Modelagem de infecção de vírus Zika do desenvolvimento cérebro humano In Vitro usando células-tronco derivadas de Organoids Cerebral

O objetivo geral deste procedimento é modelar a infecção pelo vírus zika no cérebro humano em desenvolvimento usando organoides cerebrais derivados de células-tronco. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia, como quais células são capazes de ser infectadas e quais proteínas estão envolvidas com a via de infecção. As principais vantagens dessa técnica são que ela imita a infecção humana precoce, pode ser utilizada em ensaios de alto rendimento e pode ser combinada com técnicas genéticas de foco, como CRISPR.

Esse método pode fornecer informações sobre o mecanismo de infecção pelo zika vírus. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como triagem de drogas e pseudotipagem de vírus. Usando métodos regulares de manutenção de células-tronco, leve as culturas a uma confluência entre 50% e 70%.

Inspecione as culturas usando microscopia de campo claro com ampliação de 10 a 20x e certifique-se de que a colônia tenha uma morfologia saudável sem diferenciação detectável. Leve o meio de manutenção de células-tronco livres de xeno a 37 graus Celsius em banho-maria quente e descongele dois mililitros de reagente de descolamento enzimático e um frasco de 50 microlitros do inibidor de rocha em temperatura ambiente. Em seguida, prepare uma placa de 96 poços inferior em U de fixação ultrabaixa, uma pipeta p200 multicanal e um reservatório de reagente de 25 mililitros.

Em seguida, alíquota de 45 mililitros da mídia em um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione 45 microlitros do inibidor de rocha e misture bem o inibidor triterando a mistura, seguido de dois a quatro nas versões. Aspire a vácuo dois poços de uma placa de seis poços contendo células-tronco e adicione rapidamente um mililitro de reagente de desprendimento livre de enzimas a cada poço e, em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por quatro minutos.

Em seguida, aspire a vácuo os poços tratados e adicione um mililitro de reagente de descolamento enzimático a cada poço. Após uma incubação de cinco minutos a 37 graus Celsius, remova a placa da incubadora. Bata suavemente na placa para quebrar as células agregadas.

Em seguida, inspecione as células ao microscópio. Se grandes aglomerados de células ainda estiverem visíveis, incube a placa por mais dois minutos a 37 graus Celsius. Repita a etapa até que os aglomerados não sejam mais visíveis a olho nu.

Uma vez que as células estejam devidamente dissociadas, adicione um mililitro de meio de manutenção de células-tronco livres de xeno a cada poço, para desativar as enzimas de dissociação. Puxe a suspensão de células para um tubo cônico de 50 mililitros e pegue uma pequena alíquota para a contagem de células. Durante a centrifugação, contar as células e determinar o volume de ressuspensão necessário para atingir 60 000 células por mililitro de suspensão.

Remover cuidadosamente o sobrenadante e voltar a suspender as células a 60 000 células por mililitro em meios que contenham o inibidor de rochas. Usando uma pipeta de cinco mililitros, misture as células suavemente cinco a 10 vezes para garantir uma suspensão celular uniforme. Adicione imediatamente a suspensão celular ao reservatório de reagente e use uma pipeta p200 multicanal para transferir 150 microlitros para cada poço de uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa no fundo.

Em seguida, centrifugue a placa a 150 x G por um minuto e, em seguida, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius. Não mexa na placa por 48 horas. A partir do segundo dia, prepare 17 mililitros de meio contendo 17 microlitros do inibidor de rocha estoque em um tubo cônico de 50 mililitros.

Aqueça a mistura a 37 graus Celsius em banho-maria. Pegue a placa organoide da incubadora e, usando uma pipeta p200 multicanal, retire lentamente 75 microlitros de meio das bordas dos poços na primeira linha. Em seguida, expulse-o rapidamente de volta para o poço para retirar as células soltas e os organoides.

Repita esse processo de dispersão para cada linha. Aguarde 15 segundos para garantir que os organoides afundaram no fundo de cada poço e, em seguida, aspire lenta e cuidadosamente 75 microlitros de meio de cada poço usando a pipeta p200 multicanal e distribua-o em um reservatório de resíduos. Em seguida, transfira o meio contendo o inibidor de rocha para um reservatório de reagente, dispense 150 microlitros de meio em cada poço organoide e, em seguida, incube as células a 37 graus Celsius.

Aqueça 17 mililitros de meio de cultura fresco a 37 graus Celsius, desta vez sem nenhum inibidor de rocha. Usando uma pipeta p200 multicanal ajustada para 100 microlitros, repita o processo de dispersão mostrado anteriormente e aguarde 15 segundos para garantir que os organoides tenham afundado no fundo de seus poços. Em seguida, aspire cuidadosamente 125 microlitros de meio de cada poço e substitua por 150 microlitros de meio aquecido.

Coloque a placa na incubadora de 37 graus Celsius. Preparar o meio de acordo com a receita aqui indicada e, em seguida, filtrar a solução misturada num filtro de 500 mililitros. Do quarto dia até que as células sejam infectadas por volta do dia 24, realize manutenção regular em dias alternados usando meio de indução neural.

Depois de filtrado, aqueça 17 mililitros do meio de indução neural a 37 graus Celsius e armazene o restante a quatro graus Celsius. Usando uma pipeta p200 multicanal, ajustada para 100 microlitros, disperse todos os poços da placa organoide mostrada anteriormente. Aguarde 15 segundos para garantir que os organoides tenham afundado no fundo de seus poços.

Aspire cuidadosamente 125 microlitros de meio de cada poço e substitua-o por 125 microlitros de meio de indução neural fresco. Repita esse feito de indução neral a cada dois dias até que os organoides estejam prontos para a infecção pelo vírus zika. Traga a solução salina balanceada 1x de earle, 1x PBS e meio de indução neural a 37 graus Celsius em banho-maria.

Em seguida, dilua o zika vírus de uma concentração conhecida em 1x solução de Earle para a multiplicidade alvo de infecção, que normalmente está entre 0,1 e 10. Usando uma pipeta p200, remova cuidadosamente todo o meio de cada poço organoide. Em seguida, lave rapidamente os organoides com 200 microlitros de PBS 1x aquecido.

Ao remover o meio de cada poço, é fundamental que não se toque no organoide ou o sugue para dentro da pipeta. Isso pode causar danos irreparáveis ao organoide. Caso isso aconteça, é melhor descartar o organoide.

Em seguida, remova cuidadosamente todo o líquido restante de cada poço organoide usando uma pipeta p200 de canal único. Em seguida, adicione rapidamente 50 microlitros de 1x solução de Earle para uma infecção simulada ou solução de vírus zika a cada poço. Certifique-se de que cada organoide esteja completamente submerso quando terminar, coloque a placa de volta em uma incubadora de 37 graus Celsius por duas horas.

Após a conclusão de uma exposição viral, lave cada poço dos organoides com 200 microlitros de PBS. Deixe os organoides assentarem por 15 segundos e, em seguida, remova o PBS usando uma pipeta p200 de canal único. Por fim, adicione 200 microlitros de meio de indução neural fresco a cada poço e coloque a placa de volta na incubadora.

A coloração com DAPI, fosfo-vimentina, TBR2 e MAP2 pode ser combinada para mostrar as estruturas corticais que se formam dentro dos organoides. Essas estruturas incluem a zona ventricular, a zona subventricular, a zona intermediária e a placa cortical dentro de cada roseta. A cultura dos organoides até o dia 108 permite observar os estágios posteriores de desenvolvimento.

Embora as camadas corticais não sejam tão proeminentes neste tipo de organoide, a mudança natural para a gliogênese ocorre de forma muito semelhante à in vivo. Três dias após a infecção pelo zika vírus, uma diferença no tamanho do organoide torna-se visível. A escala dessa diferença depende da multiplicidade viral de infecção aplicada aos organoides.

Essa diferença no tamanho do organoide aumentará na semana seguinte até que os organoides infectados comecem a se separar. Após três dias, também haverá um aumento de detritos celulares nos poços infectados em comparação com os poços simulados. Ao tentar este procedimento, é importante seguir práticas laboratoriais seguras, pois materiais infecciosos viáveis estão sendo usados.

Após esse procedimento, outros métodos, como imuno-histoquímica ou RNAC, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a biologia envolvida na infecção pelo vírus zika do desenvolvimento neural.