Name: Um rápido prata coloração protocolo permitindo simples e eficiente deteção de SSR marcadores usando um Gel de Polyacrylamide Non-desnaturação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprenda um protocolo otimizado de coloração por prata para detecção rápida de marcadores SSR em géis de poliacrilamida não desnaturantes. Este método simples e econômico reduz o tempo de processamento para apenas sete minutos.

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Este trabalho foi financiado pela Fundação de ciências naturais de Guangdong de China (2015A030313500), a plataforma pesquisa cooperativa internacional chave Provincial e o Major científico pesquisa projeto de Guangdong ensino superior (2015KGJHZ015), a ciência e Plano de tecnologia da administração de monopólio de tabaco de Guangdong (201403, 201705), a ciência e a tecnologia plano de Guangdong de China (2016B020201001), o projecto de formação nacional de inovação para alunos de graduação (201711078001). Menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é exclusivamente com o propósito de fornecer informações específicas e não implica em recomendação ou endosso pelo departamento de agricultura. USDA é um provedor de igualdade de oportunidades e o empregador.

1. preparação de produtos PCR dos marcadores SSR
<ol><li>Preparem-se todos os produtos químicos e reagentes para reações de PCR incluindo modelo DNA (30 ng / µ l), 2 × mistura mestre de PCR (contendo 2 × tampão PCR, 0,4 mM de cada dNTP, 3 mM de MgCl2, 0,1 U / µ l de Taq DNA polimerase e corantes), 10 µ m de cada um para a frente e reverter as primeiras demão e água destilada ou desionizada (dH2O). Nota: Os marcadores SSR, usados no presente estudo foram PT51333 (encaminhar a sequência da primeira demão: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' e a sequência inversa da primeira demão: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') e PT50903 (encaminhar a sequência da primeira demão: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' e inverter a sequência da primeira demão: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ') para o tabaco e CX-43 (encaminhar a sequência da primeira demão: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' e inverter a sequência da primeira demão: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') e CX-157 (encaminhar a sequência da primeira demão: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' e inverter a sequência da primeira demão: 5 '- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3') de repolho chinês de florescência.</li>
	<li>Prepare-se 10 µ l de mistura PCR para amplificação adicionando 2 µ l do modelo de DNA, 5 µ l de 2 × mistura mestre de PCR, 0,2 µ l de cada primer para diante e reverso da primeira demão e 2,6 µ l de dH2O.</li>
	<li>Realizar a reação de amplificação do PCR em um thermocycler com uma etapa inicial de 94 ° C por 5 min, siga por 38 ciclos de 45 s a 94 ° C para desnaturação, 45 s a 55 ° C para recozimento da primeira demão e 1 min a 72 ° C para a extensão e uma etapa da extensão final de 10 min 72 ° C; em seguida, armazene os produtos de PCR a 4 ° C para uso posterior.</li>
</ol>2. preparação de soluções de Polyacrylamide gel de fundição
<ol><li>Preparar 1 L de amortecedor de TBE 5 × 54g de Tris base e ácido bórico 27,5 g dH2O de dissolução, adicionando 20 mL de EDTA 0,5 M (pH 8.0) e ajustar a solução para um volume final de 1 000 mL com dH2O. Nota: Amortecedor de TBE pode ser armazenado em temperatura ambiente por meses.</li>
	<li>Prepare 2 L de amortecedor de TBE 0,5 × adicionando-se 200 mL de amortecedor de TBE × 5 para dH2O até um volume final de 2 L e armazenar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar uma solução de gel de poliacrilamida 6% não-desnaturação dissolver 29 g de biologia molecular grau acrilamida e 1g de biologia molecular grau N, N'-methylenebisacrylamide no amortecedor de TBE 0,5 × até um volume final de 500 mL. Cobrir o frasco de solução com folha de alumínio e loja a 4 ° C para uso posterior. Cuidado: Acrilamida é considerada uma potente neurotoxina e deve ser manipulada com cuidado. Use sempre luvas quando pesando pó e manipulação de soluções que contêm-lo.</li>
	<li>Prepare uma solução de (APS) de persulfato de amónio 20% pela dissolução de 2 g de APS com dH2O até um volume final de 10 mL. Pode ser armazenado a-20 ° C durante meses. Nota: Para sua conveniência, 10 mL da solução APS 20% pode ser aliquotada em 1,5 mL ou 2 mL de tubos de centrífuga de armazenamento-20 ° c. Descongelar e misture bem antes de usar.</li>
	<li>Prepare uma solução diluída vincular-silano dissolvendo 3 µ l de vincular-silano em 0,997 mL de etanol a 95% contendo 0,5% de ácido acético. Pode ser armazenado a 4 ° C durante semanas. Cuidado: Bind-silano é tóxica, use luvas quando manusear a solução e manter o quarto ventilado.</li>
</ol>3. preparação de géis de poliacrilamida para eletroforese
<ol><li>Lavagem de um conjunto de placas de vidro e espaçadores com detergente em água da torneira, seguida por uma lavagem completa com dH2O. ar seco as placas por configuração-los em um prato de cavalete.</li>
	<li>Disperse a 1 mL de solução de vincular-silano na superfície interna de uma placa de vidro retangular e seca por 5 min. Nota: Se a solução vincular-silane não é espalhada uniformemente sobre a superfície da placa, o gel pode ser destacado durante coloração e resultar em um efeito de coloração satisfatório.</li>
	<li>Dispersar a 1 mL de repelir-silano na superfície interna de uma placa de vidro entalhado com um cotonete, limpe o excesso de repelir-silano com papel absorvente e ar seco por 5 min. Nota: Se o repel-silane não revestir a superfície da placa de vidro uniformemente, pode danificar o gel parcialmente descascando.</li>
	<li>Montar as placas de vidro com espaçadores com a placa entalhada no topo e prenda os dois lados da assembleia com braçadeiras de fundição.</li>
	<li>Despeje a quantidade adequada (40 mL) de solução de gel de poliacrilamida 6% não-desnaturação para um copo para o conjunto de placa de largura de 33 cm × 10 cm de altura e espaçador espessura de 1,5 mm, adicionar 20 µ l de tempted (TEMED) e 200 µLfresh 20% APS e misture delicadamente. Nota: A quantidade adequada (40 mL) de solução de gel foi calculada a partir do volume interno das duas placas com espessura de espaçadores (30 cm x 8,5 cm × 0.15 cm). Quanto a quantidade de TEMED e APS para a polimerização do gel, há uma relação padrão de solução de gel TEMED e APS, com base na referência17. A solução de gel descrita acima é armazenada em 4° C. Se a solução de gel é armazenada à temperatura ambiente, 20 µ l de TEMED e 100 µ l de 20% a APS deve ser usado. Misture delicadamente a mistura de solução de gel com uma vara de vidro para evitar bolhas de ar na solução.</li>
	<li>Despeje a solução imediatamente e cuidadosamente para as placas de vidro montado ao longo da borda da placa entalhada, preencher o espaço quase ao topo e inserir o pente. Adicione um pequeno volume de solução de gel sobre o pente. Nota: Mantenha as placas de vidro horizontal para evitar que o gel vazando. Remova quaisquer bolhas com um gancho de bolha, se necessário.</li>
	<li>Permitir que o gel definir por 30 min à temperatura ambiente. Nota: O tempo de polimerização pode mudar com temperaturas de solução de gel e ambiente.</li>
	<li>Depois que o gel é totalmente polimerização, remova os grampos de fundição e posicione a placa de conjunto da unidade do tanque de eletroforese com a placa entalhada virada para o reservatório superior amortecedor, e uso de grampos grandes para anexar a placa definida como a unidade do tanque.</li>
	<li>Despeje 1 litro de amortecedor de TBE 0,5 × em cada um da parte superior e as câmaras inferiores. Retirar o pente e lave todos os poços completamente com buffer usando uma pipeta ou seringa. Nota: Certifique-se que o sanduíche de gel na parte inferior da placa é completamente embebido na reserva sem quaisquer bolhas.</li>
</ol>4. correr géis
<ol><li>Carrega cerca de 1 µ l de produto PCR em cada poço do gel de polyacrylamide. Carrega uma escada de tamanho de DNA de ambos os lados do gel juntamente com amostras de produtos PCR. Fixe a tampa de segurança para a câmara superior do amortecedor.</li>
	<li>Ligar os fios à fonte de alimentação, combinando o código de cores para vermelho e preto para preto. Funcione o gel em uma constante tensão de 110 V, até que a tintura atinja uma posição definida, normalmente para ~ 70 min. Nota: O tempo de tensão e funcionando pode ser ajustado de acordo com o tamanho dos produtos do PCR.</li>
</ol>5. prata coloração para a detecção de marcadores SSR em um não-Gel de poliacrilamida
<ol><li>Após a electroforese, drene o buffer da câmara superior em um copo grande através da válvula. Separar as pinças de lado, retirar as placas do aparelho, cuidadosamente separe a placa de vidro entalhado ao longo de um lado com uma espátula e certifique-se que o gel que permanece ligado à placa de vidro revestido com ligação silano.</li>
	<li>Fazer 1 L de solução de impregnação fresco dissolvendo-se 1,5 g de AgNO3 em 1 L de dH2O. preparar 1 L de solução de desenvolvimento fresco pela dissolução de 10 g de NaOH em 900 mL de dH2O, adicione 1 mL de formol 37% e ajustar até um volume final de 1 L com dH2O. Nota: Usar luvas e lidar com os produtos químicos acima e soluções com cuidado. Não é necessário manter as soluções e as etapas correspondentes com as soluções no escuro.</li>
	<li>Lave cuidadosamente a placa de gel e vidro com amplo dH2O para remover o tampão de eletroforese, em seguida, coloque a placa com o gel virado para cima em uma bandeja de plástico e mergulhe o gel em 1 L de solução de impregnação. Coloque a bandeja em uma coqueteleira.</li>
	<li>Agite a bandeja no 60 r/min. para 3-4 min. Nota: Apertar o tempo pode ser ajustado de acordo com a espessura do gel e a concentração de nitrato de prata na solução de impregnação.</li>
	<li>Mova a placa fora da solução de impregnação e colocá-lo em outra bandeja. Enxágue a solução de impregnação residual fora da superfície da placa e o gel usando amplo dH2O dobro para 3-5 s cada.</li>
	<li>Coloque a placa com o gel para cima, em outra bandeja, mergulhe a placa em 1 L de solução de desenvolvimento, então agite a bandeja em 50 r/min ~ 3 min.. Monitor a aparência do DNA fragmentos e parar o desenvolvimento quando o rácio mais elevado do sinal do DNA de fragmentos para o ruído de fundo é observado (esta etapa leva ~ 3 min).</li>
	<li>Lave a placa e o gel com amplo dH2O duas vezes e secar a placa de gel com um papel absorvente.</li>
	<li>Digitalize o gel usando um scanner apropriado. Uma resolução de 300 dpi dá uma clara visualização dos fragmentos de DNA. O gel também pode ser fotografado usando uma câmera.</li>
	<li>O padrão de bandas de marcadores SSR pode ser marcou com base nos fragmentos de DNA na imagem.</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJiang%2C+GL+%22Plant+breeding+from+laboratories+to+fields%22">Plant breeding from laboratories to fields</a>. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).</li>
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<li>Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+sensitive+method+of+DNA+silver+staining+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).</li>
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<li>Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+method+for+silver-staining+DNA+in+large+numbers+of+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).</li>
<li>Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+way+to+detect+small+polymorphic+bands+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Data%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants.</a> Genome Data. 5, 218-222 (2015).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+and+effective+silver+staining+protocol+for+detection+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments.</a> Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).</li>
<li>Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. <a target="_blank" href="https://scholars.opb.msu.edu/en/publications/a-low-cost-high-throughput-polyacrylamide-gel-electrophoresis-sys-3">A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers.</a> Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).</li>
<li>Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microsatellite+markers+in+eastern+white+pine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Characterization of microsatellite markers in eastern white pine.</a> Genome. 39, PMID: 8983182 1102-1108 (1996).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

A lavagem do gel após a impregnação é uma etapa crítica. Volume de tempo e água de lavagem insuficiente pode causar a remoção incompleta de solução de impregnação na superfície da placa e o gel e resultar em um fundo escuro. O tempo de desenvolvimento adequado é mais um passo chave, desenvolvimento excessivo pode resultar em um fundo marrom escuro com imagem de baixo contraste de fragmentos de DNA. Além disso, a etapa de impregnação afeta significativamente coloração eficiência de fragmentos de DNA. Apesar de estender o ...

O desenvolvimento de marcadores baseados em PCR revolucionou a ciência da genética vegetal e de reprodução1. Sequência simples repetição (SSR) marcadores são entre os marcadores de DNA mais usados e mais versátil. Sua cobertura ampla do genoma, abundância, especificidade do genoma e repetibilidade são alguns dos méritos de marcadores SSR, além de sua herança codominant para a detecção de genótipos homozigóticos2. Vários estudos utilizaram marcadores SSR para investigar a diversidade genética, rastrear ascendência, construir mapas genéticos de ligação e mapear os genes para características economicamente importantes,3,4.
Produtos PCR dos marcadores SSR comumente são separados usando electroforese de agarose ou gel de poliacrilamida e depois visualizadas com coloração de prata ou sob luz UV, após coloração com brometo de etídio. Coloração prata de fragmentos de DNA em gel de poliacrilamida é mais sensível do que a outra coloração métodos5,6 e tem sido amplamente utilizada para detectar os fragmentos do ADN como marcadores SSR7.
Como muitas técnicas de laboratório biológico, prata coloração dos géis de poliacrilamida constantemente melhorou desde o seu primeiro sendo relatado como uma técnica de visualização do fragmento em 19798. A técnica foi modificada inicialmente para a deteção de fragmentos de DNA por Bassam et al 6 em 1991 e depois aperfeiçoado por Sanguinetti e colegas de trabalho9 em 1994. O método foi otimizado ainda mais no passado poucas décadas6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. no entanto, a maioria dessas versões atualizadas dos protocolos ainda tem alguns inconvenientes como alta demanda técnica e longo tempo para fixação de processamento e montagem de6, que limitam a aplicação destes protocolos7, 11. Um protocolo ideal que combina baixo custo com alta eficácia da detecção de fragmento de DNA é urgentemente necessária para aplicação rotineira de prata coloração em pesquisas biológicas.
Além disso, gel de poliacrilamida podem ser dividido em gel de poliacrilamida desnaturação e não-desnaturação, e ambos podem ser usados para a detecção de marcadores SSR, usando o método de coloração de prata. O efeito e a resolução dos quais não diferem significativamente, mas não-desnaturação géis de poliacrilamida são mais fáceis de processo e tomar menos tempo16.
Com base na pesquisa anterior15, do atual estudo tem como objetivo descrever uma otimizado prata que mancha o protocolo em detalhe para a deteção rápida, fácil e baixo custo de marcadores SSR em gel de poliacrilamida não-desnaturação.

<table><tbody><tr><td>Mistura mestra de PCR (Green Taq Mix)</td> <td>Vazyme Biotech Co. Ltd, China</td><td>#P131-03</td><td></td></tr><tr><td>50-2000 bp DNA Ladder</td><td>Bio-Rad, EUA</td> <td># 170-8200</td><td></td></tr><tr><td>DL500 Marcador de DNA</td><td>Takara Bio Inc., Japão</td><td>#3590A</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td> <td># 77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td> <td># 10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na2</td><td>Guangzhou Fábrica de Reagentes Químicos, China</td><td>#6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td><td>#79-06-1</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-metileno-bis-acrilamida</td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td><td>#110-26-9</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametiletilenodiamina</td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td><td>#110-18-9</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Guangzhou Reagente Químico Fábrica, China</td> <td># 7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Bind-silano</td><td>Solarbio Pequim, China</td><td>#B8150</td><td></td></tr><tr><td>AgNO3</td><td>Sinopharm Reagente Químico Beijing Co., Ltd, China</td> <td># 7761-88-8</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Tianjin DaMao Reagente Químico Fábrica, China</td> <td># 50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Guangzhou Fábrica de Reagentes Químicos, China</td> <td># 1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Guangzhou Fábrica de Reagentes Químicos, China</td> <td># 64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Tianjin DaMao Fábrica de Reagentes Químicos, China</td> <td># 497-19-8</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Guangzhou Fábrica de Reagentes Químicos, China</td> <td># 64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>HNO3</td><td>Guangzhou Fábrica de Reagentes Químicos, China</td><td>#7697-37-2</td><td></td></tr><tr><td>Na2S2O3.5H2O</td><td>Sinopharm Reagente Químico Beijing Co., Ltd, China</td><td>#10102-17-7</td><td></td></tr><tr><td>Eriochrome preto T(EBT)</td><td>Tianjin DaMao Reagente Químico Fábrica, China</td><td>#1787-61-7</td><td></td></tr><tr><td>bandeja plástica</td><td>Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd,</td> <td>China-TS-1</td><td></td></tr> <tr><td>Shaker</td><td>Qilinbeter JiangSu,</td> <td>China-BenQ</td><td></td></tr> <tr><td>M800 Scanner</td><td>BenQ,</td><td></td> China-DYY-6C <td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação</td><td>Beijing Liuyi Instrument Factory,</td> <td>China-High</td><td></td></tr> <tr><td>em sistemas de gel verticais, JY-SCZF</td><td>Pequim Tunyi Electroforese Co., Ltd, China</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

um rápido prata coloração protocolo permitindo simples e eficiente deteção de ssr marcadores usando um gel de polyacrylamide non-desnaturação

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Repita sequência simples (SSR) é um dos marcadores mais eficazes utilizados na pesquisa genética vegetal e animal e programas de reprodução molecular. Coloração de prata é um método amplamente usado para a detecção de marcadores SSR em gel de poliacrilamida. No entanto, os protocolos convencionais para coloração de prata são tecnicamente exigente e demorado. Como muitos outro laboratório biológico técnicas, prata, protocolos de coloração foram constantemente otimizadas para melhorar a eficiência da deteção. Aqui, nós relatamos um método que reduz custos de reagente e aprimora a clareza de resolução e imagens de deteção de coloração de prata simplificada. O novo método requer duas etapas principais (impregnação e desenvolvimento) e três reagentes (formol, hidróxido de sódio e nitrato de prata) e apenas 7 minutos de processamento para um gel de poliacrilamida não-desnaturação. Comparado com protocolos relatados anteriormente, este novo método é mais fácil, mais rápido e usa menos reagentes químicos para a deteção de SSR. Portanto, esta prata simples, barata e eficaz que mancha o protocolo beneficiará mapeamento genético e reprodução assistida por marcador, por uma geração rápida de dados marcador SSR.

Os PCR amplicons foram produzidos usando os pares de cartilha SSR correspondentes em repolho chinês de florescência e tabaco. Após a eletroforese, o gel de poliacrilamida foram corado usando a prata acima que mancha o protocolo, que inequivocamente detectado os padrões de bandas de marcadores SSR (Figura 1).
Para comparar a eficiência de deteção de prata diferente protocolos de coloração, produtos P...

Aqui, nós relatamos uma prata simples e de baixo custo que mancha o protocolo que requer apenas três reagentes e 7 min de processamento e é apropriado para a geração rápida de dados do SSR de alta qualidade em análise genética.

Um rápido prata coloração protocolo permitindo simples e eficiente deteção de SSR marcadores usando um Gel de Polyacrylamide Non-desnaturação

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

O objetivo geral deste protocolo é introduzir um método de coloração de prata otimizado para detecção rápida, fácil e de baixo custo de marcadores SSR em géis de poliacrilamida não desnaturantes. A genotipagem rápida de marcadores SSR pode ajudar a responder a questões-chave no campo de pesquisa e aplicação genética, como análise de diversidade genética e seleção assistida por marcadores em programas de melhoramento molecular. As principais vantagens desta técnica é que ela é fácil de executar, leva menos tempo e usa menos reagentes químicos do que outros protocolos para a detecção de marcadores SSR.Este método evita a fixação, parada e várias etapas de lavagem encontradas nos protocolos convencionais. E requer apenas as duas etapas principais de impregnação e desenvolvimento. Imagens nítidas podem ser produzidas usando este protocolo sem ruído de fundo para a detecção inequívoca de padrões de bandas SSR.Pode-se rastrear aproximadamente 800 amostras de DNA por dia usando esta técnica e ela tem sido usada com sucesso na pesquisa de tabaco e couve chinesa em flor. Depois de preparar os produtos de PCR e as soluções de gel de acordo com o protocolo de texto, use detergente na água da torneira para lavar um conjunto de placas de vidro e espaçadores seguidos de um enxágue completo com água destilada. Coloque as placas em um escorredor de pratos para secar ao ar.Dispersar um mililitro de solução de ligante-silano na superfície interior de uma placa de vidro rectangular e secar durante cinco minutos. Em seguida, disperse um mililitro de Repel-silano na superfície interna de uma placa de vidro entalhada com um cotonete e use um lenço de papel para limpar o excesso de solução antes de deixar a placa secar ao ar por cinco minutos. Monte as placas de vidro com espaçadores com a placa entalhada na parte superior.E use grampos de fundição para prender ambos os lados do conjunto. Em seguida, despeje uma quantidade apropriada de solução de gel de poliacrilamida não desnaturante a 6% em um béquer para o conjunto de placas. Adicione 20 microlitros de TEMED e 200 microlitros de 20% APS fresco e misture delicadamente.Despeje imediatamente e com cuidado a solução nas placas de vidro montadas ao longo da borda da placa entalhada, preenchendo o espaço quase até o topo. E insira o pente. Em seguida, adicione um pequeno volume de solução de gel sobre o pente e deixe o gel endurecer em temperatura ambiente por 30 minutos.Quando o gel estiver totalmente polimerizado, remova os grampos de fundição e posicione o conjunto de placas na unidade do tanque de eletroforese com a placa entalhada voltada para o reservatório tampão superior. Use grandes clamps para prender o conjunto de placas à unidade do tanque. Despeje um litro de tampão 0,5 X TBE em cada uma das câmaras superior e inferior.Em seguida, remova o pente e use uma pipeta ou seringa cheia de tampão para lavar completamente todos os poços. Para executar o gel de poliacrilamida, carregue cerca de um microlitro de produto de PCR em cada poço. Além disso, carregue uma escada de DNA em cada extremidade.Em seguida, fixe a tampa de segurança na câmara tampão superior. Conecte os cabos à fonte de alimentação, combinando as cores codificadas de vermelho com vermelho e preto com preto. Execute o gel a uma tensão constante de 110 volts até que o corante atinja uma posição definida.Normalmente, por aproximadamente 70 minutos. Após a eletroforese, abra a válvula e drene o tampão da câmara superior para um béquer grande. Solte o lado clamps e remova a placa do aparelho.Em seguida, use uma espátula para separar cuidadosamente a placa de vidro entalhada ao longo de um lado e certifique-se de que o gel permaneça preso à outra placa de vidro revestida com Bind-silano. Em seguida, prepare um litro de solução de impregnação fresca dissolvendo 1,5 gramas de nitrato de prata em um litro de água destilada. Em seguida, prepare um litro de solução de revelação fresca dissolvendo 10 gramas de hidróxido de sódio em 900 mililitros de água destilada.Adicione um mililitro de 37% de formaldeído e use água destilada para ajustar ao volume final de um litro. Com bastante água destilada, enxágue cuidadosamente o gel e a placa de vidro para remover o tampão de eletroforese. Em seguida, coloque a placa com o gel voltado para cima em uma bandeja de plástico e mergulhe o gel em um litro de solução de impregnação.Agite suavemente a bandeja em uma coqueteleira a 60 RPM por três a quatro minutos. Transfira a placa da solução de impregnação para outra bandeja. Em seguida, use água destilada suficiente para enxaguar a solução de impregnação residual da superfície da placa e do gel duas vezes por três a cinco segundos cada.A etapa de lavagem do gel após a impregnação é crítica. Lavagem insuficiente minha causa remoção incompleta da solução de impregnação. E resultam em fundo escuro.Coloque o local com o gel voltado para cima em outra bandeja. Mergulhe a placa em um litro de solução de revelação e agite suavemente a bandeja a 50 RPM por aproximadamente três minutos. Monitore a aparência dos fragmentos de DNA e interrompa o desenvolvimento quando a maior proporção entre o sinal dos fragmentos de DNA e o ruído de fundo for observada.O tempo de desenvolvimento apropriado é outro passo fundamental. O desenvolvimento excessivo pode resultar em um fundo marrom escuro com uma imagem de baixo contraste de fragmentos de DNA. Enxágue a placa e o gel com água destilada em abundância duas vezes e use papel de seda para secar a placa de gel.Em seguida, use um scanner e o software apropriado para escanear o gel a 300 DPI e ajustar o brilho e o contraste para obter uma visualização clara das bandas de DNA. Finalmente, pontue o padrão de bandas dos marcadores SSR com base nos tamanhos dos fragmentos de DNA na imagem. Os amplicons de PCR aqui apresentados foram produzidos usando os pares de primers SSR correspondentes em couve chinesa e tabaco em flor.Após a eletroforese, os géis de poliacrilamida foram corados usando o protocolo de coloração de prata demonstrado neste vídeo. Que detectou inequivocamente os padrões de bandas dos marcadores SSR. Para comparar a eficiência de detecção de diferentes protocolos de coloração de prata, os produtos de PCR dos marcadores SSR foram separados usando PAGE e visualizados usando cinco protocolos de coloração de prata publicados e um sexto método demonstrado neste vídeo.O protocolo demonstrado aqui teve o menor ruído de fundo e o maior contraste de fragmentos de DNA, de modo que produziu a maior clareza de imagem. Dos seis protocolos testados, o método demonstrado aqui leva menos tempo e requer o menor número de reagentes químicos e etapas do processo. Finalmente, esta figura mostra a sensibilidade do protocolo medida usando uma diluição em série de um marcador de DNA de 50 a 2000 pb em um gel de poliacrilamida não desnaturante de 10 nanogramas por banda na pista um a 9,8 picogramas por banda de DNA na pista 11.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em sete minutos se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar a contaminação cruzada de soluções de impregnação e revelação. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores genotiparem rapidamente os marcadores SSR.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar de forma simples e eficiente os marcadores SSR em um gel de poliacrilamida não desnaturante usando coloração de prata. Não se esqueça de que trabalhar com reagentes químicos pode ser extremamente perigoso e precauções como luvas devem sempre ser usadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

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Um protocolo otimizado para a mobilidade eletroforética ensaio de desvio usando oligonucleotídeos Infrared corante fluorescente-etiquetados

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Protocolo do laboratório para análises genéticas de conteúdo intestino de rDNA usando de macroinvertebrados aquáticos grupo-específicos Primers

Este método permite coloração seletiva e quantificação de DNA em géis embebendo o gel em um SYBR Green eu / Nitro azul tetrazólio solução e então exposto à luz solar ou uma fonte de luz azul. Isto produz um precipitado visível e não requer quase nenhum equipamento, tornando-a ideal para uso em campo.

Método baseado na precipitação de Formazan induzida pela exposição à luz azul de coloração de DNA

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado descrevendo uma fluorescente nova técnica para detecção de proteínas totais em gel de poliacrilamida de coloração. O protocolo utiliza uma sonda de excitante prata íon-específicos de fluorescência, que detecta Ag+-complexos de proteínas e elimina determinadas limitações de manchas de prata cromogênica tradicionais.

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Um rápido prata coloração protocolo permitindo simples e eficiente deteção de SSR marcadores usando um Gel de Polyacrylamide Non-desnaturação (Vídeo) | JoVE Journal

Um rápido prata coloração protocolo permitindo simples e eficiente deteção de SSR marcadores usando um Gel de Polyacrylamide Non-desnaturação

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