Cultivo de células epiteliais de pigmento Retinal em um modelo Ex Vivo da membrana de Bruch humano envelhecido

O objetivo geral deste procedimento experimental é criar uma matriz extracelular ex vivo conhecida como sistema de cultura de membrana de Bruch, para que observe o efeito da membrana de Bruch na sobreposição de células epiteliais pigmentares da retina. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na subbiologia do EPR no campo da etiologia da DMRI, como se as alterações nas membranas de Bruch envelhecidas contribuem para o mau funcionamento das células RPE sobrepostas. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que os pesquisadores isolem a membrana de Bruch nativa de um olho de doador humano de diferentes idades e as usem para estudo proteômico em culturas de células RPE.

Isolar a membrana de Bruch e fazer um sistema de cultura vivo real com danos mínimos à membrana nativa de Bruch é um desafio, mas mostrarei como neste vídeo. Para começar, coloque uma gaze de 1,5 polegada quadrada embebida em DMEM independente de CO2 em um prato de 100 milímetros. Em seguida, coloque o globo ocular na gaze.

Em seguida, use uma lâmina cirúrgica para fazer uma incisão através da esclera três milímetros posterior ao limbo. Em seguida, use uma tesoura de lâmina fina para fazer uma incisão de espessura total e estenda circunferencialmente a incisão em qualquer direção ao redor do olho. Em seguida, remova e descarte o segmento anterior, incluindo a córnea, o cristalino e a íris.

Além disso, descarte o vítreo e a retina. Em seguida, retire cuidadosamente o complexo coróide da membrana de Bruch do RPE da esclera da periferia para o nervo óptico usando uma espátula revestida de Teflon. Isso deve ser feito com muito cuidado para não rasgar o complexo da membrana.

Agora, use uma tesoura cirúrgica fina para fazer quatro incisões radiais na esclera e retire a esclera. Em seguida, corte o explante coróide da membrana de Bruch do nervo óptico e transfira esse explante para um prato de 60 milímetros contendo hidróxido de amônio 0,02 molar em DPBS. Para remover as células nativas do EPR, incube este explante por 20 minutos em temperatura ambiente.

Após a incubação, lave o explante três vezes usando DPBS, prendendo o local do nervo óptico na membrana de Bruch com uma pinça revestida de Teflon enquanto flui a solução ao redor do tecido. Em seguida, flutue o explante, com o lado da laminina voltado para cima em meio livre de dióxido de carbono. Faça quatro incisões na membrana de Bruch e, em seguida, transfira uma membrana hidrofóbica não laminada de PTFE de 65 mícrons de espessura com poros de 0,2 mícron sobre o explante.

Configure-o com a lâmina basal contra a membrana de PTFE. Remova o líquido extra do prato e, em seguida, transfira o conjunto para um sistema de suporte de filtro a vácuo de microanálise de vidro, onde deve ficar em um suporte de vidro frito. Em seguida, evitando cuidadosamente o contato com a lâmina basal, alise as bordas enroladas do lado da coroide usando uma pinça revestida de Teflon.

Agora, liquefaça 15 mililitros de agarose 4% em DPBS e resfrie a 37 graus Celsius. Em seguida, despeje lentamente a agarose sobre o lado coroidal do explante enquanto aplica uma sucção suave para mantê-lo plano. Assim que o gel começar a solidificar, transfira-o com a membrana para um prato de 60 milímetros no gelo.

Deixe o gel solidificar por dois a três minutos e, em seguida, retire a membrana de PTFE. Em seguida, mergulhe o explante em DPBS e armazene-o a quatro graus Celsius até que seja necessário. Ao cultivar o explante em um prato de 60 milímetros forrado com 4% de agarose líquida, faça a membrana de Bruch voltada para cima.

Ao cultivar usando uma placa de 96 poços revestida de poliestireno, coloque o explante de membrana de Bruch envolto em gel em uma folha plana de Teflon com o lado da laminina voltado para cima. Em seguida, usando uma trefina, corte de seis a oito botões de seis milímetros do explante e transfira os botões de tecido para poços carregados com agarose líquida. Para começar, coloque o globo ocular em uma gaze embebida em DPBS como antes.

Em seguida, faça uma incisão circunferencial cinco milímetros abaixo do ponto de contato íris-esclera, a pars plana, no espaço sub-retiniano. Descarte o segmento interno, o humor vítreo e a retina. Em seguida, usando uma pipeta de transferência, lave a ocular com dois a três mililitros de DPBS frio.

No total, lave a ocular três vezes. Em seguida, para dissociar as células do EPR, trate a ocular com tripsina por até 10 minutos. Em seguida, transfira as células RPE tripsinizadas para um tubo de 50 mililitros e, para extinguir a reação, adicione 25 mililitros de meio com FBS a 37 graus Celsius.

Agora, centrifugue o tecido e a solução a 200g por 10 minutos a 24 graus Celsius. Em seguida, ressuspenda o pellet em cinco mililitros de meio completo DMEM com 15%FBS. Agora, conte as células e coloque 15.000 células RPE viáveis em 200 microlitros de meios essenciais mínimos sem soro contendo antibióticos em cada botão da membrana de Bruch na placa de 96 poços.

Cultive as células por pelo menos 24 horas para fixação. Mais tarde, mude suavemente o meio para DMEM completo quente e continue cultivando as células. Usando este protocolo, as membranas de Bruch humanas envelhecidas e doentes podem ser estudadas pelo cultivo de células RPE nelas.

Normalmente, os explantes envelhecidos diminuem a religação das células do EPR. As células RPE cultivadas na membrana de Bruch humana envelhecida também são menos capazes de fagocitar segmentos externos de bastonetes, uma função crítica do RPE. Usando microarrays, verificou-se que a expressão gênica das células RPE é diferente quando as células são cultivadas na membrana de Bruch de indivíduos mais velhos em comparação com as células cultivadas na membrana de indivíduos mais jovens.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar a membrana de Bruch dos olhos de doadores humanos e fazer explantes nos quais as células RPE podem ser cultivadas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente três horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não tocar no lado da laminina do explante de membrana de Bruch com ferramentas de dissecação para evitar danos à superfície.

Após este procedimento, outros métodos, como fagocitose de EPR e estudos de expressão gênica de células RPE, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se a membrana de Bruch de um doador idoso variável ou doadores com degeneração macular relacionada à idade afetará as funções das células RPE sobrepostas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da degeneração macular relacionada à idade explorarem o mecanismo na etiologia da DMRI em um sistema modelo ex vivo de membrana de Bruch.