Um rápido prata coloração protocolo permitindo simples e eficiente deteção de SSR marcadores usando um Gel de Polyacrylamide Non-desnaturação

O objetivo geral deste protocolo é introduzir um método de coloração de prata otimizado para detecção rápida, fácil e de baixo custo de marcadores SSR em géis de poliacrilamida não desnaturantes. A genotipagem rápida de marcadores SSR pode ajudar a responder a questões-chave no campo de pesquisa e aplicação genética, como análise de diversidade genética e seleção assistida por marcadores em programas de melhoramento molecular. As principais vantagens desta técnica é que ela é fácil de executar, leva menos tempo e usa menos reagentes químicos do que outros protocolos para a detecção de marcadores SSR.

Este método evita a fixação, parada e várias etapas de lavagem encontradas nos protocolos convencionais. E requer apenas as duas etapas principais de impregnação e desenvolvimento. Imagens nítidas podem ser produzidas usando este protocolo sem ruído de fundo para a detecção inequívoca de padrões de bandas SSR.

Pode-se rastrear aproximadamente 800 amostras de DNA por dia usando esta técnica e ela tem sido usada com sucesso na pesquisa de tabaco e couve chinesa em flor. Depois de preparar os produtos de PCR e as soluções de gel de acordo com o protocolo de texto, use detergente na água da torneira para lavar um conjunto de placas de vidro e espaçadores seguidos de um enxágue completo com água destilada. Coloque as placas em um escorredor de pratos para secar ao ar.

Dispersar um mililitro de solução de ligante-silano na superfície interior de uma placa de vidro rectangular e secar durante cinco minutos. Em seguida, disperse um mililitro de Repel-silano na superfície interna de uma placa de vidro entalhada com um cotonete e use um lenço de papel para limpar o excesso de solução antes de deixar a placa secar ao ar por cinco minutos. Monte as placas de vidro com espaçadores com a placa entalhada na parte superior.

E use grampos de fundição para prender ambos os lados do conjunto. Em seguida, despeje uma quantidade apropriada de solução de gel de poliacrilamida não desnaturante a 6% em um béquer para o conjunto de placas. Adicione 20 microlitros de TEMED e 200 microlitros de 20% APS fresco e misture delicadamente.

Despeje imediatamente e com cuidado a solução nas placas de vidro montadas ao longo da borda da placa entalhada, preenchendo o espaço quase até o topo. E insira o pente. Em seguida, adicione um pequeno volume de solução de gel sobre o pente e deixe o gel endurecer em temperatura ambiente por 30 minutos.

Quando o gel estiver totalmente polimerizado, remova os grampos de fundição e posicione o conjunto de placas na unidade do tanque de eletroforese com a placa entalhada voltada para o reservatório tampão superior. Use grandes clamps para prender o conjunto de placas à unidade do tanque. Despeje um litro de tampão 0,5 X TBE em cada uma das câmaras superior e inferior.

Em seguida, remova o pente e use uma pipeta ou seringa cheia de tampão para lavar completamente todos os poços. Para executar o gel de poliacrilamida, carregue cerca de um microlitro de produto de PCR em cada poço. Além disso, carregue uma escada de DNA em cada extremidade.

Em seguida, fixe a tampa de segurança na câmara tampão superior. Conecte os cabos à fonte de alimentação, combinando as cores codificadas de vermelho com vermelho e preto com preto. Execute o gel a uma tensão constante de 110 volts até que o corante atinja uma posição definida.

Normalmente, por aproximadamente 70 minutos. Após a eletroforese, abra a válvula e drene o tampão da câmara superior para um béquer grande. Solte o lado clamps e remova a placa do aparelho.

Em seguida, use uma espátula para separar cuidadosamente a placa de vidro entalhada ao longo de um lado e certifique-se de que o gel permaneça preso à outra placa de vidro revestida com Bind-silano. Em seguida, prepare um litro de solução de impregnação fresca dissolvendo 1,5 gramas de nitrato de prata em um litro de água destilada. Em seguida, prepare um litro de solução de revelação fresca dissolvendo 10 gramas de hidróxido de sódio em 900 mililitros de água destilada.

Adicione um mililitro de 37% de formaldeído e use água destilada para ajustar ao volume final de um litro. Com bastante água destilada, enxágue cuidadosamente o gel e a placa de vidro para remover o tampão de eletroforese. Em seguida, coloque a placa com o gel voltado para cima em uma bandeja de plástico e mergulhe o gel em um litro de solução de impregnação.

Agite suavemente a bandeja em uma coqueteleira a 60 RPM por três a quatro minutos. Transfira a placa da solução de impregnação para outra bandeja. Em seguida, use água destilada suficiente para enxaguar a solução de impregnação residual da superfície da placa e do gel duas vezes por três a cinco segundos cada.

A etapa de lavagem do gel após a impregnação é crítica. Lavagem insuficiente minha causa remoção incompleta da solução de impregnação. E resultam em fundo escuro.

Coloque o local com o gel voltado para cima em outra bandeja. Mergulhe a placa em um litro de solução de revelação e agite suavemente a bandeja a 50 RPM por aproximadamente três minutos. Monitore a aparência dos fragmentos de DNA e interrompa o desenvolvimento quando a maior proporção entre o sinal dos fragmentos de DNA e o ruído de fundo for observada.

O tempo de desenvolvimento apropriado é outro passo fundamental. O desenvolvimento excessivo pode resultar em um fundo marrom escuro com uma imagem de baixo contraste de fragmentos de DNA. Enxágue a placa e o gel com água destilada em abundância duas vezes e use papel de seda para secar a placa de gel.

Em seguida, use um scanner e o software apropriado para escanear o gel a 300 DPI e ajustar o brilho e o contraste para obter uma visualização clara das bandas de DNA. Finalmente, pontue o padrão de bandas dos marcadores SSR com base nos tamanhos dos fragmentos de DNA na imagem. Os amplicons de PCR aqui apresentados foram produzidos usando os pares de primers SSR correspondentes em couve chinesa e tabaco em flor.

Após a eletroforese, os géis de poliacrilamida foram corados usando o protocolo de coloração de prata demonstrado neste vídeo. Que detectou inequivocamente os padrões de bandas dos marcadores SSR. Para comparar a eficiência de detecção de diferentes protocolos de coloração de prata, os produtos de PCR dos marcadores SSR foram separados usando PAGE e visualizados usando cinco protocolos de coloração de prata publicados e um sexto método demonstrado neste vídeo.

O protocolo demonstrado aqui teve o menor ruído de fundo e o maior contraste de fragmentos de DNA, de modo que produziu a maior clareza de imagem. Dos seis protocolos testados, o método demonstrado aqui leva menos tempo e requer o menor número de reagentes químicos e etapas do processo. Finalmente, esta figura mostra a sensibilidade do protocolo medida usando uma diluição em série de um marcador de DNA de 50 a 2000 pb em um gel de poliacrilamida não desnaturante de 10 nanogramas por banda na pista um a 9,8 picogramas por banda de DNA na pista 11.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em sete minutos se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar a contaminação cruzada de soluções de impregnação e revelação. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores genotiparem rapidamente os marcadores SSR.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar de forma simples e eficiente os marcadores SSR em um gel de poliacrilamida não desnaturante usando coloração de prata. Não se esqueça de que trabalhar com reagentes químicos pode ser extremamente perigoso e precauções como luvas devem sempre ser usadas durante a realização deste procedimento.