é utilizar moldes e anéis de plástico. Para iniciar este procedimento, aqueça os moldes em uma placa de aquecimento a 60 graus Celsius e, em seguida, despeje parafina fundida nos moldes. Em seguida, use pinças aquecidas para transferir uma amostra de tecido para cada molde e posicione-a na orientação desejada.

Remova cuidadosamente o molde da placa e coloque o anel branco sobre o molde. Adicione mais mol e cera. Deixe a cera esfriar e endurecer gradualmente antes do corte em seções.

Aqueça os blocos à temperatura ambiente, depois corte cada bloco em formato trapezoidal, deixando cerca de um milímetro de parafina ao redor da amostra. Coloque o bloco aparado no micrótomo de modo que a face mais longa das duas faces paralelas fique na parte inferior. Avance cuidadosamente o bloco em direção à lâmina e certifique-se de que a superfície do bloco esteja paralela ao plano de corte da lâmina.

Com uma espessura de oito a 10 mícrons. Alinhe as fitas de cera sobre uma superfície antiaderente, como papel de alumínio, e selecione as seções de interesse sob um microscópio estereoscópico. Em seguida, marque lâminas prob bon plus com um lápis.

Não use canetas para marcar lâminas, pois as marcas serão apagadas durante o protocolo de hibridização por imunofluorescência indireta. Distribua um mililitro de água millicel Q limpa sobre cada lâmina. Flutue cuidadosamente as seções de interesse sobre a superfície da água à temperatura ambiente.

Certifique-se de que o lado brilhante esteja voltado para a água. Transfira a lâmina lentamente para um aquecedor de lâminas. Ajuste a temperatura entre 35 e 37 graus Celsius.

Essa faixa de temperatura, em contraste com os comumente usados 42 graus Celsius, evita a formação de bolhas sob as seções. Após cinco minutos, despeje cuidadosamente a água, mas em um único movimento contínuo, de modo que a fita seja baixada suavemente sobre a lâmina. Deixe as lâminas secarem por pelo menos algumas horas ou durante a noite a 37 graus Celsius para que o tecido adere e as seções de tecido fiquem prontas.

Para hibridização in situ, eles são primeiro desparafinizados e reidratados para finalização da desparafinização. Incube as lâminas em duas mudanças de solução de histic clear durante 10 minutos cada. Para reidratar as seções de tecido, passe as lâminas através de uma série de concentrações decrescentes de etanol por 30 segundos cada.

Durante o tratamento com protease, que não é mostrado neste vídeo, prepare um recipiente de vidro com solução de trietanolamina 0,1 molar e monte-o em um agitador magnético dentro de uma capela. Imediatamente antes de colocar a grade metálica para lâminas na solução, adicione 1,25 mililitros de anidrido acético à trietanolamina, tampão e suporte. Além disso, monte o sistema de fixação e o suporte para segurar a grade de lâminas.

Reduza a velocidade do agitador, prenda a grade de lâminas no suporte e abaixe a grade na solução, mantendo-a elevada acima da barra magnética. Continue agitando lentamente por 10 minutos após a lavagem em PBS e desidratação novamente por meio de uma série de etanol. As seções de tecido estão prontas para hibridização.

Coloque as lâminas sobre uma superfície limpa e deixe secar ao ar completamente por cinco a dez minutos. Prepare a mistura do tampão de hibridização da sonda adicionando a sonda desnaturada a 80 microlitros de tampão de hibridização. Para cada lâmina, misture bem por pipetagem, evitando a formação de bolhas.

Pipete o tampão de hibridização da sonda. Misture na borda direita da lâmina. Abaixe gradualmente uma lamínula sobre a lâmina, certificando-se de que a solução de hibridização cubra todas as seções sem formar bolhas.

Toque levemente a lamínula com o dedo no local onde se formam bolhas para deslocá-las de todas as seções teciduais. Não retire a lamínula, pois isso danificará as seções. Coloque as lâminas em uma câmara de umidade contendo papel Watman umedecido com água UE e parcialmente coberto com parafina.

Fechamento hermético da caixa e incubação das lâminas na temperatura desejada de hibridização, tipicamente entre 50 e 55 graus Celsius por 16 a 20 horas. Ao final do protocolo de hibridização, remova cuidadosamente as lamínulas das lâminas. A lamínula pode simplesmente cair ao colocar a lâmina na posição vertical, mas, caso contrário, não puxe a lamínula, pois isso danificará as seções.

Em vez disso, mergulhe a lâmina em SSC 0,2 vezes morno por um ou dois minutos para lavar a lamínula após a remoção das lamínulas, coloque as lâminas em uma grade e lave várias vezes em SSC 0,2 vezes a 55 graus Celsius. Após o tratamento com RNAsa, transfira as lâminas da grade para o fundo de uma caixa plástica plana e cubra com um volume mínimo de solução bloqueadora. Bloqueie as lâminas por 45 minutos à temperatura ambiente em uma plataforma agitadora lenta.

Em seguida, aplique um volume mínimo de solução de anticorpo diretamente sobre cada lâmina. Incube as lâminas no escuro por duas a três horas à temperatura ambiente. Após a conclusão da incubação, transfira as lâminas para uma caixa plana e limpa e lave-as quatro vezes com um volume mínimo de tampão de lavagem em plataforma agitadora à temperatura ambiente.

Lave as lâminas uma vez em TBS e duas vezes em tampão TN antes de aplicar a solução de coloração recém-preparada às lâminas. Primeiro, despeje a solução de coloração em um pequeno recipiente plástico para pesagem. Em seguida, posicione duas lâminas juntas, com as seções voltadas uma para a outra.

Mergulhe o lâmina-objeto no líquido, permitindo que a ação capilar puxe a solução. Drene as lâminas sobre um lenço de papel absorvente. Preencha as lâminas com a solução de coloração.

Novamente, pode ser necessário bater levemente nas lâminas enquanto a solução entra, para evitar bolhas; coloque as lâminas em uma caixa de plástico e armazene em temperatura ambiente, no escuro. Resultados representativos obtidos com diferentes sondas e tecidos de arabidopsis são mostrados aqui. O sinal roxo fornece uma visualização direta, com resolução celular, do padrão de expressão do gene de interesse.

O painel A mostra a localização dos transcritos de Meli no ápice caulinar vegetativo. Observe a presença do sinal azul arroxeado no meristema indeterminado e a ausência de sinal nas folhas circundantes. Os painéis B a 2D são seções de embriões de estágio torpedo de arabidopsis, nos quais B mostra a expressão de covata três nas poucas células-tronco embrionárias.

C mostra uma expressão de T ML um na camada epidérmica, e D mostra a ausência de sinal em seções hibridizadas com um RNA controle negativo aleatório. Essas próximas imagens mostraram resultados obtidos com diferentes sondas em tecidos de embrião de maze. O painel E mostra a localização de STM Humalog knotted um no embrião de maze em desenvolvimento.

Observe o sinal forte especificamente no meristema embrionário e em cortes longitudinais da raiz através do ápice da bainha vegetativa, que mostram que ARF três A é expresso na superfície axial inferior da folha no painel F e que o homólogo A T ML um, OCL quatro, é expresso especificamente na epiderme no painel G. Como esperado, nenhum sinal de hibridização foi observado para a sonda controle negativo no painel H. Os resultados esperados dos diferentes pontos de verificação durante a transcrição in vitro de sondas são mostrados aqui. As sondas de hibridização in situ são verificadas em um gel padrão de ARAZ após a transcrição in vitro, após o tratamento com DNAse e subsequente purificação da reação de transcrição in vitro, após hidrólise com carbonato e quando prontas para uso; para sondas com mais de 250 pares de bases de comprimento, como a sonda um, a hidrólise com carbonato produzirá uma faixa de fragmentos menores da sonda.

Esta figura mostra os resultados da qualificação colorimétrica e métrica de sondas por meio de diluições em análise de dot blot, variando de 10 elevado a menos um até 10 elevado a menos cinco de uma sonda controle de 100 nanogramas por microlitro, bem como de três novas sondas marcadas com DIG. As sondas são aplicadas em uma membrana de transferência, incubada com anticorpo anti-DIG e submetida ao ensaio. A análise sugere uma concentração estimada de 100 nanogramas por microlitro para a sonda dois, 10 nanogramas por microlitro para a sonda três e 1 nanograma por microlitro para a sonda quatro, indicando que a sonda quatro provavelmente não produzirá um bom sinal de hibridização. Por fim, essas seções longitudinais através do ápice da bainha vegetativa de Mace fornecem uma comparação entre um sinal de fundo inespecífico e um painel de sondas eficaz.

A mostra um sinal de fundo não específico, enquanto o painel B mostra um sinal específico de hibridização in situ dupla para a sonda OC cinco na camada celular externa. Após assistir a isso, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar muitas das etapas difíceis dos protocolos de hibridização iniciais, de modo que possa determinar os padrões precisos de expressão temporal e espacial dos seus genes de interesse.