Ensaio de reparação da membrana celular usando um microscópio de dois fotões Laser

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a reparabilidade da membrana plasmática em células de pacientes com distrofia muscular. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na distrofia muscular, como qual é a relação entre uma determinada mutação e a cinética de resselamento da membrana. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a quantificação em tempo real da cinética de resselamento da membrana em células vivas.

Comece cultivando células de fibroblastos em um frasco T225 contendo 40 mililitros de meio de crescimento em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Quando a cultura atingir 70 a 80% de confluência, enxágue as células duas vezes com 40 mililitros de PBS por lavagem, seguido da adição de cinco mililitros de 0,05% de tripsina por cinco minutos a 37 graus Celsius. Quando as células se separarem, pare a reação com 40 mililitros de meio de crescimento fresco e semeie dois mililitros de células a uma concentração de 100.000 células por mililitro em placas de fundo de vidro revestidas de colágeno de 35 milímetros para uma incubação noturna a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Adicione 150 microlitros de meio fresco privado de soro a um tubo de 1,5 mililitro por cultura de transfecção. Em seguida, adicione três microlitros de reagente de transfecção a cada tubo e incube os tubos por pelo menos cinco minutos em temperatura ambiente. Enquanto os tubos estão incubando, adicione 175 microlitros de meio derivado de soro e 3,5 microgramas de DNA de plasmídeo de disferlina a um tubo adicional de 1,5 mililitro por placa.

Em seguida, combine 150 microlitros da solução de DNA do plasmídeo com 150 microlitros do reagente de transfecção em um novo tubo por placa para uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente. Na manhã seguinte, substitua o meio de crescimento por dois mililitros de meio derivado do soro. No final da incubação, distribua uniformemente todos os 300 microlitros de solução de plasmídeo em cada placa e incube as placas por 24 horas na incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, substitua o sobrenadante do plasmídeo por meio de crescimento fresco e retorne as placas à incubadora por mais 24 horas. Para preparar as células para um ensaio de ferimento de dois fótons, enxágue as culturas transfectadas uma vez com um mililitro da solução de Tyrode. Em seguida, adicione um mililitro de solução fresca de Tyrode suplementada com um microlitro de corante FM4-64 2,5 milimolar às células.

Em seguida, usando um microscópio confocal invertido, crie um alvo de 0,2 por dois mícrons no software do microscópio e coloque o alvo na borda da membrana celular de modo que a linha do alvo se sobreponha e fique perpendicular à membrana celular. Selecione um laser de néon de hélio de 543 nanômetros para excitar o sinal de corante FM e um laser de argônio de 488 nanômetros para excitar o sinal GFP e defina a faixa de detecção para 600 a 760 nanômetros e 500 a 550 nanômetros, respectivamente. Em seguida, crie uma série temporal de cinco minutos de varreduras sequenciais de imagens.

Para gerar uma lesão de membrana, use um laser de dois fótons a 820 nanômetros a 15% de potência do laser com 10 iterações para branquear as células 25 segundos após o início da série temporal. Para quantificar a fluorescência do corante FM4-64, use o software para desenhar uma região de interesse de seis por seis mícrons e coloque a região de interesse adjacente ao local da ferida dentro da célula. Em seguida, subtraia o valor de fundo e divida o aumento líquido pelo valor de fluorescência no tempo zero para calcular os valores de fluorescência relativos para cada ponto de tempo.

As células de fibroblastos humanos saudáveis exibem baixos níveis de ativação de fluorescência FM4-64 após ferimento a laser, enquanto os fibroblastos de pacientes não tratados exibem um alto grau de intensidade relativa de fluorescência após a lesão. As células do paciente que foram transfectadas com plasmídeo de disferlina de comprimento total demonstram uma intensidade de fluorescência relativa FM4-64 reduzida em comparação com controles de pacientes não tratados, mas semelhante aos valores de fluorescência observados em controles saudáveis. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as células morrerão lentamente na solução tampão, portanto, trabalhe rapidamente e mude para células novas em intervalos regulares.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como regenerar as lesões de membrana usando um microscópio de dois fótons e como quantificar o resselamento da membrana em tempo real.