Geração de imunoprecipitação da cromatina nativa sequenciamento de bibliotecas para análise da densidade nucleossoma

O objetivo geral deste procedimento é gerar bibliotecas de sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina nativa para análise de densidade de nucleossomos. Este método pode responder a perguntas em epigenética, como revelar características epigenômicas em uma população de células em um único nível de nucleossomo e resolver assinaturas heterogêneas de cromatina em seus elementos contínuos. A principal vantagem desta técnica é utilizar a propriedade MNase de acesso preferencial à região aberta da cromatina para gerar uma medição que combine a acessibilidade da MNase com a modificação de histonas.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque não são capazes de obter a digestão ideal da MNase. Comece este protocolo com a preparação da célula, conforme descrito no protocolo de texto. No primeiro dia, descongele cada pellet celular em banho-maria a 37 graus Celsius por 10 segundos.

Em seguida, transfira as células para o gelo. A cada pellet celular, adicione imediatamente um tampão de lise de um X gelado mais um PIC de um X a uma concentração final de 10.000 células por 20 microlitros. Misture 10 vezes pipetando para cima e para baixo sem criar bolhas.

Trabalhando no gelo, alíquota de 20 microlitros por poço dos lisados resultantes em uma placa de 96 poços. Cubra a placa com o selo de plástico antes de incubar no gelo por 20 minutos. Rotule a placa como MNase e registre os poços em uma chave de modelo.

Pouco antes da lise de 20 minutos estar completa, diluir a enzima MNase um com tampão de diluição MNase um até uma concentração final de 20 unidades por microlitro e mantê-la no gelo. Trabalhando no gelo, prepare a mistura mestre de digestão MNase one conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, alíquota de 20 microlitros da mistura principal para cada linha de amostras, mais cinco microlitros de volume extra em uma placa reservatório de 96 poços.

Depois que os lisados terminarem de incubar, remova a placa de digestão MNase do gelo. Usando uma pipeta multicanal, adicione 20 microlitros de MNnase one digestion master mix em cada linha de amostras e misture pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Mude as pontas entre as linhas.

Em seguida, incube a placa em temperatura ambiente por exatamente cinco minutos. Para interromper a reação após cinco minutos, use uma pipeta multicanal para adicionar seis microlitros de EDTA 250 micromolar em cada linha de amostras e misture para cima e para baixo algumas vezes. Certifique-se de mudar as dicas entre as linhas.

Após a adição de EDTA, mude a configuração da pipeta para 20 microlitros e misture 10 vezes como antes para garantir a parada completa da reação de digestão. Finalmente, adicione seis microlitros de tampão de lise 10X a cada linha das amostras digeridas por MNase e misture bem pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Cubra o prato com um selo de plástico e incube no gelo por 15 minutos.

Preparar a placa complexa do cordão de anticorpos e a placa de pré-limpeza conforme descrito no protocolo de texto. Gire rapidamente ambas as placas centrifugando por 10 segundos a 200 vezes G. Em seguida, coloque a placa complexa de esferas de anticorpos em um ímã de placa e aguarde 15 segundos para que a solução fique clara. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta sem perturbar as contas.

Em seguida, remova a placa do ímã da placa e mantenha-a no gelo. Coloque a placa de reação de pré-limpeza em um ímã de placa e aguarde 15 segundos para que as esferas se separem e a solução fique clara. Sem perturbar os grânulos, use uma pipeta para transferir cuidadosamente o sobrenadante para os poços correspondentes da placa de complexo de grânulos de anticorpos mantida em gelo.

Misture cada poço delicadamente, pipetando para cima e para baixo 15 vezes. Sele bem a placa com uma tampa de placa de alumínio e incube durante a noite a quatro graus Celsius em uma plataforma rotativa. Após a incubação, rotule novamente a reação IP da placa.

No segundo dia, ajuste o misturador de aquecimento para 65 graus Celsius e, em seguida, prepare um tampão de lavagem com baixo teor de sal e um tampão de lavagem com alto teor de sal no gelo. Gire rapidamente a placa de reação IP por 10 segundos a 200 vezes G.Coloque a placa de reação IP em um ímã de placa e aguarde 15 segundos para que a solução fique clara. Usando uma pipeta multicanal, sem perturbar as contas, remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante.

Retire a placa do ímã da placa e coloque-a no gelo. Para cada linha de amostras na placa de reação IP, adicione 150 microlitros de tampão de lavagem com baixo teor de sal gelado e misture lentamente para cima e para baixo por 10 vezes para ressuspender totalmente as contas. Coloque a placa de reação IP de volta no ímã da placa e remova o sobrenadante como antes.

Em seguida, coloque o prato de volta no gelo e repita as etapas de lavagem para um total de duas lavagens. Trabalhando no gelo, adicione 150 microlitros do tampão de lavagem com alto teor de sal a cada linha de amostras na placa de reação IP. Misture as amostras lentamente pipetando para cima e para baixo 10 vezes para ressuspender totalmente as contas.

Depois de remover o sobrenadante como antes, coloque a placa de reação IP no gelo e coloque uma nova placa de 96 poços ao lado dela. Para cada linha de amostras na placa de reação IP, adicione 150 microlitros do tampão de lavagem com alto teor de sal e misture lentamente 10 vezes pipetando para cima e para baixo para ressuspender totalmente os grânulos. Após a ressuspensão, transfira cada linha de amostras para a linha correspondente da nova placa pré-resfriada de 96 poços.

Descarte o prato antigo. Coloque a nova placa de reação IP no ímã da placa e descarte o sobrenadante como antes. Mantenha o prato em temperatura ambiente.

Para cada linha de amostras na placa de reação IP, adicione 30 microlitros do tampão de eluição ChIP e misture lentamente pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Tome cuidado para evitar a formação de bolhas. Sele a placa com uma tampa de PCR e incube em um misturador de aquecimento a 65 graus Celsius por 1 1/2 horas com uma velocidade de mistura de 1.350 RPM.

Após uma incubação de 1 hora e meia, gire a placa de reação IP a 200 vezes G por um minuto a quatro graus Celsius. Em seguida, coloque a placa de reação IP em um ímã de placa e espere que a solução desapareça. Usando uma pipeta multicanal, sem perturbar os grânulos, transfira cuidadosamente 20 microlitros do sobrenadante para uma nova placa de 96 poços usando pontas novas para cada linha.

Rotule a placa IP Reaction e mantenha-a em temperatura ambiente. Prossiga para a digestão de proteínas seguida pela construção da biblioteca conforme descrito no protocolo de texto. Aqui são mostrados os resultados representativos da cromatina digerida por MNase ótima, subdigerida e superdigerida antes da geração da biblioteca.

O perfil idealmente digerido é dominado por tamanhos de fragmentos de nucleossomos únicos, embora não seja digerido em excesso para permitir a recuperação de fragmentos de nucleossomos de ordem superior. A digestão subótima da cromatina também será aparente no perfil da biblioteca de sequenciamento gerada a partir do material IP. Para validar as bibliotecas por qPCR, o enriquecimento de dobras das bibliotecas IP em relação à biblioteca de entrada foi avaliado para alvos positivos e negativos.

Além disso, a inspeção das leituras alinhadas de bibliotecas com alto enriquecimento de dobras avaliado por qPCR em um navegador de genoma deve revelar enriquecimentos visualmente detectáveis em comparação com a biblioteca de entrada. As bibliotecas de sequenciamento ChIP de densidade de nucleossomos bem-sucedidas conterão réplicas altamente correlacionadas com uma porção significativa de leituras alinhadas dentro de picos enriquecidos identificados por MACS2. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias se for executada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar bibliotecas de sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina nativa para análise de densidade de nucleossomos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de certificar-se de que a cromatina seja digerida de maneira ideal e usar apenas anticorpos que mostrem alta afinidade com o epítopo de interesse e mostrem pouca ou nenhuma reatividade cruzada com outros epítopos. Seguindo este procedimento, a modelagem computacional da acessibilidade da MNase pode ser realizada para responder a perguntas como assinaturas epigenéticas devido à heterogeneidade dentro de uma população de células.

Este método fornece informações sobre o efeito combinatório da posição do nucleossomo e densidade local, bem como a modificação pós-tradução de suas subunidades de histonas e pode ser aplicado a qualquer sistema, como humano ou camundongo, células primárias e tecidos congelados.