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Advanced Biology

Uma Introdução à Endocitose e Exocitose

An Introduction to Endocytosis and Exocytosis

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Cell Biology

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An Introduction to Endocytosis and Exocytosis

4.6: Invasion Assay Using 3D Matrices

4.8: Cell-surface Biotinylation Assay

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09:27 min

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April 30, 2023

Overview

As células podem tomar substâncias do ambiente extracelular por endocitose e liberar ativamente moléculas nela por exocitose. Tais processos envolvem sacos ligados à membrana lipídica chamados vesículas. O conhecimento da arquitetura molecular e dos mecanismos de ambos é fundamental para entender a fisiologia celular normal, bem como os estados da doença que surgem quando ficam defeituosos.

Este vídeo primeiro revisará brevemente algumas descobertas fundamentais na história da pesquisa de endo e exocistose. Em seguida, algumas questões-chave serão examinadas, seguidas de uma discussão sobre os métodos proeminentes utilizados para investigar esses problemas, incluindo rotulagem celular, ensaios de fusão e imagem de fluorescência. Finalmente, explorará a pesquisa atual que está sendo conduzida por cientistas no campo hoje.

Procedure

Vias endocíticas e exocíticas são críticas para a homeostase celular, função tecidual e sobrevivência celular geral. Simplificando, a endocitose é o processo que uma célula usa para receber moléculas do espaço extracelular dobrando sua membrana ao seu redor e formando uma vesícula. Exocitose é o processo inverso, que usa vesículas para liberar substâncias para o espaço extracelular. Esses processos têm sido sugeridos para desempenhar um papel crítico na secreção hormonal, internalização do receptor de membrana, engolfação de patógenos e comunicações neuronais.

Hoje, vamos refazer algumas das descobertas marcantes no campo da endocitose e exoctose, destacar algumas das perguntas sem resposta, apresentar métodos notáveis que são usados hoje e, por último, explorar alguns experimentos específicos realizados para entender melhor esses processos.

Vamos revisitar algumas das descobertas importantes que levaram ao entendimento atual da endocitose e exocitose.

A primeira documentação relacionada à endocitose pode ser mapeada até 1882, quando Ilya Metchnikov, usando um microscópio leve, observou que células específicas engoliam patógenos invasores. Ele chamou esse processo de “fagocitose”, onde as células engolfam o patógeno através da formação de vesículas. Quase meio século depois, em 1931, Warren Lewis observou um processo semelhante de formação de vesículas quando as células tomaram fluido. Ele chamou esse comportamento de “pinocitose”.

Mais tarde, em 1953, George Palade, enquanto examinava a organização estrutural e funcional da célula, descobriu invaginações “semelhantes a cavernas” das membranas, e as chamou de caveolae. Ele inferiu que estes devem ser necessários para a ingestão celular. Logo depois, em 1955, o ganhador do Nobel Christian de Duve cunhou o termo endocitose, que englobava “fagocitose” e “pedocitose”. No entanto, a história da endocitose ainda não tinha acabado.

Em 1975, Michael Brown e Joseph Goldstein, com o especialista em microscopia eletrônica Richard Anderson, observaram que quando a lipoproteína de baixa densidade, ou LDL, se liga ao seu receptor de superfície celular, leva à formação de “poços revestidos”. Estes poços são então internalizados, e receptores LDL endocitose. Esta foi a descoberta do terceiro tipo, chamado “endocitose mediada por receptores”. No mesmo ano, Barbara Pearse isolou a proteína do casaco principal, uma molécula de triskelion, e a chamou de clathrin. Portanto, esse processo também é chamado de “endocitose mediada por clathrin”.

Isso foi tudo sobre a endocitose. Agora vamos discutir como aprendemos sobre exocitose. Em 1980, o grupo de Randy Schekman gerou mutantes de levedura que eram deficientes de secreção, e revelou a presença de genes críticos que codificavam proteínas necessárias para exocitose.

Em 1993, James Rothman identificou algumas dessas proteínas, e com base em sua natureza química eles eram chamados SNAREs. Em sua “hipótese snare” seminal, ele propôs que essas estruturas helicoidais se conectassem umas às outras, fazendo com que as membranas se aproximassem com força suficiente para se fundir e gerar exocitose.

Na mesma época, Thomas Südhof estabeleceu que esse processo também era fortemente controlado em neurônios por proteínas de detecção de cálcio chamadas sinapstotagmins que promoviam e cronometravam com precisão a fusão de vesículas para liberação de neurotransmissores. Juntos, esses cientistas receberam o Prêmio Nobel em 2013.

Apesar da amplitude dessas descobertas, muitos quebra-cabeças intrigantes permanecem. Vamos dar uma olhada em algumas das perguntas que estão sendo exploradas hoje.

Os cientistas estão começando a perguntar como as funções da endocitose e excitose vão além de adquirir e segregar substâncias. Por exemplo, como os neurotransmissores são continuamente liberados por vesículas que se fundem à membrana celular sem uma expansão catastrófica do tamanho celular? Eles estão tentando identificar sinais que fazem com que as células internalizem a membrana, a fim de compensar a expansão e reciclar recursos.

Outro tópico interessante é: quais componentes compõem as máquinas moleculares sofisticadas que impulsionam esses processos? Por exemplo, a fagocitose requer grandes deformações de membrana para cercar patógenos invasores. Os cientistas estão investigando como proteínas citoesqueléticas como a actina contribuem para a remodelação dramática da membrana.

Por fim, uma vez que a endocitose aberrante e a exocitose podem resultar em doenças graves, os cientistas estão interessados em entender o que causa essa desregulação. Uma das proteínas que estão sendo examinadas é α-sinucleína, cuja secreção dos neurônios foi implicada na morte progressiva de neurônios próximos. Entender sua exocitese poderia fornecer insights valiosos sobre o tratamento de doenças neurodegenerativas como Parkinson.

Agora que consideramos algumas das principais questões que estão sendo investigadas, vamos ver quais ferramentas estão disponíveis para respondê-las.

Pesquisadores usam um ensaio de biotinilação celular para rastrear a endocitose de proteínas superficiais celulares. Este processo envolve rotular uma proteína superficial com biotina marcada fluorescente e, em seguida, permitir que a célula se submeta a endocitose. Isso pode ser seguido pela análise de manchas imunológicas, revelando a internalização da proteína.

Para quantificar a reciclagem de vesículas neuronais, muitos cientistas rotulam células com moléculas fluorescentes específicas da membrana, como corantes FM. Estes corantes se ligam firmemente ao folheto externo, e só são internalizados por endocitose. Após estimulação sequencial, eles são exocistosados. Analisar a liberação com um microscópio de fluorescência permite uma visão mais profunda de todo o processo de reciclagem.

Muitas vezes, para manipular e entender as contribuições de componentes que permitem a exocises, os cientistas criaram ensaios de fusão. Dois conjuntos de vesículas com distintos conteúdos de corante fluorescente são preparados e autorizados a se unir. A fusão entre eles resulta na formação de um novo produto, que pode ser monitorado usando um leitor de microplacão.

Por fim, métodos sofisticados de imagem, incluindo imagens de fluorescência e imagens de células vivas de fluorescência, apresentam aos pesquisadores a oportunidade única de imagens morfológicas e eventos moleculares de endocitose e exocitose.

Finalmente, vamos ver algumas maneiras específicas em que os cientistas estão implementando essas ferramentas em laboratórios hoje.

Biólogos de células estão interessados em estudar como a exocitose ajuda a curar membranas feridas. Aqui, os pesquisadores primeiro feriram células em solução de corantes FM rolando contas de vidro sobre elas. Imagens subsequentes de fluorescência mostram que se a taxa de exocitose for rápida, ela rapidamente selará a membrana e impedirá o vazamento de FM na célula. Quando a excitose é lenta, resulta em extensa coloração FM intracelular.

Os pesquisadores podem usar ensaios de fusão para modelar a contribuição de proteínas específicas de fusão. Aqui, os pesquisadores expressaram diferentes proteínas de membrana associadas à vesícula ou “VAMPs”, que são proteínas SNARE, na superfície de duas piscinas de células. A fusão foi então permitida, e o resultado foi quantificado usando um espectrômetro. Usando essa configuração, os cientistas foram capazes de comparar a eficiência de fusão de vários VAMPs.

Por fim, os pesquisadores pretendem entender a endocitose do receptor de superfície celular em resposta a uma droga. Aqui, os cientistas trataram células fluorescentes com uma droga, e receptor visualizado medicado endocitose acontecendo em tempo real usando microscopia de lapso de tempo.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à endocitose e excitose. Neste vídeo, revisamos os destaques históricos a partir da descoberta da fagocitose à definição dos mecanismos de liberação de neurotransmissores. Em seguida, introduzimos algumas perguntas-chave que estão sendo feitas. Também exploramos estratégias de pesquisa proeminentes e discutimos algumas de suas aplicações atuais. Como sempre, obrigado por assistir!

Transcript

Endocytic and exocytic pathways are critical for cellular homeostasis, tissue function, and overall cell survival. Simply put, endocytosis is the process that a cell uses to take in molecules from the extracellular space by folding its membrane around it and forming a vesicle. Exocytosis is the reverse process, which uses vesicles to release substances to the extracellular space. These processes have been suggested to play a critical role in hormone secretion, membrane receptor internalization, pathogen engulfment, and neuronal communications.

Today, we’ll retrace some of the landmark discoveries in the field of endocytosis and exocytosis, highlight some of the unanswered questions, feature notable methods that are used today, and lastly, explore a few specific experiments performed to better understand these processes.

Let’s revisit some of the momentous discoveries that led to the current understanding of endocytosis and exocytosis.

The first documentation related to endocytosis can be mapped back to 1882, when Ilya Metchnikov, using a light microscope, observed that specific cells engulfed invading pathogens. He called this process “phagocytosis,” where cells engulf pathogen via vesicle formation. Almost half a century later, in 1931, Warren Lewis observed a similar process of vesicle formation when cells took in fluid. He named this behavior “pinocytosis.”

Later in 1953, George Palade, while examining the structural and functional organization of the cell, discovered “cave-like” invaginations of the membranes, and called them caveolae. He inferred that these must be required for cell-intake. Soon after, in 1955, Nobel laureate Christian de Duve coined the term endocytosis, which encompassed “phagocytosis” and “pinocytosis.” However, the story of endocytosis wasn’t over yet.

In 1975, Michael Brown and Joseph Goldstein, with electron microscopy expert Richard Anderson, observed that when low density lipoprotein, or LDL, binds to its cell surface receptor, it leads to formation of “coated pits.” These pits are then internalized, and endocytose LDL receptors. This was the discovery of the third type, called “receptor-mediated endocytosis.” In the same year, Barbara Pearse isolated the major coat protein, a triskelion molecule, and named it as clathrin. Therefore, this process is also called “clathrin-mediated endocytosis.”

That was all regarding endocytosis. Now let’s discuss how we learned about exocytosis. In 1980, Randy Schekman’s group generated yeast mutants that were secretion deficient, and revealed the presence of critical genes that coded for proteins necessary for exocytosis.

In 1993, James Rothman identified some of these proteins, and based on their chemical nature they were called SNAREs. In his seminal, “SNARE hypothesis,” he proposed that these helical structures hook on to each other, causing membranes to come closer with sufficient force to fuse and generate exocytosis.

Around the same time, Thomas Südhof established that this process was also tightly controlled in neurons by calcium-sensing proteins called synaptotagmins that fostered and accurately timed vesicle fusion for neurotransmitter release. Together, these scientists were awarded the Nobel Prize in 2013.

Despite the breadth of these discoveries, many intriguing puzzles remain. Let’s take a look at some of the questions being explored today.

Scientists are starting to ask how the functions of endocytosis and exocytosis go beyond acquiring and secreting substances. For example, how are neurotransmitters continuously released by vesicles fusing to the cell membrane without a catastrophic expansion of cell size? They are trying to identify signals that cause cells to internalize membrane, in order to offset the expansion and recycle resources.

Another interesting topic is: what components make up the sophisticated molecular machinery that drives these processes? For example, phagocytosis necessitates large membrane deformations to surround invading pathogens. Scientists are investigating how cytoskeletal proteins like actin contribute to dramatic membrane remodeling.

Lastly, since aberrant endocytosis and exocytosis can result in serious diseases, scientists are interested in understanding what causes this dysregulation. One of the proteins being scrutinized is α-synuclein, whose secretion from neurons has been implicated in the progressive death of nearby neurons. Understanding its exocytosis could provide valuable insights on the treatment of neurodegenerative diseases like Parkinson’s.

Now that we’ve considered some of the key questions being investigated, let’s see what tools are available to answer them.

Researchers use a cell biotinylation assay to track endocytosis of cell surface proteins. This process involves labeling a surface protein with fluorescently tagged biotin, and then allowing the cell to undergo endocytosis. This can be followed by immune blot analysis, revealing protein internalization.

In order to quantify neuronal vesicle recycling, many scientists label cells with membrane-specific fluorescent molecules, like FM dyes. These dyes bind stably to the outer leaflet, and are only internalized by endocytosis. Following sequential stimulation, they are exocytosed. Analyzing release with a fluorescence microscope allows deeper insight into the whole recycling process.

Often, to manipulate and understand the contributions of components that allow exocytosis, scientists set up fusion assays. Two sets of vesicles with distinct fluorescent dye contents are prepared and allowed to come together. Fusion between them results in formation of a new product, which can be monitored using a microplate reader.

Lastly, sophisticated imaging methods, including fluorescence imaging and fluorescence live cell imaging, present researchers with the unique opportunity to image morphological structures and molecular events of endocytosis and exocytosis.

Finally, let’s look at some specific ways in which scientists are implementing these tools in labs today.

Cell biologists are interested in studying how exocytosis helps heal injured membranes. Here, researchers first injured cells in solution of FM dyes by rolling glass beads over them. Subsequent fluorescence imaging shows that if the rate of exocytosis is fast, it will quickly seal up the membrane and stop FM leaking into the cell. When exocytosis is slow, it results in extensive intracellular FM staining.

Researchers can use fusion assays to model the contribution of specific fusion proteins. Here, researchers expressed different vesicle-associated membrane proteins or “VAMPs,” which are SNARE proteins, on the surface of two pools of cells. The fusion was then allowed to take place, and the result was quantified using a spectrometer. Using this setup, scientists were able to compare the fusion efficiencies of multiple VAMPs.

Lastly, researchers are aiming to understand cell surface receptor endocytosis in response to a drug. Here, scientists treated fluorescently tagged cells with a drug, and visualized receptor medicated endocytosis happening in real time using time-lapse microscopy.

You’ve just watched JoVE’s introduction to endocytosis and exocytosis. In this video, we reviewed the historical highlights starting from the discovery of phagocytosis to defining the mechanisms of neurotransmitter release. Next, we introduced a few key questions being asked. We also explored prominent research strategies, and discussed some of their current applications. As always, thanks for watching!

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