Name: Deteção de Heterodimerization de isoformas de proteínas usando um ensaio de ligadura de proximidade em Situ (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprenda a usar o ensaio de ligadura de proximidade in situ (PLA) para detectar heterodimerização de proteínas MST1/MST2 em células fixadas. Este método oferece alta sensibilidade para visualizar interações proteicas sem necessidade de expressão transgênica.

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Agradecemos todo laboratório Chernoff para contribuir para a otimização e validação do presente protocolo, em particular Maria Radu e Galina Semenova. Agradecemos também Andrey Efimov da célula Imaging facilidade no Fox Chase Cancer Center. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do NIH (R01 CA148805) para JC.

1. preparação de soluções
<ol><li>Preparar a solução fixador: paraformaldeído 4% (PFA) em PBS 1x. Para 10 mL, 2,5 mL de 16% de tomar PFA e adicione 7,5 mL de 1X PBS. Riscos: PFA é cancerígeno em doses baixas. Fumos e contacto com a pele são perigosos. Loja a-20 ° C.</li>
	<li>Preparar a solução de permeabilização: 0,1% Triton X-100 em 1X PBS. Para 100 mL de solução, adicione 100 µ l de Triton X-100 em 100 mL de 1X PBS. Armazenar em temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Preparar o tampão de lavagem: 1 x TBST. Para 1L, tome 100 mL de 10 x TBS, 890 mL de dH2O e 10 mL de Tween 20 (10%).</li>
	<li>Prepare a solução de bloqueio como fornecido pelo kit. Como alternativa, use 1 solução de 1X PBS contendo 2% de BSA.</li>
	<li>Prepare o diluente de anticorpo como fornecido pelo kit. Como alternativa, use a solução de PBS 1x 1 contendo 1% de BSA.</li>
</ol>2. chapeamento de células
Nota: Neste estudo, utilizamos células de Schwann humanas imortalizado (iHSC) e células embrionárias humanas rim 293 (HEK 293); no entanto, esse método pode ser usado para muitos tipos de células aderentes.
<ol><li>Cultura HEK 293 em DMEM suplementado com 10% FBS, 0,2% de glicose, 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina G e estreptomicina 100 µ g/mL em placas de cultura de tecidos tratados a 37 ° C em 5% CO2. Manter iHSC em 10% FBS/DMEM suplementado com caneta/Strep e 2 µM forskolina. Teste rotineiramente as células para o micoplasma. Realizou-se sem autenticação de linha celular.</li>
	<li>Revestir um slide 16-bem câmara com 50 µ l de 10 µ g/mL natural rato laminina ou 0,01% poli-L-lysine solução e incube por 30 min a 37 ° C em 5% CO2. Dividir células usando a 0,04% do trypsin-EDTA.</li>
	<li>Placa iHSC e HEK-293 em 100 µ l de meio da confluência de 80% (15.000-25.000 células/poço).</li>
	<li>Incube as celulas por 12-24 horas a 37 ° C em um umidificado, 5% CO2 incubadora.</li>
</ol>3. fixação e permeabilização
<ol><li>Retire o meio dos poços e lave com 100 µ l de 1X PBS. Aspire com uma micropipeta para minimizar o risco de retirar a amostra.</li>
	<li>Consertar as células pela adição de 50 µ l de 4% PFA por bem e incubar durante 10 minutos a RT, sem agitação. As células são sensíveis ao desprendimento, para evitar pipetagem de soluções diretamente sobre as células.</li>
	<li>Lavar as células com 0,05% TBST três vezes por 5 min cada. Aspire com uma micropipeta para minimizar o risco de retirar a amostra.</li>
	<li>Tratar as células com solução de permeabilização (0,1% Triton x-100 em 1X PBS) por 10 min sem agitação no RT</li>
	<li>Lavam-se células com TBST por 5 min com agitação por três vezes.</li>
</ol>4. bloqueio
<ol><li>Toque fora da TBST (muito gentilmente com uma micropipeta). Visualize o slide em um microscópio para ver se as células permanecem ligadas.</li>
	<li>Adicione uma gota (50-60 µ l) de 1 x solução de bloqueio para cada amostra.</li>
	<li>Pré-aquecer uma câmara de umidade (caixa vazia de ponta com água) a 37 ° C e a incubar na mesma para 1 h a 37 ° C.</li>
</ol>5. anticorpos
<ol><li>Diluir os anticorpos primários (1: 100) no diluente anticorpo (ver Tabela de materiais). Prepare a solução de anticorpo 40 µ l por bem.</li>
	<li>Remova a solução de bloqueio das lâminas de batendo o líquido. Não permita que as células secar.</li>
	<li>Vórtice e adicionar 40 µ l das soluções de anticorpo para cada poço.</li>
	<li>Incube 1 h a 37 ° C em uma câmara de umidade pré-aquecido.</li>
</ol>6. a proximidade da ligadura do ensaio sondas
Nota: PLA sondas são fornecidas como parte de um kit (veja a Tabela de materiais). A escolha de sondas vai depender da espécie de anticorpos primários usados para detectar as proteínas de interesse.
<ol><li>Diluir as duas sondas PLA (anti-rato subtração e adição de anti-coelho) 1:5 em diluente o anticorpo. Para cada amostra, prepare-se 40 µ l de sonda PLA. Incubar a mistura por 20 min no RT</li>
	<li>Toque fora a solução de anticorpo primário de slides. Lavar as lâminas duas vezes por 5 min cada com amortecedor da lavagem no RT</li>
	<li>Suavemente, toque do tampão de lavagem das lâminas de e adicionar a solução diluente de sonda PLA poços (40 µ l/poço).</li>
	<li>Incubar os slides em uma câmara de umidade pré-aquecido por 1h a 37 ° C.</li>
</ol>7. ligadura
Nota: A em situ deteção reagentes vermelho, Ligase e ligadura da solução são fornecidos como parte de um kit (veja a Tabela de materiais).
<ol><li>Use o em situ deteção reagentes vermelho.</li>
	<li>Imediatamente antes da utilização, vórtice e diluir os volumes necessários do 5 x estoque de ligadura 1:5 em elevado grau de pureza da água. Obs.: Não armazene reagentes diluídos.</li>
	<li>Toque fora a solução de sonda PLA de slides. Lavar as lâminas em 1x tampão de lavagem duas vezes durante 5 min cada à RT</li>
	<li>Imediatamente antes da adição de amostras, vórtice e adicionar Ligase para a solução de ligadura em 01:40 diluição e vórtice novamente.</li>
	<li>Toque fora o tampão de lavagem das lâminas de... e adicione a solução de ligadura/Ligase a cada poço (40 µ l/poço).</li>
	<li>Incubar os slides em uma câmara de umidade pré-aquecido por 30 min a 37 ° C.</li>
</ol>8. amplificação
Nota: O estoque de amplificação é fornecido como parte de um kit (veja a Tabela de materiais). Os reagentes são sensíveis à luz; assim, Evite expor os slides à luz.
<ol><li>Vórtice e diluir os volumes necessários do 5 x estoque de amplificação 1:5 em água de alta pureza e misture.</li>
	<li>Toque fora a solução de ligadura/Ligase de slides. Lavar as lâminas em 1x tampão de lavagem, duas vezes por 2 min cada no RT</li>
	<li>Vórtice e adicionar o polymerase para a solução de amplificação no 1:80 diluição e vórtice novamente.</li>
	<li>Toque do tampão de lavagem das lâminas de e adicionar a solução de amplificação/polimerase para cada poço (40 µ l/poço). Incubar os slides em uma câmara de umidade pré-aquecido para 100 min a 37 ° C.</li>
</ol>9. preparação para a imagem latente
Nota: Estas são reagentes sensíveis luz. Manter os slides, protegidos da luz.
<ol><li>Toque fora a solução de amplificação-Polymerase de slides e lavar duas vezes por 10 min cada em 1x tampão de lavagem em RT</li>
	<li>Remova as câmaras e silicone em torno dos poços de slide completamente. Raspe os bits restantes de silicone com uma navalha. Desenhar uma grade no slide separando cada um bem.</li>
	<li>Adicione ~ 40 µ l do meio de montagem com DAPI. Tenha cuidado para evitar aprisionando bolhas de ar sob a lamínula. As bordas da lamínula podem ser seladas com verniz.</li>
	<li>Aguardar pelo menos 20 min antes de executar a análise de imagem usando um microscópio confocal. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	<li>Depois da imagem latente, armazene os slides a-20 º C no escuro.</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nore1B%2FMst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na%C3%AFve+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li>
<li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOBKL1A%2FMOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li>
<li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li>
<li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1%2FMst2Heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li>
<li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20-like+protein+kinase%2C+Mst1%2C+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li>
<li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li>
<li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li>
<li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li>
<li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Achamos útil usar lâminas de câmara para esta experiência, como é muito conveniente realizar o experimento com várias linhas de célula (14-16) e não há nenhuma necessidade de mudar a amostra de cada vez durante a análise de microscopia. Algumas complicações podem surgir, tais como um aumento do risco de contaminação cruzada com os anticorpos. Portanto, sugerimos lavar cada poço individualmente em vez de usar uma jarra de Coplin, apesar da maior duração do experimento. Além disso, a remoção da inserção do silicone é um as...

Interrupção de sinalização MST1/Hippo tenha sido conectada para transtornos globais do desenvolvimento e carcinogênese1. Nos mamíferos, ativam as quinases MST1 e MST2 (fosforilar) MOB1 e LATS1/2, o último dos quais depois fosforila e inactivates ativador transcricional co Sim-associado a proteínas (YAP)2. Na sua forma ativa (unphosphorylated), YAP tem atividade oncogênica, realçando a transcrição de genes de proliferação celular; Inversamente, quando YAP é inativado por via de hipopótamo, é suprimida a proliferação celular e apoptose promovida3. Em tecidos, MST1 e MST2 existem principalmente como homodimers ativo, mas estímulos oncogênicos podem aumentar os níveis de MST1/MST2 heterodímeros, e tais heterodímeros são inativos4. No entanto, como heterodimerization MST1/MST2 é regulada continua a ser mal compreendido. Homo - e heterodímeros são mediadas através de interações entre regiões de bobina coiled do C-terminal do MST1 e MST2 conhecida como SARAH domínios5. Usando um em situ PLA demonstrado neste artigo, vamos mostrar a presença de MST1/MST2 heterodímeros nas células células de Schwann humanas (HSC) e rim embrionário humano (HEK-293). PLA tem uma vantagem sobre outros métodos de deteção de interação da proteína/proteína porque permite a detecção de interações proteína-proteína endógena, que pode ser identificado e quantificado sem a necessidade de expressão do transgene ou o uso do Tag do Resumo 6.
Sinalização de vias de transdução em grande parte são controladas pela Associação condicional de proteínas de componente. Por exemplo, estimulação da quinase de tirosina do receptor a maioria leva a sua homo ou hetero-dimerização e subsequente associação com proteínas de sinalização intracelulares adicionais, que eles mesmos formar mais complexos. O objetivo do método PLA é Visualizar a proximidade entre as proteínas nas células, desde que as proteínas são menos de 30-40 nm separados. Proximidade de proteína é geralmente detectada pelo primeiro incubar as células com anticorpos primários adequados levantados em diferentes espécies (EG., coelho e rato) contra cada proteína de interação, então a adição de anticorpos secundários espécie-específicos, sondas de DNA previamente acoplado à curta. Se as sondas de DNA estão nas proximidades, um oligonucleotide vinculação específica do DNA pode vincular simultaneamente tanto destas sondas, formando uma plataforma para a amplificação por em situ PCR ou por mecanismo de círculo de rolamento. Etiquetas fluorescentes adicionadas para a reação de amplificação permitem a visualização das proteínas de interação, que aparecem como pontos fluorescentes que podem ser facilmente quantificados e localizados em regiões específicas na célula7,8, 9 , 10.

<table><tbody><tr><td>Lâminas de câmara</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>178599</td><td>16 poços, lâmina de vidro</td></tr><tr><td>Sonda PLA Anti-Mouse Minus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td>Contém 1x Solução de bloqueio, 1x anticorpo Diluente</td></tr><tr><td>PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>Contém 1x Solução de bloqueio, 1x Anticorpo Diluente</td></tr><tr><td>Wash Buffers, Flurescence</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Contém Tampão de Lavagem A e Meio de Montagem de Tampão de Lavagem B</td></tr> com Reagentes <tr>de <td>Detecção de DUO82040</td><td></td><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92008</td><td>Contém 5x Ligadura, 1x Ligase, 5x Amlificação Vermelho, 1x Polimerase</td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (Erk1/2)</td><td>Anticorpo Sinalização Celular</td><td>9102s</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)</td><td>Cell Sinalização</td><td>5726s</td><td>anticorpo pERK anticorpo</td></tr><tr><td>MST2</td><td>Sinalização celular</td><td>3952s</td><td></td></tr><tr><td>Krs-2 (RJ-5)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-100449</td><td>Anticorpo MST1</td></tr><tr><td>16% Paraformaldeído</td><td>Ciências de microscopia eletrônica</td><td>15710</td><td>Diluir a 4% PFA em PBS para solução de fixação</td></tr><tr><td>Triton x100</td><td>BioReagentes Fisher</td><td>BP 151-500</td><td>Para preparar Triton x-100 a 0,1% em 1xPBS para solução de permeabilização</td></tr><tr><td>Microscopia confocal</td><td>Leica TCS SP8, 63x</td><td></td><td>Análise de imagem com o software ImageJ</td></tr></tbody></table>

deteção de heterodimerization de isoformas de proteínas usando um ensaio de ligadura de proximidade em situ

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Interações da proteína-proteína regulamentados são um princípio orientador para muitos eventos de sinalização, e a detecção de tais eventos é um elemento importante na compreensão de como tais caminhos são organizados e como eles funcionam. Existem muitos métodos para detectar interações da proteína-proteína nas células, mas relativamente poucos podem ser usados para detectar interações entre proteínas endógenas. Um tal método, o ensaio de ligadura de proximidade (PLA), tem várias vantagens para recomendar seu uso. Em comparação com outros métodos comuns de análise de interação da proteína-proteína, PLA tem relativamente elevada sensibilidade e especificidade, pode ser realizada com manipulação mínima da célula e, no protocolo descrito neste documento, requer apenas dois alvos anticorpos derivados de espécies diferentes (por exemplo., rato e coelho) e um reagente especializado: um conjunto de anticorpos secundários que estão covalentemente ligadas ao específico oligonucleotides que, quando trouxe em estreita proximidade um do outro, criar um ampliáveis plataforma para em situ PCR ou amplificação de círculo rolante. Nesta apresentação, mostramos como aplicar a técnica PLA para visualizar alterações na proximidade MST1 e MST2 em células fixas. A técnica descrita neste manuscrito é particularmente aplicável para a análise de estudos de sinalização celular.

Usamos o ensaio PLA para testar a interação entre MST1 e MST2 em HEK-293 e iHSC. As células foram fixadas, permeabilizadas e manchadas com vários anticorpos, seguidos de amplificação em situ de acordo com o protocolo PLA (Figura 1). Para documentar o nível de heterodimerization MST1/MST2, células estavam manchadas com anticorpos MST1 e MST2 (figura 1Ae 1C, 1G). Como um controle positivo, também usamos ER...

Aqui, nós mostramos como usar uma proximidade da ligadura do ensaio (PLA) para visualizar MST1/MST2 heterodimerization em células fixas com alta sensibilidade.

Deteção de Heterodimerization de isoformas de proteínas usando um ensaio de ligadura de proximidade em Situ

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

O in situ Proximity Ligation Assay ou PLA, é uma tecnologia capaz de detectar interações entre proteínas, tecido afixado e células. As associações entre proteínas podem ser identificadas e quantificadas sem a necessidade de expressão transgênica ou tecnologias adicionais. O único requisito é a disponibilidade de anticorpos específicos de alta eficiência que podem ser modificados com oligonucleotídeos de DNA.Nos tecidos MST1 e MST2 existem principalmente como homodimers ativos, mas estímulos oncogênicos podem aumentar o nível de heterídmeros MST1 MST2 e tais heterodimers estão inativos. Após a incubação com anticorpos específicos de primer contra as proteínas de interesse, anticorpos secundários específicos especiais, cada um ligado a uma única, curta e complementar cadeia de DNA anexada a ele, são adicionados ao slot para se ligar aos anticorpos primários. Se as proteínas em questão forem heterodimerizadas, tanto os anticorpos primários quanto os anticorpos secundários ligados a eles estarão próximos.Neste estado, os fios de DNA anexados no segundo anticorpos podem interagir através de uma adição subsequente de dois outros oligonucleotídeos de DNA formadores de círculos. Várias centenas de duplicações do círculo de DNA podem ocorrer após uma reação de amplificação e um sinal de fluorescência é gerado por sondas de oligonucleotídeos de cortesia niveladas. Portanto, cada sinal detectado é visualizado como um ponto fluorescente individual que pode ser atribuído a um local subcelular específico com base em imagens de microscópio.No dia anterior ao experimento, cubra 16 slides bem-câmaras adicionando 50 a 100 microliters de laminina de rato ou poli-L-lysina e incubar a 37 graus Celsius. Após 30 minutos remova a solução fria, divida as células usando Trypsin e placa 15.000 a 25.000 células por poço em 16 slides bem-câmara. Incubar células a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono por 24 horas.Após 24 horas, retire o meio dos poços e lave suavemente as células com PBS. Use uma micropipette para minimizar a tomada de risco da amostra e, em seguida, aspire o PBS e fixar células adicionando 50 microliters de 4%PFA por poço e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente sem agitação. Não encodou a solução diretamente nas células, pois isso pode resultar em descolamento das células.Após a fixação, lave as células com TBST três vezes por cinco minutos cada uma com leve agitação. Em seguida, permeabiliar as células e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente sem agitação. Após a conclusão da permeabilização, lave as células com TBST três vezes por cinco minutos por lavagem com agitação.Depois de remover o TBST adicione uma gota de solução de bloqueio em cada poço e incubar os slides em uma câmara de umidade pré-aquecido por uma hora a 37 graus Celsius. Diluir anticorpos primários. Remova a solução de bloqueio usando uma micropipette, mas não permita que slides sequem.Vórtice e adicione 40 microlitadores da solução de anticorpos diluídos aos poços apropriados e incubar as amostras a 37 graus Celsius em uma câmara de umidade pré-aquecido por uma hora. Durante a incubação, diluir as duas sondas PLA em diluição de anticorpos. Para cada amostra prepare 40 microliters da sonda PLA.Após uma hora de incubação, aspire a solução de anticorpos e lave duas vezes por cinco minutos com TBST em temperatura ambiente. Remova suavemente o TBST dos slides e adicione 40 microliters da solução da sonda PLA a cada poço. Incubar os slides em uma câmara de umidade pré-aquecido por uma hora a 37 graus Celsius.Vórtice e diluir os volumes necessários do estoque de ligadura 1 a 5 em água de alta pureza imediatamente antes do uso. 40 microliters da solução de ligadura são necessários para cada poço. Após a incubação, remova a solução PLA dos slides e lave-as duas vezes em TBST por cinco minutos em temperatura ambiente com agitação.Use um bloco de congelamento ao remover o ligase do congelador e pouco antes de adicioná-lo às células, vórtice e diluí-lo com a solução de ligadura. Remova o TBST dos slides e adicione 40 microliters da solução ligase de ligadura a cada poço. Incubar lâminas em uma câmara de umidade pré-aquecido por 30 minutos a 37 graus Celsius.Após a incubação aspire a solução e lave duas vezes com TBST por cinco minutos em temperatura ambiente com agitação. Evite expor o poço à luz brilhante, pois os reagentes são sensíveis à luz. Durante a última lavagem, o vórtice e diluir os volumes necessários da solução de amplificação em água de alta pureza imediatamente antes do uso.Mantenha a polimerase no gelo ou em um bloco de resfriamento e pouco antes de adicioná-la ao vórtice das células e diluir com a solução de amplificação. Aspire o TBST dos poços e adicione 40 microliters de solução de amplificação a cada poço. Incubar lâminas em uma câmara de umidade pré-aquecido escuro por 100 minutos a 37 graus Celsius.Após a incubação, aspire a solução de polimerase de amplificação a partir dos slides e lave duas vezes dez minutos cada em TBST à temperatura ambiente. Remova as câmaras e o silicone ao redor dos poços do escorregador completamente. Raspe as contas restantes de silicone com uma navalha.Desenhe uma grade no slide separando cada poço. Adicione aproximadamente 40 microliters do meio de montagem com DAPI, garantindo que nenhuma bolha de ar fique presa sob o deslizamento da tampa. Use esmalte para fixar vidro de cobertura.A análise microscópica pode ser realizada em 20 minutos após a fixação, mas na prática achamos mais conveniente realizar a análise de imagem no dia seguinte. Para analisar as amostras, usamos um microscópio de varredura a laser Leica SP8. Aqui são mostrados exemplos de ensaio de ligadura de proximidade in situ visualizando proximidade entre proteínas MST 1 e MST2 em células renais embrionárias humanas em painéis de A a D, e células de Schwann humanos nos painéis E através de H.In todos os núcleos celulares de painéis são manchados de azul por DAPI e pontos vermelhos indicam sinais positivos de proximidade de ligas de proximidade resultantes da proximidade entre as proteínas indicadas.O painel A mostra proximidade de MST1 e MST2 e painel B mostra proximidade de ERK e fosfoERK, pois esses epítopos estão na mesma proteína. O painel C representa um controle negativo, pois essas células como MST1 e MST2 e Painel D representam um segundo controle negativo manchado com anticorpos para MST1 e ERK que não se espera estar próximos um do outro. Os painéis E e F mostram proximidade de MST1 com MST2 e ERK com fosfoERK em células Schwann.Painel G e H são controles negativos manchados apenas com anticorpos MST1 ou com anticorpos MST1 e ERK. É imperativo usar anticorpos primários não reativos que devem reconhecer apenas um membro do heterodimer. Também é importante lembrar de usar diferentes pontas para evitar a contaminação cruzada de anticorpos primários e sondas PLA, para evitar tocar na parte inferior do poço, e evitar a tubulação diretamente em amostras.Depois de assistir a este vídeo você deve ter uma boa compreensão de como usar in situ PLA para estudar dimerização de proteínas em células fixas.

detection-heterodimerization-protein-isoforms-using-an-situ-proximity

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aqui nós mostramos como usar Assay Proximidade Ligadura (PLA), com uma combinação de anticorpos para visualizar proteínas morfogenéticas ósseas (BMP) de sinalização em células fixas. Esta técnica permitiu-nos a seguir o acúmulo nuclear de BMP activada endógena efetoras complexos e quantificar os seus níveis ao longo do tempo sob BMP4 estimulação.

Detecção de Sinalização de Efeitos Complexos Downstream de BMP4 Usando In situ PLA, um Ensaio Ligadura Proximidade

Este vídeo descreve o ensaio de ligação de proximidade para estudar as interações proteína-proteína in situ em células de nematóides. A proximidade das proteínas de interesse gera o molde circular de DNA com a ajuda de uma sonda PLA ligada a um anticorpo secundário. A sonda é ainda amplificada usando a solução de amplificação, que produz um DNA longo de fita simples seguido pela hibridização da sonda detectora, permitindo a localização de interações proteína-proteína nas células.

Ensaio de ligação de proximidade para estudar interações proteína-proteína in situ

Este protocolo demonstra como Ensaio de Proximidade A ligadura pode ser utilizada para detectar em interacções proteína-proteína in situ na junção neuromuscular, de larvas de Drosophila. Com esta técnica, os discos grande e Hu-li Shao tai são apresentados para formar um complexo na região pós-sináptica, uma associação previamente identificado por meio de co-imunoprecipitação.

Detecção de In Situ Complexos proteína-proteína no Drosophila Larval Junção Neuromuscular Usando Proximity Ligation Assay

Aqui, descrevemos um procedimento para visualizar e quantificar com alta sensibilidade as interações endógenos entre o retículo endoplasmático e mitocôndrias nas células fixas. O protocolo apresenta um otimizado no ensaio de ligação de proximidade situ visando o inositol 1,4,5-trifosfato de receptor / proteína regulada por glucose 75 / complexo D canal de ânions / ciclofilina dependente da tensão na interface membrana associada à mitocôndria.

Estudo do retículo endoplasmático e mitocôndrias Interações por<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidade Ligadura Ensaio em células fixas

As interações proteína-proteína podem ocorrer tanto no núcleo quanto no citoplasma de uma célula. Para investigar essas interações, a co-imunoprecipitação tradicional e o ensaio moderno de ligação de proximidade são aplicados. Neste estudo, comparamos esses dois métodos para visualizar a distribuição das interações NF90-RBM3 no núcleo e no citoplasma.

Visualização de interação proteína-proteína em Citoplasmáticas frações nucleares e por co-imunoprecipitação e<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidade Ligadura Assay

Aqui, é demonstrado como o Ensaio de Ligação à Proximidade in situ (PLA) pode ser usado para detectar e visualizar as interações proteínas-proteínas diretas entre ATM e p53 em culturas de células suspensas expostas ao estresse genotóxico.

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

Aqui nós apresentamos um protocolo para monitorar a montagem e desmontagem da toxina antraz usando interferometria biolayer (BLI). Na sequência de montagem/desmontagem na superfície biosensor, os grandes complexos de proteínas são liberados da superfície para visualização e identificação dos componentes dos complexos usando microscopia eletrônica e espectrometria de massa, respectivamente.

Analisando a dinâmica da proteína montada sobre e libertado da interferometria Biolayer Biosensor usando espectrometria de massa e de microscopia eletrônica

Este protocolo descreve uma abordagem livre de calibração para quantificação da proteína homo-oligomerização em vitro baseado em espectroscopia de fluorescência flutuação utilizando microscopia de luz comercial. As configurações corretas de aquisição e métodos de análise são mostrados.

Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho

As proteínas do domínio J de cognato cooperam com a Chaperona HSP70 para auxiliar em uma infinidade de processos biológicos que vão desde a dobradura de proteínas até a degradação. Aqui, nós descrevemos um ensaio in situ da ligadura da proximidade, que permita a monitoração destas machineries transientemente formadas do acompanhante em bactérias, em fermento e em pilhas humanas.

Monitoração in situ de montagens moleculars formadas Transientemente do chaperone nas bactérias, no fermento, e nas pilhas humanas

Este protocolo demonstra o uso do ensaio de ligadura de proximidade para sondar interações proteína-proteína in situ na germinação C. elegans.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline usando Ensaio de Ligação de Proximidade

Os ensaios de captura de loop D (DLC) e extensão de loop D (DLE) utilizam o princípio da ligadura de proximidade juntamente com a PCR quantitativa para quantificar a formação de D-loop, a extensão de D-loop e a formação de produtos no local de uma ruptura induzível de fita dupla em Saccharomyces cerevisiae.

Detecção de Intermediários de Recombinação Homóloga via Ligadura de Proximidade e PCR Quantitativa em Saccharomyces cerevisiae

Aprenda a usar o ensaio de ligadura de proximidade in situ (PLA) para detectar heterodimerização de proteínas MST1/MST2 em células fixadas. Este método oferece alta sensibilidade para visualizar interações proteicas sem necessidade de expressão transgênica.

Deteção de Heterodimerization de isoformas de proteínas usando um ensaio de ligadura de proximidade em Situ

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