O Lambda selecione cII sistema de deteção de mutação

O objetivo geral deste protocolo é visualizar procedimentos passo a passo envolvidos no ensaio de mutação Lambda Select cII em células cultivadas de roedores transgênicos ou nos animais correspondentes tratados com agentes químicos e físicos de interesse. Este método de teste pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da pesquisa de mutação, como: um composto de teste é mutagênico? E se sim, quão potente é um mutagênico?

Induz mutações específicas de sequência? A principal vantagem dessa técnica é que ela é mínima para praticamente qualquer composto de teste. O método pode ser utilizado para testes de mutagenicidade em células de mamíferos utilizando um gene repórter cromossomicamente integrado.

Para constituir uma única reação de empacotamento, adicione cinco microgramas de DNA genômico em um tubo de microcentrífuga contendo a primeira mistura de reação. Em seguida, incube o tubo a 30 graus Celsius por 90 minutos. Após a incubação, adicione 12 microlitros da segunda mistura de reação ao tubo e deixe por mais 90 minutos a 30 graus Celsius.

Após 90 minutos, adicione 1,1 mililitros de tampão SM ao tubo. Em seguida, agite vigorosamente o tubo com o DNA embalado em temperatura ambiente por cerca de 10 segundos. Dê rapidamente um giro de pulso na microcentrífuga.

Em seguida, deixe o tubo no gelo até o uso. Em seguida, adicione 50 microlitros de clorofórmio para cada mililitro de DNA empacotado. Se a amostra não for processada no mesmo dia, faça um vórtice suave da amostra e armazene-a a quatro graus Celsius por até duas semanas.

Prepare 16 tubos de fundo redondo estéreis e 16 placas de ágar TB1 para uma única amostra de DNA embalada. Use dez tubos para triagem e seis para titulação. Em seguida, alíquota de 300 microlitros de cultura de revestimento G1250 em cada tubo inferior redondo.

Em seguida, para titular, adicione 10 microlitros de DNA empacotado a 990 microlitros de tampão SM e diluição 1:100. Em seguida, vórtice a amostra. Adicione 20 ou 100 microlitros da solução de DNA 1:100 a cada um dos três tubos de título 20 ou 100, respectivamente.

Para fins de triagem, adicione 100 microlitros da amostra de DNA embalada não diluída a cada um dos 10 tubos de triagem. Processe todos os 16 tubos de titulação e peneiramento. Vortex os tubos por 10 segundos para misturar os componentes.

Em seguida, incube os tubos em temperatura ambiente por 30 minutos para que a E.coli hospedeira absorva os fagos. Em seguida, adicione 2,5 mililitros de ágar TB1 fundido. Mantenha esses 55 graus Celsius para os tubos de titulação e triagem apropriados.

Após a adição, bata imediatamente os tubos suavemente. Agora, despeje o ágar TB1 no título apropriado ou na placa de ágar TB1 de peneiramento. Deixe as placas repousarem por 15 a 30 minutos em temperatura ambiente.

Assim que o ágar solidificar, inverter e deixar todas as 10 placas de peneiramento na incubadora estacionária a 24 graus Celsius por 46 a 48 horas. Deixe as seis placas de titulação restantes em uma incubadora estacionária a 37 graus Celsius durante a noite ou um dia. Após a incubação a 37 graus Celsius, conte o número de placas formadas em todas as 3 placas de titulação 20 e titulação de 100

Após a incubação a 24 graus Celsius, conte o número de placas formadas nas 10 placas de triagem. Para verificar as placas mutantes putitivas, retire o núcleo da placa com uma ponta de pipeta estéril de diâmetro largo. Em seguida, transfira a placa para um tubo de microcentrífuga estéril cheio de 500 microlitros de tampão SM estéril.

Em seguida, incubar o tubo de microcentrífuga à temperatura ambiente durante pelo menos duas horas à temperatura ambiente. Em seguida, misture um microlitro da solução de fago tubular com 200 microlitros da cultura de plaqueamento G1250 em um tubo inferior redondo estéril. Em seguida, incube a mistura em temperatura ambiente por 30 minutos.

Após 30 minutos, coloque a solução de fago tubular em 2,5 mililitros de ágar TB1 fundido e incube a 24 graus Celsius por 46 a 48 horas. Quando as placas secundárias estiverem visíveis, use uma ponta de pipeta para pegar uma única placa mutante Lambda cII bem isolada. Transfira a placa para um tubo de microcentrífuga cheio de 25 microlitros de água bidestilada em pipeta várias vezes.

Deixe o tubo em água fervente por cinco minutos. Em seguida, centrifugue o tubo a 18.000 vezes G por três minutos à temperatura ambiente. Imediatamente após a centrifugação, transferir 10 microlitros do sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga contendo 40 microlitros da mistura principal de PCR.

Após a amplificação por PCR, purificar o produto para-amplificado de base 432 com o gene cII e suas regiões flanqueadoras incorporadas usando o kit de purificação por PCR. Em seguida, sequencie o transgene cII usando um analisador de DNA para detectar as mutações. As placas obtidas nas placas do título 20 e do título 100 são claramente visíveis segurando-as ao lado de uma caixa de luz branca e contra um fundo escuro.

Aqui, o gráfico de barras descreve a potência mutagênica de vários produtos químicos nos compostos físicos testados. Isso é feito analisando a extensão do aumento na frequência relativa do mutante cII isolado dos blastos de fibras embrionárias de camundongos. O gráfico de barras mostra todos esses reagentes de teste mostrando um aumento estatisticamente significativo na frequência do mutante cII.

Em seguida, são demonstrados os espectros de mutação do transgene cII nos blastos de fibras embrionárias de camundongos irradiados com UVB. O gráfico de pizza mostra um aumento significativo na frequência relativa da transição de citidina para timidina única ou em tandem nos dinucleotídeos de pirimidina quando comparado ao controle. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em oito a dez horas se for executada corretamente, excluindo os tempos de preparação para placa de estrias bacterianas em cultura.

No sequenciamento de DNA, após a pontuação dos mutantes cII. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a análise de mutação de um composto de teste em um sistema modelo in vitro.