Transecção parcial nervo óptico em ratos: um modelo estabelecido com uma nova abordagem operativa para avaliar secundária degeneração das células ganglionares da retina

A degeneração secundária das células ganglionares da retina ocorre principalmente no glaucoma. Este artigo ilustra um modelo inovador de abordagem operacional de transecção parcial do nervo óptico. Essa abordagem operatória com economia de espaço melhora a capacidade do investigador de administrar drogas ou transportadores ou traçadores seletivos de RGCs no coto do nervo óptico parcialmente seccionado e permite que os pesquisadores estudem os mecanismos de lesão secundária dos RGCs de uma nova maneira.

O glaucoma é uma doença neurodegenerativa crônica, e a neuropatologia progressiva persiste por muito tempo. A hipertensão ocular é uma causa clara de glaucoma, e a diminuição da hipertensão ocular demonstrou ser a única terapia eficaz confirmada para o tratamento do glaucoma. Mas a situação de alguns pacientes se deteriorará ainda mais, mesmo após o controle da hipertensão ocular.

Portanto, acredita-se que a degeneração secundária dos RGCs ocorra no glaucoma. No entanto, o mecanismo especificamente relacionado à degeneração primária ou secundária ainda não está claro. A degeneração secundária do mecanismo RGCs guiará o tratamento do neurotrauma e da doença neurodegenerativa da CES.

Para auxiliar na transecção quantitativa parcial do nervo óptico, apresentamos um instrumento cirúrgico recém-projetado e de baixo custo. O instrumento é composto por duas partes, um poste de mão e uma cabeça ranhurada. A cabeça ranhurada é semicircular com uma profundidade vertical de 200 micrômetros, e a superfície ranhurada permite que o nervo óptico ventral se deite dentro dela e seja estabilizado para a transecção.

Coloque o nervo óptico na ranhura do instrumento. A superfície ranhurada do instrumento permite que o nervo óptico seja estabilizado para a transecção. Em seguida, transeccione verticalmente o nervo óptico com a ponta da agulha ou ponta da faca apropriada.

Observe que apenas a parte dorsal do nervo óptico é cortada, pois a parte ventral é protegida pelo instrumento. Separe e dissocie a dura-máter ao redor do nervo óptico, garantindo que não corte a artéria oftálmica associada à bainha meníngea. A lesão primária foi realizada em RGCs correspondentes aos axônios do nervo óptico quantitativamente seccionados, lado dorsal, enquanto a lesão secundária seria realizada em RGCs correspondentes aos axônios do nervo óptico não seccionados, lado central e ventral, sem dano direto.

Os ratos foram anestesiados, utilizando-se um sistema vaporizador veterinário de isoflurano. A anestesia foi monitorada durante a cirurgia e a dose de isoflurano foi ajustada de acordo. Avalie constantemente a profundidade e a frequência da respiração e realize a avaliação da pinça do dedo do pé a cada cinco minutos para garantir a ausência de dor profunda.

Coloque o lado direito do rato para cima na mesa cirúrgica com a cabeça voltada para a cirurgia. Ajuste a órbita direita no centro do campo cirúrgico view. Em seguida, limpe a área da incisão várias vezes ao longo do canto lateral até o forame acústico externo da pele orbital direita com a aplicação de clorexidina a 0,5% e etanol a 75%.

Remova o pelo entre o canto lateral e o forame acústico externo, usando uma tesoura de íris. Faça uma incisão na pele, usando uma tesoura de íris, ao longo do canto lateral até o forame acústico externo com comprimento de 0,5 a um centímetro. Em seguida, aperte a fáscia e puxe para cima para criar uma cunha triangular com uma pinça dentada de 0,12 milímetro.

Insira a lâmina inferior da tesoura de mola Vannas na área da incisão e abra a fáscia com a mesma direção de cisalhamento da pele da tesoura. Especialmente ao cortar a fáscia subcutânea no canto lateral externo, use a pinça serrilhada afiada para puxar para cima a fáscia subcutânea na superfície da fáscia verticalmente e corte a fáscia com uma tesoura de mola Vannas para evitar danos à veia orbital no canto externo para causar falha do modelo por sangramento excessivo. Corte a fáscia com uma tesoura de íris e exponha a veia orbital.

Use dissecção romba para abrir ambos os lados da incisão. A vantagem desse procedimento é que ele pode prevenir o sangramento ao cortar diretamente os vasos sanguíneos. Em seguida, use uma tesoura de íris para separar o canto lateral direito ao longo da linha de incisão para expor totalmente a abordagem cirúrgica e expor totalmente o campo de visão para a dissecção romba de acompanhamento dos músculos orbitais.

Continue a prender a pasta do músculo orbital subfascial e embote a separação verticalmente na direção da pele e da incisão da fáscia. Em seguida, separe ao longo dos lados gradualmente para atingir a profundidade orbital até o aparecimento do tecido adiposo orbital. Este procedimento abrirá porções mais profundas da cavidade orbital, proporcionando uma janela cirúrgica maior para trabalhar e permitir o acesso desimpedido aos tecidos que recobrem o nervo óptico.

Nos procedimentos acima, se ocorrer sangramento, aplique pressão, usando cotonetes cirúrgicos estéreis ou cotonetes. Após a exposição do tecido adiposo na órbita, transforme a direção da cabeça do rato de frente para o cirurgião verticalmente para o lado direito do cirurgião. Corte os tecidos adiposos orbitais cobertos pelo cone do músculo orbital ao redor do nervo óptico.

Esta ação pode garantir, expor a abordagem cirúrgica adequada. Observe para manter o volume de tecido adiposo ressecado dentro de uma faixa racional, de modo a evitar sangramento sustentado. Após o corte do tecido adiposo, o reto lateral é exposto.

Prenda o reto lateral para fora e corte-o com uma tesoura de mola Vannas. O objetivo deste procedimento é obter uma melhor exposição do nervo óptico, pois o reto lateral é muito mais largo e obviamente bloqueia a visão do nervo óptico. Se ainda houver tecido adiposo sob o reto lateral, puxe a gordura que recobre o nervo óptico, usando uma pinça dentada de 0,12 milímetro, e corte com a tesoura de mola Vannas.

Em seguida, a bainha de tecido ao redor do nervo óptico é visível. Continue a separar a bainha do tecido ao longo da direção do nervo óptico na profundidade da órbita até a exposição total do nervo óptico. Mantenha a área limpa usando cotonetes cirúrgicos para limpar pequenas quantidades de sangue que surgem da remoção dos tecidos.

Agora o nervo óptico deve estar visível. Para acessar o nervo, remova a bainha meníngea que envolve o nervo sem danificar a artéria oftálmica. Gire suavemente a bainha para examinar o padrão vascular da dura-máter com maior ampliação do microscópio cirúrgico.

Procure uma área desprovida de vasos sanguíneos e permita um corte longitudinal na dura-máter. Rasgue a bainha paralelamente à direção do nervo óptico com a ponta da agulha ou a ponta da faca cuidadosamente para evitar danos à vasculatura com cortes laterais. A única cobertura restante do nervo foi a membrana aracnóide.

É muito fino e transparente. Da mesma forma que na etapa anterior, rasgue a membrana aracnóide suavemente, com a ponta da agulha ou ponta da faca, paralela à direção do nervo óptico. Coloque o nervo óptico dentro da ranhura do instrumento com suavidade e cuidado, resultando no nervo óptico dorsal ligeiramente mais alto que a borda da cabeça da ranhura.

Em seguida, faça uma secção do nervo óptico dorsal acima da borda da plataforma da cabeça do sulco com a ponta da agulha ou a ponta da faca para completar a transecção parcial do nervo óptico. Mova o instrumento um pouco mais fundo, em direção à direção vertical do nervo óptico, para liberar o nervo óptico. Em seguida, retire a cabeça da ranhura do instrumento com cuidado.

Tente não coçar os músculos oculares ou outros tecidos para evitar danos extras. Em seguida, o coto de transecção parcial do nervo óptico pode ser observado. Recoloque o reto lateral, a fáscia e outros ao redor dos tecidos do olho para a posição original.

Em seguida, sutura a camada muscular e a camada de pele do orbital em sequência. Aplique pomada antibiótica na ferida para evitar infecções após a sutura. No processo de ressuscitação de ratos, prepare o isolamento térmico com um tapete aquecido ou cubra com acolchoamento seco na gaiola.

Cubra-os para mantê-los aquecidos. Garanta a permeabilidade das vias aéreas do rato durante o processo de recuperação. Os animais foram alojados de forma independente e monitorados cuidadosamente após a cirurgia.

Para verificar o sucesso do estabelecimento do modelo de lesão secundária com nova abordagem operatória por meio do instrumento de assistência cirúrgica autoprojetado, os CRGs foram rotulados de forma retrógrada imediatamente após o estabelecimento do modelo. O objetivo deste procedimento era rotular os RGCs de forma retrógrada, injetando um corante traçador neural no colículo superior. O corante seria absorvido retrógradamente pelos RGCs na retina e fornece um marcador para os RGCs vivos com os axônios não seccionados no olho direito.

Enquanto os RGCs correspondentes aos axônios do nervo óptico que foram parcialmente seccionados no olho direito não puderam ser marcados com Fluoro-Gold, como um olho de controle, o olho esquerdo sem qualquer operação, os RGCs ao longo do nervo óptico na retina foram todos marcados com corante de ouro fluorescente de maneira retrógrada do colículo superior. Os resultados dos RGCs marcados com fluorescência com ou sem transecção parcial do nervo óptico foram mostrados. Apenas os RGCs na retina direita correspondentes à porção não seccionada do nervo óptico foram marcados com ouro fluorescente, e o limite claro dos RGCs não marcados e marcados foi visualizado, o que demonstrou a transecção parcial do nervo óptico.

Como olho de controle, todos os RGCs da retina do olho esquerdo foram marcados por ouro fluorescente. Essas imagens mostram que o suprimento sanguíneo do olho direito foi observado antes e depois da operação. Após a operação, as artérias ainda estavam cheias de sangue, e nenhuma obstrução das veias foi observada.

Isso indicou que não houve danos ao sistema de suprimento de sangue durante a operação. O modelo de degeneração secundária dos RGCs foi estabelecido com sucesso. O modelo de transecção potencial do nervo óptico é um modelo animal utilizável para estudar o mecanismo de degeneração secundária e triagem para as drogas neuroprotetoras no combate à degeneração secundária.

O casamento deste modelo é a capacidade de separar a degeneração primária da secundária com precisão na localização, tanto no nervo óptico quanto nas retinas. A principal vantagem do nosso instrumento projetado é mais reprodutível e mais fácil de operar. Com a prática, todas as etapas do procedimento cirúrgico completo podem ser realizadas em 10 a 15 minutos por olho, uma vez que os cortes iniciais de entrada tenham sido feitos.