Name: Ensaio de reparação da membrana celular usando um microscópio de dois fotões Laser (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Aprenda a quantificar a reparação da membrana plasmática em células de pacientes com distrofia muscular usando ablação a laser de dois fótons. Este método permite imagens em tempo real da resselação celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho foi apoiado pela Universidade de Alberta faculdade de medicina e odontologia, os amigos de Garrett Cumming cadeira fundo de pesquisa, HM Toupin fundo de cadeira de pesquisa neurológica de ciência, Distrofia Muscular Canadá, Canadá Foundation para inovação (CFI), Alberta educação e tecnologia avançada (AET), institutos canadenses de pesquisa em saúde (CIHR), viagem de Jesse - Fundação para o Gene e terapia celular, as mulheres e Instituto de pesquisa de saúde infantil (WCHRI), e Alberta inova saúde soluções (AIHS ).
Gostaríamos de agradecer o Dr. Steven Laval para nos fornecer o plasmídeo dysferlin completos. Também gostaríamos de agradecer o Dr. Katsuya Miyake para aconselhamento técnico.

Células de fibroblastos humanos utilizadas neste estudo foram utilizadas com aprovação do Comitê de ética humana da faculdade de medicina e Odontologia da Universidade de Alberta.
1. transfecção de células com longa-metragem do plasmídeo DYSF
<ol>
	<li>Células de cultura de fibroblastos num balão de T225 contendo 40 mL de meio de crescimento - de mL 36 Dulbecco modificado águia médio (DMEM), 4 mL de soro fetal bovino (FBS) e 20 µ l de penicilina/estreptomicina (P/S) - numa incubadora de CO2 a 37 ° C. Nota: As células devem ser cultivadas para aproximadamente 70-80% de confluência e não devem tornar-se completamente confluentes.</li>
	<li>Para preparar células para semeadura, enxagúe as células com 40 mL de salina tamponada fosfato (PBS) duas vezes e, em seguida, adicionar 5 mL de tripsina 0,05% para separar as células. Retorno as células a 37 ° c CO2 incubadora e incube as celulas por 5 min.<ol>
		<li>Quando as células são totalmente isoladas, adicione 40 mL de meio de crescimento para parar a reação de tripsina.</li>
		<li>Conte as células usando um hemocytometer ou outra célula contando o dispositivo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sementes de 2 mL de células a 1 x 105 células/mL em pratos de vidro-fundo revestido de colágeno de 35 mm. Incubar as células durante a noite em uma incubadora de CO2 a 37 ° C. Nota: As células devem ser aproximadamente 50-60% de confluencia no dia seguinte.</li>
	<li>Remova a mídia de crescimento e substituí-lo com 2 mL de soro-privado media (mídia de crescimento sem FBS).</li>
	<li>Transfect as células com plasmídeo dysferlin completos usando lipotransfection.<ol>
		<li>Prepare 150 µ l de meios privados de soro em um tubo de 1,5 mL (um tubo para cada prato a transfected).</li>
		<li>Adicione 3 µ l de reagente de Transfeccao para cada tubo de 1,5 mL contendo meios privados de soro. Incube-lo pelo menos 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Em um tubo separado 1,5 mL, adicione 175 µ l dos meios de comunicação privados de soro e 3,5 µ g do ADN do plasmídeo. Nota: Multiplica os valores acima para cada prato adicional a transfected.</li>
		<li>Combine a 150 µ l de mídia contendo o plasmídeo de DNA em um tubo com 150 µ l de soro privado de mídia e reagente de transfeccao. -Incube por 20 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Distribua uniformemente 300 µ l de mídia com o reagente do plasmídeo e transfecção em todo o prato. Incubar os pratos para 24h numa incubadora de CO2 a 37 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Substituir a mídia com a mídia de crescimento fresco com soro e incube-lo para um adicional 24h numa incubadora de CO2 a 37 ° C.</li>
</ol>
2. preparação de células para ensaio ferindo dois fotões
<ol>
	<li>Remova a mídia pipetando e enxágue as células uma vez com 1 mL de solução de Tyrode, em seguida, adicione 1 mL de solução de Tyrode fresco contendo 1 µ l de 2,5 mM FM 4-64 tintura. Nota: A concentração final de tintura de FM 4-64 é 2,5 µM.</li>
	<li>Se avaliação de reparação da membrana em um ambiente empobrecido cálcio é desejada, enxágue as células com 1 mL de PBS e em seguida, adicione 1 mL de PBS contendo 1 mM EGTA. Nota: Como PBS fará com que as células a se destacar ao longo do tempo, o ensaio ferindo deve ser concluído mais rapidamente possível.</li>
</ol>
3. dois fotões laser ferindo ensaio
<ol>
	<li>Usando um microscópio confocal invertido e o software programa associado, criar um destino de µm de 0,2 µm x 2 e colocá-lo na borda da membrana celular, para que a linha de destino se sobrepõe e encontra-se perpendicular à direção da membrana celular (Figura 2).</li>
	<li>Use um laser aqui vai de 543-nm para excitar o sinal de FM tintura e definir a escala da deteção para 600-760 nm. Use um laser de argônio 488 nm para excitar o sinal GFP (Figura 4) e definir a escala da deteção para 500-550 nm.<ol>
		<li>Criar uma série de tempo de 5 min de exames de imagem sequencial, células de imagem a cada 5 s.</li>
		<li>Para gerar uma lesão de membrana, lixívia células usando um laser de dois fotões definido como 820 nm, usando 15% poder com 10 iterações do laser e lixívia células 25 s após o início da série de tempo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para quantificar a FM 4-64 fluorescência de tintura, use o software para desenhar um 6 µm x 6 µm região de interesse (ROI) e colocá-lo adjacente para o local do ferimento e dentro da célula (Figura 3). Nota: Evite áreas de amostragem de supersaturação pixel usando a função de "Indicador de intervalo" no software - nesta aplicação, pixels vermelhos representam pixels saturadas. Exporte valores de fluorescência cru em uma planilha eletrônica para análise estatística.</li>
	<li>Calcular os valores de fluorescência relativo para cada ponto de tempo subtraindo o valor do fundo (valor médio de fluorescência momentos antes da membrana ferindo) e dividindo o aumento líquido por fluorescência valor em t = 0 (Figura 5, 6) .</li>
</ol>

<ol><li>Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+wounding+and+repair+in+pulmonary+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).</li>
<li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Membrane+Repair+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Plasma Membrane Repair in Health and Disease.</a> Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).</li>
<li>McNeil, P. L., Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+cell+plasma+membrane+wounding+and+resealing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo.</a> Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).</li>
<li>McNeil, P. L., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emergency+response+team+for+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An emergency response team for membrane repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).</li>
<li>Cooper, S. T., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Repair%3A+Mechanisms+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology.</a> Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).</li>
<li>Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+free+Ca2%2B+and+proteolysis+in+lethal+oxidative+injury+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells.</a> Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).</li>
<li>McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+actin-cytoskeleton-dependent+recruitment+of+plasma+membrane-derived+dysferlin+at+wounds+is+critical+for+muscle+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair.</a> FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).</li>
<li>Benninger, R. K., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).</li>
<li>Demonbreun, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+actin-dependent+annexin+complex+mediates+plasma+membrane+repair+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle.</a> J Cell Biol. 213 (6), 705-718 (2016).</li>
<li>McNeil, P. L., Khakee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+of+muscle+fiber+plasma+membranes.+Role+in+exercise-induced+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage.</a> Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).</li>
<li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes+behave+as+Ca2%2B-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J Cell Biol. 137 (1), 93-104 (1997).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca%282%2B%29-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106 (2), 157-169 (2001).</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423 (6936), 168-172 (2003).</li>
<li>Han, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin-mediated+membrane+repair+protects+the+heart+from+stress-induced+left+ventricular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury.</a> J Clin Invest. 117 (7), 1805-1813 (2007).</li>
<li>Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+lysosomal+exocytosis+and+plasma+membrane+repair+in+Chediak-Higashi%2Fbeige+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (48), 16795-16800 (2004).</li>
<li>Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+plasma+membrane+wounding+and+assessment+of+lysosome-mediated+repair+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses.</a> Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+and+dendrite+dynamics+in+zebrafish+embryos%3A+early+events+in+synaptogenesis+imaged+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo.</a> Nat Neurosci. 3 (3), 231-237 (2000).</li>
<li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4592-4597 (2003).</li>
<li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J Vis Exp. (52), (2011).</li>
<li>Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlinopathy+Fibroblasts+Are+Defective+in+Plasma+Membrane+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Curr%22%5BJournal%5D)">Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair.</a> PLoS Curr. 7, (2015).</li>
<li>Philippi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin-deficient+immortalized+human+myoblasts+and+myotubes+as+a+useful+tool+to+study+dysferlinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Curr%22%5BJournal%5D)">Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy.</a> PLoS Curr. 4, RRN1298(2012).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11 (1), 56-64 (2009).</li>
<li>Swaggart, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A6+modifies+muscular+dystrophy+by+mediating+sarcolemmal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).</li>
<li>Roostalu, U., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+molecular+interactions+at+damaged+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma.</a> Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).</li>
<li>Azakir, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+dispensability+of+dysferlin+C2+domains+reveals+rational+design+for+mini-dysferlin+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).</li>
<li>Lee, J., Yokota, T. Ch 6. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+J+%22Translational+Research+in+Muscular+Dystrophy%22">Translational Research in Muscular Dystrophy</a>. Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. , Springer Japan. 87-102 (2016).</li>
<li>Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+research+and+therapeutic+perspectives+in+dysferlinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies.</a> Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Dois fotões laser ferindo da membrana celular é uma técnica precisa e versátil para avaliar a dinâmica da membrana em vitrode fechamento. Neste artigo, descrevemos um protocolo para a determinação da membrana celular, habilidade em dysferlinopathy paciente células usando o laser de dois fotões ferindo o ensaio de fechamento. Nossos resultados mostram que a paciente células dysferlinopathy são defeituosas na membrana celular de fechamento, que é consistente com resultados por outros pesquisadores e que destaca ai...

A membrana celular das células eucarióticas é composto por uma camada dupla de fosfolipídios cravejado de proteína que define o ambiente intra/extracelular da célula e é essencial para manter a sobrevivência celular de homeostase e célula. Membrana celular lesões decorrentes de insultos mecânicos ou químicos são comuns em vários tipos de células de mamíferos, incluindo esquelético e músculo cardíaco, estômago e pulmão células1,2,3,4. Além de lesões consequentes para funções fisiológicas diárias, as membranas das células também podem ser danificadas por insultos ambientais, toxinas bacterianas e reperfusão isquêmica5. Falha de selar rupturas na membrana celular leva ao influxo não regulamentado de extracelular Ca2 +- juntamente com outros componentes extracelulares potencialmente tóxicos - dentro da célula, desencadeando cascatas de sinal a jusante que rapidamente podem resultar em células morte1,4,5,6.
Até à data, tem havido vários modelos propostos para o reparo de membrana nas células. Mecanismos de reparação diferentes podem ser ativados, dependendo do tamanho e da natureza da ruptura da membrana. Por exemplo, sugere-se que as membranas celulares podem utilizar fluxo lateral ou proteína entupimento para reparar pequenas interrupções (&#60; 1 nm). O modelo de fusão lateral propõe que rupturas de membrana são rapidamente reparadas através de recrutamento lateral de dysferlin contendo membrana7, enquanto a proteína entupimento modelo sugere que pequenas perfurações são remendadas através de agregações de proteínas (principalmente anexinas) 8. Inversamente, desencadear lesões maiores de membrana Ca2 +-dependente, mediada por dysferlin vesículas fusão e formação de um remendo do reparo. No modelo de remendo de reparação, um rápida Ca2 + influxo para a célula dispara o recrutamento de várias proteínas (dysferlin, anixinas, mitsugumin-53 e proteínas EDH) que formam um complexo ou "patch", juntamente com uma fusão de vesículas intracelulares ou lisossomos no local da membrana danificar4,9,10,11,12. É importante notar que estes modelos não são necessariamente mutuamente exclusivos e podem trabalhar em conjunto para facilitar a reparação da membrana. Falha de selar corretamente o dano da membrana celular está associada a vários Estados da doença, incluindo distrofia muscular (dysferlinopathy - incluindo Miyoshi miopatia, membro-cinta distrofia muscular tipo IIB e miopatia distal com início tibial anterior) 13, cardiomiopatia14e Chediak-Higashi síndrome (CHS)15.
Dada essa integridade adequada da membrana celular e peças de fechamento um papel tão importante na saúde e na doença, uma compreensão mais profunda dos mecanismos moleculares subjacentes do reparo da membrana celular seria benéfica na busca de novas estratégias terapêuticas. É, portanto, necessário possuir técnicas experimentais adequadas para a cinética de monitorar e avaliar a capacidade de reparação da membrana celular. Vários métodos em vitro para reparação de membrana de modelagem foram projetados. Uma estratégia envolve lesão mecânica, que pode ser facilitado através da célula a raspar com uma lâmina/navalha pipeta/cirúrgico ou pelo rolamento esferas de vidro sobre as células de16. No entanto, este tipo de lesão mecânica gera lesões maiores e cria um elevado grau de variação no ferimento da pilha, tanto dentro como entre culturas.
Outro método de gerar feridas de membrana é ablação a laser por microscopia de dois fotões. Em contraste com a microscopia confocal laser tradicional que emprega a excitação de fóton único, o laser de dois fotões usa simultaneamente dois fótons de comprimento de onda longa, baixo consumo de energia para facilitar a excitação de um elétron de alta energia17. Este processo não-linear resulta em excitação exclusivamente dentro do plano focal e não ao longo do trajeto da luz toda17 (Figura 1). Este reduzido excitação volume ajuda a minimizar Fotodano quando de imagens ao vivo de células18,19. Pesquisadores, portanto, são capazes de gerar lesões precisas na membrana celular e monitor membrana efectuou em tempo real usando corantes fluorescentes e observar as alterações da intensidade de fluorescência como a ruptura da membrana celular e, depois, regenere.
Esta abordagem tem sido usada repetidamente para estudar a membrana ferindo em vitro e em vivo e em célula de vários tipos de20,21. Por exemplo, a membrana reparar defeitos em fibroblastos e myotubes derivado de dysferlinopathy, os pacientes foram avaliados utilizando esta técnica22,23. Também, única fibras musculares isoladas de ratos foram usadas para monitorar reparo remendo formação13,24,25. O movimento de proteínas fluorescente etiquetados também pode ser observado durante o reparo da membrana em fibras de músculo único9. Além disso, o processo de reparação mecanismos a seguir dois fotões laser ferindo em embriões de peixe-zebra pode ser observado em tempo real na vivo26.
Neste artigo, descrevem uma metodologia para avaliar a dinâmica de reparo da membrana celular em fibroblastos usando dois fotões laser ferindo, embora esta metodologia pode ser aplicada a vários tipos de células com a finalidade de quantificar a membrana plasmática, capacidade de fechamento em vitro. Neste método, as células são incubadas com FM4-64, um corante lipofílico, célula-impermeável que fluoresce rapidamente a como liga-se ao negativamente carregada de fosfolipídios no citoplasma ao entrar na célula através da lesão de membrana (Figura 2&#38; 3). quantificação da fluorescência do corante adjacente à lesão de membrana permite o monitoramento do tempo que leva para a membrana da célula de selar em si. Para exemplificar a utilidade desse método, usamos dysferlinopathy paciente fibroblastos transfectados com plasmídeos dysferlin completos GFP-conjugados (DYSF) para avaliar o resgate de reparo da membrana celular.

<table><tbody><tr><td>Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal</td><td>Bovino Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfato tampolado com solução salina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>35mm pratos com fundo de vidro revestidos de colágeno</td><td>MatTek</td><td>P53GCOL-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Mídia privada de soro</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de transfecção</td><td>Thermo Fisher</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64 Corante</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode' s Sais Solução</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2397</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Carl Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Laser de dois fótons</td><td>Coerente</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio de reparação da membrana celular usando um microscópio de dois fotões laser

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Numerosos insultos fisiopatológicos podem danificar as membranas celulares e, quando combinada com defeitos inatos na reparação da membrana celular ou integridade, podem resultar em doença. Compreender os mecanismos moleculares subjacentes em torno de reparo da membrana celular, portanto, é um objectivo importante para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para doenças associadas à dinâmica disfuncional da membrana celular. Muitos estudos in vitro e em vivo vistos compreender a membrana celular de fechamento em diversos contextos de doença utilizam ablação a laser dois fotões como um padrão para determinar os resultados funcionais após tratamentos experimentais. Neste ensaio, as membranas celulares são sujeitas a ferindo com um laser de dois fotões, que faz com que a membrana da célula, ruptura e tintura fluorescente para se infiltrar na célula. A intensidade da fluorescência dentro da célula em seguida pode ser monitorada para quantificar a capacidade da célula de selar em si. Existem vários métodos alternativos para a avaliação da membrana celular resposta a lesão, bem como a grande variação na laser dois fotões ferindo abordagem em si, portanto, um modelo de célula ferindo unificada beneficamente serviria para diminuir o variação entre estas metodologias. Neste artigo, nós esboçamos um laser simples de dois fotões ferindo o protocolo para a avaliação da membrana celular reparação in vitro em ambos saudáveis e dysferlinopathy paciente fibroblastos células transfectadas com ou sem um plasmídeo dysferlin completos.

Fibroblastos humanos saudáveis, fibroblastos de pacientes não tratados dysferlinopathy e pacientes fibroblastos transfectados com um plasmídeo que contém a sequência de dysferlin completos foram submetidas a dois fotões laser ferindo para avaliar a capacidade de fechamento de membrana em tempo real. Células de fibroblasto humano saudável exibida baixos níveis de ativação de fluorescência FM 4-64 seguindo do laser ferindo e fibroblastos de pacientes não tratados exibiram um alto grau de in...

Membrana celular ferindo através de dois fotões laser é um método amplamente utilizado para avaliar a capacidade de fechamento de membrana e pode ser aplicado a vários tipos de células. Aqui, descrevemos um protocolo para em vitro viver de imagem membrana efectuou em dysferlinopathy paciente células após ablação a laser de dois fotões.

Ensaio de reparação da membrana celular usando um microscópio de dois fotões Laser

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a reparabilidade da membrana plasmática em células de pacientes com distrofia muscular. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na distrofia muscular, como qual é a relação entre uma determinada mutação e a cinética de resselamento da membrana. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a quantificação em tempo real da cinética de resselamento da membrana em células vivas.Comece cultivando células de fibroblastos em um frasco T225 contendo 40 mililitros de meio de crescimento em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Quando a cultura atingir 70 a 80% de confluência, enxágue as células duas vezes com 40 mililitros de PBS por lavagem, seguido da adição de cinco mililitros de 0,05% de tripsina por cinco minutos a 37 graus Celsius. Quando as células se separarem, pare a reação com 40 mililitros de meio de crescimento fresco e semeie dois mililitros de células a uma concentração de 100.000 células por mililitro em placas de fundo de vidro revestidas de colágeno de 35 milímetros para uma incubação noturna a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Adicione 150 microlitros de meio fresco privado

cell-membrane-repair-assay-using-a-two-photon-laser-microscope

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui descritos são protocolos utilizados para visualizar o processo dinâmico de MG53 mediada por reparação de membrana celular em animais inteiros e em nível celular. Estes métodos podem ser aplicados para investigar a biologia das células do plasma resealing membrana e medicina regenerativa.

Visualização de MG53 mediada Repair Membrana Celular Usando In vivo E In vitro Sistemas

Este vídeo descreve a ablação a laser de dois fótons de axônios em uma larva de Drosophila melanogaster e um exemplo de protocolo para induzir lesão e imagem do local da lesão.

Lesão neural induzida por laser de dois fótons: um método para observar a degeneração e regeneração do axônio em larvas de Drosophila

Este vídeo demonstra um ensaio para estudar a eficiência de reselamento da membrana plasmática em células de mamíferos. As células são expostas a uma toxina bacteriana formadora de poros, que forma poros na membrana celular. Na presença de íons de cálcio extracelulares, o poro causa influxo de cálcio, induzindo eventos de resselamento da membrana. A eficiência de reselagem é avaliada usando corante de iodeto de propídio de ligação ao DNA, que só entra nas células sem uma membrana resselada.

Um ensaio baseado em fluorescência in vitro para medir a eficiência de resselamento da membrana plasmática

Imagens ao vivo de células expostas ao corante lipofílico FM1-43 permite a determinação precisa da cinética pelo qual as toxinas formadoras de poros são removidas a partir da membrana plasmática. Este é um ensaio sensível, que pode ser usado para avaliar os requisitos para Ca 2 +, esfingomielinase e outros factores de reparação da membrana plasmática.

Viva Imagem Ensaio para Avaliação das Funções de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; E esfingomielinase na reparação de Pore-formando feridas Tóxicas

O processo de cura de feridas envolve as células tráfico de proteínas específicas e os compartimentos intracelulares para o local da lesão da membrana celular. Este protocolo descreve os ensaios para monitorar esses processos.

Imagens de células Lesão de Membrana e Processos Subcelulares envolvidas no reparo

Os lasers são frequentemente utilizados em estudos sobre a resposta celular a danos no ADN. No entanto, eles gerar lesões cujo espaçamento, de frequência, e colisões com garfos de replicação são raramente caracterizado. Aqui, descrevemos uma abordagem que permite a determinação destes parâmetros com a laser localizada ligações cruzadas intercadeias.

Único Análise Molécula do laser localizadas psoralênica adutos

O objetivo do presente protocolo é descrever como usar o microirradiation do laser para induzir diferentes tipos de danos no DNA, incluindo relativamente simples quebras e danos complexos, para estudar o DNA danos reparação e sinalização fator montagem em locais de dano in vivo .

Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos

Fluorescência confocal laser e microscopia microirradiação oferta ferramentas para indução de dano do ADN e monitoramento da resposta das proteínas de reparo de DNA em áreas selecionadas do sub nucleares. Esta técnica tem significativamente nosso conhecimento avançado de detecção de danos, sinalização e recrutamento. Este manuscrito demonstra essas tecnologias para examinar reparação simples e dupla vertente.

Aplicação de Laser Microirradiação para exame de Single e Double Strand reparação em células de mamíferos

Estudar a cinética de reparação de danos de DNA requer um sistema para induzir lesões em regiões definidas do sub nucleares. Nós descrevemos um método para criar quebras de dupla-hélice localizadas usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com laser 405 nm e fornecer procedimentos automatizados para quantificar a dinâmica dos fatores de reparação para essas lesões.

Investigação de recrutamento de proteína para lesões de DNA usando 405 Nm Laser Microirradiação

Aqui nós descrevemos um alta produtividade baseada em fluorescência do ensaio que mede a membrana plasmática, efectuou a eficiência por meio de análises fluorométrica e da imagem latente em células vivas. Este ensaio pode ser usado para triagem de drogas ou genes-alvo que regulam a membrana plasmática de fechamento em células de mamíferos.

Medição de alto rendimento da membrana plasmática, efectuou a eficiência em células de mamíferos

O método de punção termoplasmônica integra microscopia confocal, pinças ópticas e nanopartículas de ouro para estudar as respostas proteicas durante o reparo da membrana plasmática em células e vesículas unilamelares gigantes. A técnica permite a punção rápida e localizada da membrana, permitindo a identificação de proteínas-chave e seus papéis funcionais na intrincada maquinaria de reparo da membrana plasmática.

Uma Abordagem Termoplasmônica para Investigação do Reparo da Membrana Plasmática em Células Vivas e Membranas Modelo

Aprenda a quantificar a reparação da membrana plasmática em células de pacientes com distrofia muscular usando ablação a laser de dois fótons. Este método permite imagens em tempo real da resselação celular.

Ensaio de reparação da membrana celular usando um microscópio de dois fotões Laser

Explorar mais vídeos