Identificação de um epítopo de célula B linear Monoclonal Antibody-péptido reconhecido Digitalização-assistida

O objetivo geral deste protocolo é identificar um epítopo linear de células B reconhecido por anticorpos monoclonais usando proteínas recombinantes truncadas em série e varredura de peptídeos por hibridização dot-blot. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a interação da molécula entre o antígeno e o anticorpo. As principais vantagens desta técnica são sua simplicidade e eficiência.

O epítopo de identificação pode então ser usado em investigações mais completas, como em aplicações terapêuticas e diagnósticas. Demonstrando o procedimento estará Chien-Wen Chen, um pós-doutorado do meu laboratório. Para começar, cultive células de hibridoma monoclonal de camundongo RGM56 em um meio híbrido livre de soro.

Manter culturas de células em frascos de 175 T a 37 graus Celsius 5% de dióxido de carbono. Após cinco dias de incubação, recolher o meio de cultura depois de este ter ficado amarelo e centrifugar o sobrenadante a 4 500 vezes G durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, descarte os restos de células peletizadas para obter o anticorpo em solução.

Em seguida, adicione dois mililitros de pasta agrícola 50% de proteína G a uma coluna de cinco mililitros e equilibre a resina com 10 mililitros de PBS gelado, totalizando 10 volumes de resina pré-carregada. Carregar 200 mililitros da solução de anticorpos previamente preparada na coluna equilibrada e rejeitar a fracção que passa pela coluna. Usando 10 mililitros de PBS gelado, lave a coluna duas vezes.

Finalmente, para saquear o anticorpo da resina, adicione 10 mililitros de solução de glicerina milimolar a pH 2,7 à coluna. Colete frações de 900 microlitros em tubos de microcentrífuga previamente preenchidos com 100 microlitros de tampão de neutralização 10X. Armazene o anticorpo purificado em solução de glicerol a 50% suplementada com azida de sódio a menos 20 graus Celsius.

Prepare as construções e transforme as células E.coli BL21 conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, transfira uma única colônia para um tubo de 15 mililitros contendo três mililitros de caldo LB suplementado com 100 microgramas por mililitro de ampicilina e tampe frouxamente o tubo. Incube a cultura a 37 graus Celsius com agitação de 150 RPM.

Monitore a densidade óptica da cultura em 600 nanômetros. Quando atingir cerca de 0,6, resfrie a cultura a 25 graus Celsius. Em seguida, adicione IPTG a uma concentração final de 0,4 milimolar para induzir a expressão da proteína recombinante.

Incube a cultura por mais quatro horas a 25 graus Celsius com agitação de 200 RPM. Após a incubação, transferir um mililitro da cultura bacteriana para um tubo de microcentrífuga. Centrifugar as células a 12 000 vezes G durante um minuto e rejeitar o sobrenadante.

Pipetando para cima e para baixo com uma micropipeta, ressuspenda o pellet celular em 100 microlitros de tampão de desnaturação. E misture a suspensão resultante por vórtice vigoroso para obter uma amostra de proteína recombinante pronta para uso. Para prosseguir com a hibridização dot-blot, dissolva cada peptídeo sintético em DMSO para obter soluções de 10 miligramas por mililitro.

Em seguida, ative a membrana de PVDF em metanol por dois minutos e equilibre-a com tampão Towbin modificado por mais dois minutos. Lave um pedaço de papel de cromatografia com tampão Towbin modificado e coloque a membrana de PVDF equilibrada sobre ele. Deixe a membrana descansar até que o tampão desapareça de sua superfície.

Usando uma ponta de 10 microlitros, adicione dois microlitros de cada peptídeo ou amostra de proteína recombinante na membrana e deixe secar ao ar por 10 minutos. Identificar um símbolo na membrana é a etapa mais crítica neste protocolo. Carregar uma quantidade precisa de uma amostra em uma pequena área da membrana de PVDF requer atenção cuidadosa.

Em seguida, bloqueie a membrana em tampão TBST suplementado com 5% de leite desnatado por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação suave. Diluir o anticorpo monoclonal RGM56 em tampão TBST suplementado com 5% de leite desnatado. E adicione a solução de anticorpos à membrana.

Incube a membrana a 37 graus Celsius por uma hora com agitação suave. Após a incubação, remova a solução de anticorpos. E lave a membrana duas vezes em tampão TBST por cinco minutos com agitação suave.

Em seguida, adicione à membrana a solução do anticorpo secundário diluído em tampão TBST com 5% de leite desnatado. Incube a membrana por uma hora a 37 graus Celsius com agitação suave. Após a incubação, descarte a solução de anticorpos e lave a membrana em tampão TBST duas vezes por cinco minutos com agitação suave.

Em seguida, desenvolva a membrana com a solução de substrato em temperatura ambiente por 15 minutos no escuro. Quando o sinal aparecer, pare a reação lavando a membrana com água bidestilada duplamente. Após a secagem da membrana ao ar, capture a imagem dot-blot usando um sistema de imagem.

Finalmente, usando um software de análise de imagem, meça a intensidade de cada mancha de ponto. Apresentada aqui está a proteína de código do vírus da necrose nervosa de comprimento total, compreendendo os aminoácidos de um a 338, juntamente com suas variantes truncadas em série. Para confirmar a expressão das proteínas nas células bacterianas transformadas, foi realizada análise de dot-blot usando anticorpo anti-6XHis mostrando a presença de todas as proteínas sob investigação.

Em seguida, as proteínas recombinantes foram analisadas por hibridização dot-blot na qual foi utilizado o anticorpo monoclonal RG-M56. A análise revelou que o epítopo da proteína reconhecido pelo anticorpo é encontrado no peptídeo 195 a 338. Finalmente, um epítopo consistindo de 20 ou oito resíduos de aminoácidos foi identificado por varredura de peptídeos.

A varredura com alanina mostrou que as substituições de resíduos de valina nas posições 197 e 199, bem como uma cistina em 201, aboliram a capacidade de ligação do epítopo e a hibridização ponto-borrão. Da mesma forma, a diminuição da afinidade de ligação foi observada na análise da intensidade de ligação, confirmando que os resíduos identificados são essenciais para a ligação do epítopo ao anticorpo monoclonal RGM56. Esta técnica de identificação de peptídeos pode ser usada para desenvolver medicamentos peptídicos terapêuticos ou medicamentos peptídicos.