Name: Geração de imunoprecipitação da cromatina nativa sequenciamento de bibliotecas para análise da densidade nucleossoma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprenda a gerar bibliotecas de ChIP-seq nativo para análise de densidade de nucleossomos usando MNase e modificações de histonas. Este método revela características epigenéticas ao nível de nucleossomo único.

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A.L. foi apoiado por uma bolsa de estudos de pós-graduação canadense dos institutos canadenses de pesquisa em saúde. Este trabalho foi apoiado por concessões do genoma British Columbia e o canadense institutos de pesquisa em saúde (CIHR-120589) como parte da epigenética canadense, ambiente e iniciativa de consórcio de pesquisa de saúde e pelo programa de Instituto de pesquisa de Terry Fox Projeto Grant #TFF-122869 M.H. e Instituto de pesquisa do Terry Fox novo investigador prêmio (Grant # 1039) para M.H.

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Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Dada a natureza combinatória de modificação da cromatina e nucleossoma posicionamento no Regulamento transcriptional, um método que permite medições simultâneas desses recursos é susceptível de fornecer novos insights sobre regulamento epigenético. O ndChIP-seq apresentado aqui é um protocolo de ChIP-seq nativo otimizado para habilitar o interrogatório simultâneo das modificações de histona e densidade nucleossoma em raras células primárias9,10. ndChIP-seq utiliza digestão enzimática da cromatina que, quando acoplado ao sequenciamento maciçamente paralelo emparelhado-final e um modelo de distribuição gaussiana mistura, permite para as modificações do histone de investigação a nível único nucleossoma e o deconvolução de perfis epigenomic impulsionada pela heterogeneidade dentro de uma população. Usando este protocolo, anteriormente informamos uma única distribuição de tamanhos de fragmento imuno-precipitado, determinado pelo emparelhado-fim ler limites, associados com Estados de cromatina específico definidos pelo ChromHMM10,24.
A qualidade de uma biblioteca ndChIP-seq depende de vários fatores, tais como a especificidade do anticorpo e sensibilidade, condições ideais de digestão de MNase e qualidade da cromatina. A especificidade dos anticorpos usados é crucial na produção de biblioteca ndChIP-seq bem sucedida. Um anticorpo ideal mostra afinidade elevada contra o epítopo de interesse com pouca reactividade cruzada com os outros resumos. É igualmente importante escolher grânulos magnéticos com a mais alta afinidade para o anticorpo de escolha.
MNase digestão é uma reação crítica e tempo de concentração-sensível - e neste protocolo. Portanto, ao processar várias amostras, é importante que cada reação é incubada por uma quantidade equivalente de tempo (Veja o passo 2.2). A qualidade da cromatina é outro fator que afeta significativamente o resultado da ndChIP-Seq fragmentado cromatina leva um perfil de digestão MNase sub-ótimo e resultados nas bibliotecas com um baixo sinal à relação de ruído. Amostras primárias com baixa viabilidade celular ou degradados da cromatina, tais como tecido de (FFPE) parafina fixada em formol não são recomendados para este protocolo.
A adição de um PIC durante a extração de cromatina reduz indesejada (ou seja, aleatórios) cromatina fragmentação e preserva integridade de caudas de histona. Como tal, precisa ter ser adicionado a Lise e amortecedor da imunoprecipitação antes de usar. Enquanto selecionando células através da citometria de fluxo, selecione para células viáveis e certifique-se de células são classificadas em uma baixa taxa de fluxo para aumentar a precisão da estimativa de número de célula e a viabilidade das células. Evite a classificação de células diretamente em Lise. O buffer de bainha diluirá a Lise e impede a efetiva permeabilização da membrana celular para MNase. Dependendo de um tipo de células ou organismo, titulação de MNase pode ser necessária para obter a melhor digestão.
ndChIP-seq em células de mamíferos requer uma profundidade mínima de sequenciamento de 50 milhões emparelhado-leituras (fragmentos de 25 milhões) para marcas estreitas e 100 milhões emparelhado-leituras (fragmentos de 50 milhões) para entrada e grandes marcas. O algoritmo de distribuição gaussiana mistura não executará otimamente em bibliotecas que têm sido sequenciadas a uma profundidade significativamente abaixo esta recomendação. ndChIP-seq não classificará os promotores com pouca separação entre o valor de distribuição ponderada para comprimentos de fragmento de mono - e di-nucleossoma em mono - ou di-nucleossoma dominado promotores. Portanto, esses promotores devem ser removidos na análise subsequente. Réplicas biológicas podem ser geradas para aumentar a confiança nas distribuições previstas e identificar a variabilidade técnica na construção MNase digestão e biblioteca.
Ao contrário de iterações anteriores dos protocolos de ChIP-seq nativos, ndChIP-seq fornece os meios para investigar o efeito combinatório de modificação de estrutura e histonas cromatina utilizando imunoprecipitação de post de tamanho de fragmento para integrar a densidade nucleossoma, determinado pela acessibilidade de MNase, com medidas de modificação de histona. Aplicação de ndChIP-seq de células primárias e tecidos fornecerá novos insights sobre a natureza Integrativa do Regulamento epigenética e permitir a identificação de assinaturas epigenéticas devido à heterogeneidade da população.

O genoma eucariótico é empacotado em cromatina através de repetir estruturas nucleossoma que consistem em duas cópias de quatro proteínas histonas (por exemplo, H2A, H2B, H3 e H4) circunscritas por 146 pares de bases de DNA1,2. Complexos de remodelação de cromatina controlam nucleossoma posição dentro dos limites de promotor do gene e participarem na regulação da expressão gênica, alterando a acessibilidade do DNA para fatores de transcrição e o RNA polimerase máquinas3, 4.
Aminoácidas terminais caudas das histonas dentro nucleossoma são submetidas a várias modificações covalentes, incluindo acetilação, metilação, fosforilação, ubiquitylation, sumoylation, formilação e hidroxilação dos aminoácidos específicos5 , 6 , 7 , 8. posições e graus destas modificações ditam um estado de cromatina que influenciam a cromatina estrutura e controle de acesso dos complexos moleculares que permitem a ativação da transcrição7. Dado que ambos modificação de densidade e histona nucleossoma desempenham um papel no controle local da transcrição do gene, desenvolvemos uma abordagem de ChIP nativa que permite a medição simultânea de densidade nucleossoma e histona modificação9, 10.
ChIP-seq nativo aproveita a nuclease micrococci de endonuclease (MNase) para digerir a cromatina intacta em seu estado nativo dentro do núcleo11,12, uma propriedade que tem sido aproveitada para mapear nucleossoma posicionamento13 , 14 , 15. densidade nucleossoma ChIP-seq (ndChIP-seq) aproveita-se da propriedade de acesso preferencial de MNase para abrir regiões da cromatina para gerar medições que combinam MNase acessibilidade com histona modificação10. ndChIP-seq é adequado para a caracterização das modificações do histone em culturas de células, tecidos e raras células primárias. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que permite a geração de conjuntos de dados sequência apropriadas para um quadro analítico descrito anteriormente trabalho10 que integra o fragmento tamanho post imunoprecipitação, determinada pelo emparelhado-ler os limites, a fim ao mesmo tempo investiga MNase acessibilidade com medições de modificação de histona. Anteriormente, a aplicação do presente protocolo para 10.000 sangue de cordão umbilical humano primário derivado CD34+ células e células estaminais embrionárias humanas revelou únicas relações entre modificações de estrutura e histonas cromatina dentro destes tipos10 de célula . Dada a sua capacidade de medir simultaneamente acessibilidade nucleossoma e modificação de histona, ndChIP-seq é capaz de revelar características de epigenomic em uma população de células em um nível único nucleossoma e resolvendo assinaturas heterogêneas em sua elementos constitutivos. Um exemplo da exploração das populações celulares heterogêneas por ndChIP-seq é investigação de promotores bivalentes, onde tanto H3K4me3, uma marca ativa e H3K27me3, uma marca de repressiva, são presentes10.

<table><tbody><tr><td>1M Tris-HCl - pH 7.5</td><td>Thermo Scientific</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-HCl - pH 8</td><td>Thermo Scientific</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td>Sigma</td><td>1001385276</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>1001412354</td><td></td></tr><tr><td>Sódio-Desoxicolato</td><td>Sigma</td><td>1001437582</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Thermo Scientific</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NA placa de 96 poços com fundo em V (AB 1400)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1400-L</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P2 pipetman</td><td>Mandel</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P10 pipetman</td><td>Mandel</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P20 pipetman</td><td>Mandel</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetista Gilson P100</td><td>Mandel</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>Pipetador Gilson P200</td><td>Mandel</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman Gilson P1000</td><td>Mandel</td><td>F123603</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Microcócica&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0247S</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Mixer C (Misturador de bloco de aquecimento)</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Multi 12 canais Pippet P20</td><td>Rainin</td><td>17013803</td><td></td></tr><tr><td>Multi 12 canais Pippet P200</td><td>Rainin</td><td>17013805</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubo LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Tubo LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431005</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de Placa de Plástico</td><td>Edge Bio</td><td>48461</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de PCR</td><td>Bio Rad</td><td>MSD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de Placa de Alumínio</td><td>Bio Rad</td><td>MSF-1001</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de eluição (tampão EB)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>1M DTT</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R centrífuga&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22625004</td><td></td></tr><tr><td>Água ultrapura</td><td>Thermo Scientific</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Protein G dynabeads</td><td>Thermo Scientific</td><td>10001D</td><td></td></tr><tr><td>Protein A dynabeads</td><td>Thermo Scientific</td><td>10001D</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de protease Coquetel</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma rotativa</td><td>Mandel</td><td>1b109-12052010</td><td></td></tr><tr><td>Ímã de placa</td><td>Alpaqua</td><td>2523</td><td></td></tr><tr><td>Tira abobadada de 12 tampas</td><td>Bio Rad</td><td>TCS1201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer G2</td><td>Qiagen</td><td>1014636</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Qiagen</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>Ímã de tubo (DynaMag-2)</td>Ímã de tubo <td>Thermo Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>(DynaMag-2)</td><td>LabCore</td><td>730-006</td><td></td></tr><tr><td>Reservatório de plástico em forma de V</td><td>Mandel</td><td>S0100A</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice</td><td>Mandel</td><td>C1801</td><td></td></tr><tr><td>Mini Fuge</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS2035</td><td></td></tr><tr><td>Balança analítica</td><td>Mandel</td><td>LB109-12052010</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de reação de ligação rápida, 5X</td><td>NEB</td><td>B6058S</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimerase I, grande (Klenow) Fragmento</td><td>NEB</td><td>Fragmento de M0210S</td><td></td></tr><tr><td>Klenow (3 '-5 'exo)</td> <td>NEB</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Polimerase</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleotídeo Quinase</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Desoxinucleotídeo Mistura de solução, 10mM</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>dATP Solução 10mM</td><td>NEB</td><td>N0440S</td><td></td></tr><tr><td>Quick T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-Trifosfato (ATP), 25mM</td><td>NEB</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>DNA Polimerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada Hank's</td><td>Thermo Scientific</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino&nbsp;</td><td>Tampão</td><td></td> fosfato salino A3160702 <td></td>Thermo Scientific</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Sinalização Celular</td><td>9751S</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me1</td><td>Diagenode</td><td>C15410037</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Diagenode</td><td>pAb-069-050</td><td></td></tr><tr><td>H3K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410056</td><td></td></tr><tr><td>SeraMag&nbsp; super-paramagnético Contas</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

geração de imunoprecipitação da cromatina nativa sequenciamento de bibliotecas para análise da densidade nucleossoma

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Apresentamos uma imunoprecipitação da cromatina nativa modificada sequenciamento (ChIP-seq) protocolo experimental compatível com uma mistura gaussiano distribuição baseada análise metodologia (densidade nucleossoma ChIP-seq; ndChIP-seq) que permite a geração de medições combinadas de acessibilidade nuclease micrococcal (MNase), com modificações do histone todo o genoma. Posição do nucleossoma e densidade local e a modificação pós-traducional de suas subunidades de histona, agir em conjunto para regular a transcrição local Estados. Medições combinatórias de acessibilidade nucleossoma com modificações do histone gerada pelo ndChIP-seq permite o interrogatório simultâneo desses recursos. A metodologia de ndChIP-seq é aplicável a um número pequeno de células primárias inacessíveis para cross-linking protocolos baseados em ChIP-seq. Tomados em conjunto, ndChIP-seq permite a medição da modificação do histone em combinação com densidade nucleossoma locais para obter novos insights compartilhados mecanismos que regulam a transcrição do RNA dentro das populações raras célula primária.

Apresentamos uma imunoprecipitação da cromatina nativa modificada sequenciamento (ChIP-seq) metodologia para a geração de conjuntos de dados sequência apropriadas para um quadro analítico de nucleossoma densidade ChIP-seq integrando acessibilidade nuclease micrococcal (MNase) com medidas de modificação de histona.

Geração de imunoprecipitação da cromatina nativa sequenciamento de bibliotecas para análise da densidade nucleossoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar bibliotecas de sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina nativa para análise da densidade de nucleossomos. Este método pode responder perguntas em epigenética, como revelar características epigenômicas em uma população celular em nível de nucleossomo individual e resolver assinaturas de cromatina heterogêneas em seus elementos contínuos. A principal vantagem desta técnica é aproveitar a propriedade da MNase de acesso preferencial a regiões de cromatina aberta para gerar uma medida que combina a acessibilidade da MNase com a modificação de histonas.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque não conseguem obter uma digestão ideal com MNase. Inicie este protocolo com o preparo das células conforme descrito no protocolo textual. No primeiro dia, descongele cada pellet celular em banho-maria a 37 graus Celsius por 10 segundos.Em seguida, transfira as células para gelo. A cada pellet celular, adicione imediatamente um tampão de lise gelado na concentração um-X mais um-X PIC, para uma concentração final de 10.000 células por 20 microlitros. Misture 10 vezes pipetando para cima e para baixo, sem formar bolhas.Trabalhando no gelo, alíquotas de 20 microlitros por poço dos lisados resultantes em uma placa de 96 poços. Cubra a placa com o selo plástico antes de incubar no gelo por 20 minutos. Rotule a placa como MNase e registre os poços em uma chave de modelo.Logo antes de o lise de 20 minutos ser concluída, dilua a enzima MNase um com o tampão de diluição da MNase um até uma concentração final de 20 unidades por microlitro e mantenha-a em gelo. Trabalhando em gelo, prepare a mistura mestra de digestão da MNase um conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, distribua alíquotas de 20 microlitros da mistura mestra para cada linha de amostras, mais cinco microlitros de volume extra em uma placa de reservatório de 96 poços.Após a conclusão da incubação dos lisados, retire a placa de digestão com MNase do gelo. Usando uma pipeta multicanal, adicione 20 microlitros da mistura mestra de digestão MNase a cada linha de amostras e homogeneíze pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Troque as ponteiras entre as linhas.Em seguida, incube a placa à temperatura ambiente por exatamente cinco minutos. Para interromper a reação após cinco minutos, utilize uma pipeta multicanal para adicionar seis microlitros de EDTA 250-micromolar em cada linha de amostras e misture para cima e para baixo algumas vezes. Certifique-se de trocar as ponteiras entre as linhas.Após a adição de EDTA, ajuste a pipeta para 20 microlitros e misture 10 vezes como antes para garantir a interrupção completa da reação de digestão. Por fim, adicione seis microlitros de tampão de lise 10X a cada linha das amostras digeridas com MNase e misture bem pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Cubra a placa com um selo de plástico e incube em gelo por 15 minutos.Prepare a placa do complexo de anticorpo-acrílico e a placa de pré-limpeza conforme descrito no protocolo textual. Gire rapidamente ambas as placas por centrifugação durante 10 segundos a 200 vezes G. Em seguida, coloque a placa do complexo de anticorpo-acrílico sobre um ímã de placa e aguarde 15 segundos até que a solução fique límpida. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta, sem perturbar os acrílicos.Em seguida, remova a placa do ímã para placas e mantenha-a em gelo. Coloque a placa da reação de pré-limpeza sobre o ímã para placas e aguarde 15 segundos para que as microesferas se separem e a solução fique límpida. Sem perturbar as microesferas, use uma pipeta para transferir cuidadosamente o sobrenadante para os poços correspondentes da placa de complexo de microesferas com anticorpo mantida em gelo.Agite suavemente cada poço pipetando para cima e para baixo 15 vezes. Sobreponha uma tampa de alumínio sobre a placa e incube durante a noite a quatro graus Celsius em uma plataforma rotatória. Após a incubação, rotule novamente a placa como Reação de IP.No segundo dia, ajuste o agitador aquecido a 65 graus Celsius e prepare um tampão de lavagem com baixa concentração de sal e um tampão de lavagem com alta concentração de sal em gelo. Centrifugue rapidamente a placa da reação de IP por 10 segundos a 200 vezes G. Coloque a placa da reação de IP em um ímã para placa e aguarde 15 segundos até a solução ficar límpida. Usando uma pipeta multicanal, sem perturbar as microesferas, remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante.Retire a placa do ímã e coloque-a sobre gelo. Adicione a cada linha de amostras na placa de reação de IP 150 microlitros de tampão de lavagem com baixa concentração de sal, previamente resfriado, e misture lentamente para cima e para baixo 10 vezes para ressuspender completamente as microesferas. Coloque novamente a placa de reação de IP sobre o ímã e remova o sobrenadante como antes.Em seguida, coloque a placa novamente sobre gelo e repita os passos de lavagem por um total de duas lavagens. Trabalhando no gelo, adicione 150 microlitros do tampão de lavagem com alta salinidade a cada linha de amostras na placa da reação de IP. Misture as amostras lentamente pipetando para cima e para baixo 10 vezes para ressuspender completamente as microesferas.Após remover o sobrenadante como antes, coloque a placa de reação de IP sobre gelo e pré-resfrie uma nova placa de 96 poços ao lado dela. Para cada linha de amostras na placa de reação de IP, adicione 150 microlitros do tampão de lavagem de alta salinidade e misture lentamente 10 vezes, pipetando para cima e para baixo, para ressuspender completamente as microesferas. Após a ressuspensão, transfira cada linha de amostras para a linha correspondente da nova placa de 96 poços, previamente resfriada.Descarte a placa antiga. Coloque a nova placa de reação de IP no ímã de placa e descarte o sobrenadante como antes. Mantenha a placa à temperatura ambiente.Para cada linha de amostras na placa de reação de IP, adicione 30 microlitros do tampão de eluição ChIP e misture lentamente pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Tenha cuidado para evitar a formação de bolhas. Selle a placa com uma tampa de PCR e incube em um misturador aquecido a 65 graus Celsius por 1 hora e meia com uma velocidade de agitação de 1.350 RPM.Após uma incubação de 1 hora e 30 minutos, centrifugue a placa da reação de IP a 200 × g durante um minuto a quatro graus Celsius. Em seguida, coloque a placa da reação de IP sobre um ímã de placa e aguarde até que a solução fique límpida. Usando uma pipeta multicanal, sem perturbar as microesferas, transfira cuidadosamente 20 microlitros do sobrenadante para uma nova placa de 96 poços, utilizando ponteiras novas para cada linha.Rotule a placa como Reação IP e mantenha-a em temperatura ambiente. Prossiga para a digestão proteica seguida pela construção da biblioteca conforme descrito no protocolo textual. São apresentados aqui resultados representativos de cromatina digerida com MNase ideal, subdigerida e superdigerida antes da geração da biblioteca.O perfil com digestão ideal é dominado por fragmentos de tamanho único de nucleossomos, sem estar superdigesto, permitindo a recuperação de fragmentos de nucleossomos de ordem superior. A digestão subótima da cromatina também será evidente no perfil da biblioteca de sequenciamento gerada a partir do material de IP. Para validar as bibliotecas por qPCR, foi avaliado o enriquecimento relativo das bibliotecas de IP em relação à biblioteca de entrada para alvos positivos e negativos.Além disso, a inspeção visual dos reads alinhados de bibliotecas com alto enriquecimento em dobra avaliado por qPCR em um navegador genômico deve revelar enriquecimentos detectáveis visualmente em comparação com a biblioteca de entrada. Bibliotecas bem-sucedidas de sequenciamento ChIP para densidade de nucleossomos conterão réplicas altamente correlacionadas com uma porção significativa de reads alinhados dentro dos picos enriquecidos identificados pelo MACS2. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em dois dias, se executada corretamente.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar bibliotecas de imunoprecipitação de cromatina nativa para sequenciamento, destinadas à análise da densidade de nucleossomos. Ao tentar executar este procedimento, é importante lembrar-se de garantir que a cromatina seja digerida de forma ideal e utilizar apenas anticorpos que apresentem alta afinidade com o epítopo de interesse e pouca ou nenhuma reatividade cruzada com outros epítopos. Após este procedimento, pode-se realizar modelagem computacional da acessibilidade da MNase para responder perguntas como assinaturas epigenéticas decorrentes da heterogeneidade dentro de uma população celular.Este método fornece uma visão sobre o efeito combinatório da posição do nucleossomo e da densidade local, bem como da modificação pós-traducional de suas subunidades histônicas, e pode ser aplicado a quaisquer sistemas, como humanos ou camundongos, células primárias e tecidos congelados.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Neste vídeo, demonstramos a técnica de imunoprecipitação da cromatina para identificar locais de ligação a proteínas em regiões específicas do DNA genômico de células precursoras de oligodendrócitos por meio da imunoprecipitação seletiva de fragmentos de cromatina ligados a proteínas. Este método ajuda a estudar a interação de várias proteínas reguladoras, incluindo fatores de transcrição envolvidos na regulação gênica.

Imunoprecipitação da cromatina para identificar locais de ligação de proteínas-alvo no DNA genômico

A combinação de cromatina imunoprecipitação e sequenciamento ultra-high-throughput (CHIP-seq) pode identificar e mapear as interações DNA-proteína em uma determinada linha de tecido ou célula. Delineado é como gerar um modelo de alta chip de qualidade para o seqüenciamento posterior, utilizando a experiência com o fator de transcrição TCF7L2 como um exemplo.

Geração de alta Chromatin Template DNA Immunoprecipitation Qualidade para seqüenciamento de alto rendimento (CHIP-seq)

Ao combinar nativa e reticulação da cromatina imunoprecipitação com alta resolução de Espectrometria de Massa, ChroP abordagem permite a dissecar a arquitectura proteómica composto de histonas modificações, variantes e proteínas não-histonic sinergia na cromatina domínios funcionalmente distintos.

A Abordagem ChroP Combina chip e Espectrometria de Massa dissecar proteômica Paisagens Locus específicas da cromatina

Métodos para mapear interações proteína-DNA in vivo estão se tornando cruciais para todos os aspectos da pesquisa genômica, mas são trabalhosos, caros e demorados. Aqui, é apresentado um sistema robótico de manuseio de líquidos disponível comercialmente que automatiza a imunoprecipitação da cromatina para mapear interações proteína-DNA in vivo com quantidades limitadas de células.

Automatizando Experiments chip-seq para gerar perfis epigenéticos em 10.000 células HeLa

Aqui, descrevemos uma imunoprecipitação da cromatina (ChIP) e protocolo de preparação ChIP-seq biblioteca para gerar perfis de epigenomic global de amostras embrionárias de galinha baixa abundância.

Cromatina (ChIP) imunoprecipitação para baixo-abundância embrionárias amostras

Apresentamos um método eficaz e reprodutível para isolar e cultura de células progenitoras neurais do tecido do cérebro embrionário e pós-natal por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de histona 3 lisina 79 laboratório (H3K79me2) - uma marca do histone localizada dentro do domínio globular de histona 3.

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

Aqui, descrevemos um protocolo de ChIP-sequenciamento da elevado-produção otimizado e pipeline de análises computacionais para a determinação de padrões de estado todo o genoma da cromatina de tecidos de tumor congelado e linhas celulares.

Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor

Aqui descrevemos um protocolo para a imunoprecipitação eficiente de cromatina (ChIP) seguido por sequenciamento de DNA do elevado-throughput (ChIP-seq) do tecido adiposo marrom (BAT) isolado de um rato. Este protocolo é apropriado para o mapeamento de modificações do histone e investigando a localização de todo o genoma de proteínas não-histonas de interesse em vivo.

Imunoprecipitação da cromatina do tecido de adiposo marrom murino

Este artigo descreve um protocolo chip-seq semiautomado e microescalado de regiões de DNA associadas a uma modificação de histona específica (H3K27ac) usando uma plataforma de manipulador de líquidos ChIP, seguido de preparação da biblioteca usando tagmentação. O procedimento inclui avaliação de controle para fins de qualidade e quantidade e pode ser adotado para outras modificações de histona ou fatores de transcrição.

Um procedimento de ChIP-Seq semiautônomo para estudos epigenéticos em larga escala

O enriquecimento e sequenciamento do DNA nascente associado a proteínas (eSPAN) foi desenvolvido para detectar a abundância relativa de uma proteína associada à cromatina em duas fitas replicantes de DNA, revelando assim insights moleculares sobre a replicação da cromatina e seus processos acoplados. Este protocolo descreve procedimentos de eSPAN em células-tronco embrionárias (ES) de levedura e camundongo.

Análise específica de fitas de proteínas em fitas de DNA replicantes por enriquecimento e sequenciamento do método de DNA nascente associado a proteínas

Apresentamos um protocolo de microscopia de localização de molécula única em três cores (SMLM) que permite o mapeamento reprodutível de eucromatina, heterocromatina e RNAP II para análise espacial. Esse protocolo permite a marcação eficiente de multicor em ambientes nucleares densos, incluindo alvos associados à cromatina, possibilitando detecção simultânea e confiável.

Um Protocolo de Microscopia de Localização de Molécula Única Multirótulo para Investigação da Cromatina em Ambiente Nuclear Denso

Aprenda a gerar bibliotecas de ChIP-seq nativo para análise de densidade de nucleossomos usando MNase e modificações de histonas. Este método revela características epigenéticas ao nível de nucleossomo único.

Geração de imunoprecipitação da cromatina nativa sequenciamento de bibliotecas para análise da densidade nucleossoma

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