Geração de imunoprecipitação da cromatina nativa sequenciamento de bibliotecas para análise da densidade nucleossoma

O objetivo geral deste procedimento é gerar bibliotecas de sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina nativa para análise da densidade de nucleossomos. Este método pode responder perguntas em epigenética, como revelar características epigenômicas em uma população celular em nível de nucleossomo individual e resolver assinaturas de cromatina heterogêneas em seus elementos contínuos. A principal vantagem desta técnica é aproveitar a propriedade da MNase de acesso preferencial a regiões de cromatina aberta para gerar uma medida que combina a acessibilidade da MNase com a modificação de histonas.

Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque não conseguem obter uma digestão ideal com MNase. Inicie este protocolo com o preparo das células conforme descrito no protocolo textual. No primeiro dia, descongele cada pellet celular em banho-maria a 37 graus Celsius por 10 segundos.

Em seguida, transfira as células para gelo. A cada pellet celular, adicione imediatamente um tampão de lise gelado na concentração um-X mais um-X PIC, para uma concentração final de 10.000 células por 20 microlitros. Misture 10 vezes pipetando para cima e para baixo, sem formar bolhas.

Trabalhando no gelo, alíquotas de 20 microlitros por poço dos lisados resultantes em uma placa de 96 poços. Cubra a placa com o selo plástico antes de incubar no gelo por 20 minutos. Rotule a placa como MNase e registre os poços em uma chave de modelo.

Logo antes de o lise de 20 minutos ser concluída, dilua a enzima MNase um com o tampão de diluição da MNase um até uma concentração final de 20 unidades por microlitro e mantenha-a em gelo. Trabalhando em gelo, prepare a mistura mestra de digestão da MNase um conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, distribua alíquotas de 20 microlitros da mistura mestra para cada linha de amostras, mais cinco microlitros de volume extra em uma placa de reservatório de 96 poços.

Após a conclusão da incubação dos lisados, retire a placa de digestão com MNase do gelo. Usando uma pipeta multicanal, adicione 20 microlitros da mistura mestra de digestão MNase a cada linha de amostras e homogeneíze pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Troque as ponteiras entre as linhas.

Em seguida, incube a placa à temperatura ambiente por exatamente cinco minutos. Para interromper a reação após cinco minutos, utilize uma pipeta multicanal para adicionar seis microlitros de EDTA 250-micromolar em cada linha de amostras e misture para cima e para baixo algumas vezes. Certifique-se de trocar as ponteiras entre as linhas.

Após a adição de EDTA, ajuste a pipeta para 20 microlitros e misture 10 vezes como antes para garantir a interrupção completa da reação de digestão. Por fim, adicione seis microlitros de tampão de lise 10X a cada linha das amostras digeridas com MNase e misture bem pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Cubra a placa com um selo de plástico e incube em gelo por 15 minutos.

Prepare a placa do complexo de anticorpo-acrílico e a placa de pré-limpeza conforme descrito no protocolo textual. Gire rapidamente ambas as placas por centrifugação durante 10 segundos a 200 vezes G. Em seguida, coloque a placa do complexo de anticorpo-acrílico sobre um ímã de placa e aguarde 15 segundos até que a solução fique límpida. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta, sem perturbar os acrílicos.

Em seguida, remova a placa do ímã para placas e mantenha-a em gelo. Coloque a placa da reação de pré-limpeza sobre o ímã para placas e aguarde 15 segundos para que as microesferas se separem e a solução fique límpida. Sem perturbar as microesferas, use uma pipeta para transferir cuidadosamente o sobrenadante para os poços correspondentes da placa de complexo de microesferas com anticorpo mantida em gelo.

Agite suavemente cada poço pipetando para cima e para baixo 15 vezes. Sobreponha uma tampa de alumínio sobre a placa e incube durante a noite a quatro graus Celsius em uma plataforma rotatória. Após a incubação, rotule novamente a placa como Reação de IP.

No segundo dia, ajuste o agitador aquecido a 65 graus Celsius e prepare um tampão de lavagem com baixa concentração de sal e um tampão de lavagem com alta concentração de sal em gelo. Centrifugue rapidamente a placa da reação de IP por 10 segundos a 200 vezes G. Coloque a placa da reação de IP em um ímã para placa e aguarde 15 segundos até a solução ficar límpida. Usando uma pipeta multicanal, sem perturbar as microesferas, remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante.

Retire a placa do ímã e coloque-a sobre gelo. Adicione a cada linha de amostras na placa de reação de IP 150 microlitros de tampão de lavagem com baixa concentração de sal, previamente resfriado, e misture lentamente para cima e para baixo 10 vezes para ressuspender completamente as microesferas. Coloque novamente a placa de reação de IP sobre o ímã e remova o sobrenadante como antes.

Em seguida, coloque a placa novamente sobre gelo e repita os passos de lavagem por um total de duas lavagens. Trabalhando no gelo, adicione 150 microlitros do tampão de lavagem com alta salinidade a cada linha de amostras na placa da reação de IP. Misture as amostras lentamente pipetando para cima e para baixo 10 vezes para ressuspender completamente as microesferas.

Após remover o sobrenadante como antes, coloque a placa de reação de IP sobre gelo e pré-resfrie uma nova placa de 96 poços ao lado dela. Para cada linha de amostras na placa de reação de IP, adicione 150 microlitros do tampão de lavagem de alta salinidade e misture lentamente 10 vezes, pipetando para cima e para baixo, para ressuspender completamente as microesferas. Após a ressuspensão, transfira cada linha de amostras para a linha correspondente da nova placa de 96 poços, previamente resfriada.

Descarte a placa antiga. Coloque a nova placa de reação de IP no ímã de placa e descarte o sobrenadante como antes. Mantenha a placa à temperatura ambiente.

Para cada linha de amostras na placa de reação de IP, adicione 30 microlitros do tampão de eluição ChIP e misture lentamente pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Tenha cuidado para evitar a formação de bolhas. Selle a placa com uma tampa de PCR e incube em um misturador aquecido a 65 graus Celsius por 1 hora e meia com uma velocidade de agitação de 1.350 RPM.

Após uma incubação de 1 hora e 30 minutos, centrifugue a placa da reação de IP a 200 × g durante um minuto a quatro graus Celsius. Em seguida, coloque a placa da reação de IP sobre um ímã de placa e aguarde até que a solução fique límpida. Usando uma pipeta multicanal, sem perturbar as microesferas, transfira cuidadosamente 20 microlitros do sobrenadante para uma nova placa de 96 poços, utilizando ponteiras novas para cada linha.

Rotule a placa como Reação IP e mantenha-a em temperatura ambiente. Prossiga para a digestão proteica seguida pela construção da biblioteca conforme descrito no protocolo textual. São apresentados aqui resultados representativos de cromatina digerida com MNase ideal, subdigerida e superdigerida antes da geração da biblioteca.

O perfil com digestão ideal é dominado por fragmentos de tamanho único de nucleossomos, sem estar superdigesto, permitindo a recuperação de fragmentos de nucleossomos de ordem superior. A digestão subótima da cromatina também será evidente no perfil da biblioteca de sequenciamento gerada a partir do material de IP. Para validar as bibliotecas por qPCR, foi avaliado o enriquecimento relativo das bibliotecas de IP em relação à biblioteca de entrada para alvos positivos e negativos.

Além disso, a inspeção visual dos reads alinhados de bibliotecas com alto enriquecimento em dobra avaliado por qPCR em um navegador genômico deve revelar enriquecimentos detectáveis visualmente em comparação com a biblioteca de entrada. Bibliotecas bem-sucedidas de sequenciamento ChIP para densidade de nucleossomos conterão réplicas altamente correlacionadas com uma porção significativa de reads alinhados dentro dos picos enriquecidos identificados pelo MACS2. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em dois dias, se executada corretamente.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar bibliotecas de imunoprecipitação de cromatina nativa para sequenciamento, destinadas à análise da densidade de nucleossomos. Ao tentar executar este procedimento, é importante lembrar-se de garantir que a cromatina seja digerida de forma ideal e utilizar apenas anticorpos que apresentem alta afinidade com o epítopo de interesse e pouca ou nenhuma reatividade cruzada com outros epítopos. Após este procedimento, pode-se realizar modelagem computacional da acessibilidade da MNase para responder perguntas como assinaturas epigenéticas decorrentes da heterogeneidade dentro de uma população celular.

Este método fornece uma visão sobre o efeito combinatório da posição do nucleossomo e da densidade local, bem como da modificação pós-traducional de suas subunidades histônicas, e pode ser aplicado a quaisquer sistemas, como humanos ou camundongos, células primárias e tecidos congelados.