Name: Fazendo, testando e usando potássio íon seletivo microeletrodos em fatias de tecido do cérebro de um adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprenda a fabricar, calibrar e usar microeletrodos seletivos de íons de potássio em fatias de hipocampo de camundongo adulto. Este método permite medir dinâmicas de concentração de potássio com alta precisão e confiabilidade.

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O laboratório de Khakh foi apoiado pelo NIH MH104069. O laboratório Mody foi apoiado pelo NIH NS030549. J.C.O. graças a Grant(NS058280) de formação do NIH T32 Neural microcircuitos.

Todos os animais de experimentos foram conduzidos em conformidade com o Instituto Nacional de saúde-guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê de pesquisa Animal do Chanceler a Universidade da Califórnia, Los Angeles. Todos os ratos foram alojados com comida e água disponível ad libitum em um ambiente de claro-escuro de 12 h. Todos os animais eram saudáveis sem alterações comportamentais óbvias, não estavam envolvidos em estudos anteriores e foram sacrificados durante o ciclo de luz. Dados de experimentos foram coletados de ratos adultos (6-8 semanas de idade para todos os experimentos).
1. preparação de microeletrodos seletivas K+
<ol><li>Silanização de vidro de borosilicato<ol>
<li>Remova o suficiente capilares de vidro da embalagem e coloque em um tubo cónico de 50 mL. Encha o tubo cônico para cima com eletrodos de 1m HCl. lavagem com agitação suave em HCl durante a noite ou durante um período mínimo de 6 horas.</li>
		<li>Brevemente, enxágue capilares com etanol a 70% e depois seque completamente a 100-120 ° C por 6 a 8 horas. Loja capilares lavados em recipientes com dessecante de sulfato de cálcio anidro por até 4 semanas antes de nova utilização.</li>
		<li>Antes da silanização, puxe os capilares para uma ponta fina usando um extrator de microeletrodos. Os microeletrodos que usamos são cerca de 2 a 5 mícrons de diâmetro. Sempre lidar com capilares lavados com luvas, como óleos de pele podem interferir com a silanização.</li>
		<li>Colocar microeletrodos para um recipiente de vidro para que os eletrodos são elevados da parte inferior para evitar a ruptura de ponta. Corrigi os microeletrodos ao contêiner usando fita de autoclave ou similar de fita adesiva.</li>
		<li>Remova aproximadamente 0,5 mL de solução de silanização 5% diclorodimetilsilano (DDS) do seu contêiner usando o método de substituição de nitrogênio (ver Figura 2). Encha um balão com gás de nitrogênio e anexar uma seringa ou tubo e agulha para o balão. Inserir a agulha em recipiente DDS enquanto elaboração de DDS para uma seringa separada através de uma agulha mais longa.</li>
		<li>Aplicar a solução de silanização gota a gota as dicas das pipetas e cubra imediatamente. Coloque o recipiente segurando os microeletrodos com solução de silanização em um forno de laboratório (170-180 ° C) pré-aquecido por 10-12 horas ou a 200-220 ° C por 30 minutos</li>
		<li>Após a incubação, desligar o forno e, em seguida, retire a placa do forno. Tenha cuidado ao retirar a placa da incubadora, como é extremamente quente. Coloque a placa em um banco na temperatura ambiente por 10-15 minutos para permitir que o vidro esfriar.</li>
		<li>Remova a placa (usando uma lâmina de navalha ou lâmina de bisturi para cortar a fita) os microeletrodos e colocá-los em um recipiente hermético preenchido dessecante. Microeletrodos silanizada mantidos livres de umidade podem ser usados por até 1 semana após silanização.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aprontar os eléctrodos<ol>
<li>Prepare uma solução stock de K+ ionóforo cocktail: valinomicina de 5% p/v, 93% v/v 1,2-dimetil-3-nitrobenzeno, potássio 2% w/v tetrakis(4-chlorophenyl) borato11. Esta solução é uma cor amarela fraca. Mantenha-se em um recipiente hermético, opaco em temperatura ambiente. Se armazenado corretamente esta solução pode durar muitos meses.</li>
		<li>Prepare uma solução stock de 10 mM HEPES buffer 300 mM NaCl em pH 7,4. Fixe o eletrodo em uma braçadeira e aterre com o NaCl no buffer usando uma ponta de micropartículas de 28G conectada a uma seringa. Observe que a solução salina atingiu o fim da ponta de microeletrodos. Confirme que o microeléctrodo é livre de grandes bolhas que podem interferir com o fluxo da corrente.</li>
		<li>Quebre a ponta do eletrodo de aproximadamente 10-20 µm de largura, utilizando o lado sem corte de um bisturi ou lâmina de barbear.</li>
		<li>Utilizando uma micropipeta, aplica uma gota pequena (~0.1 µ l) do ionóforo K+ perto da ponta dos microeletrodos. Se o eletrodo foi devidamente silanizada a gota será absorvida na ponta quebrada. Preenchimento do eletrodo para 1-2 mm com o ionóforo K+ e remove o excesso usando lenços de papel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. calibração de microeletrodos seletivas K+
<ol><li>Preparação das soluções de calibração<ol>
<li>Prepare soluções de diferentes concentrações de KCl em osmolaridade igual artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF) substituindo NaCl por KCl. Usamos a 0.1, 1, 4.5, 10 e 100 mM K+ ACSF, para calibração de eletrodos. As receitas para essas soluções de calibração são listadas na tabela 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Produto químico</td>
			<td>MW</td>
			<td rowspan="2">final mM</td>
			<td rowspan="2">0,1 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">1 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">4.5 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">10 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">100 mM [K +]</td>
		</tr>
<tr>
<td>(g / mol)</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>varia</td>
			<td>1,51 g</td>
			<td>1,50 g</td>
			<td>1,44 g</td>
			<td>1,4 g</td>
			<td>0,345 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>Estoque de 1 M</td>
			<td>varia</td>
			<td>20 µ l</td>
			<td>200 µ l</td>
			<td>900 µ l</td>
			<td>2 ml</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>Estoque de 1 M</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="5">400 µ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>Estoque de 1 M</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="5">200 µ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>119.98</td>
			<td>1.2</td>
			<td colspan="5">0,29 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>84.01</td>
			<td>26</td>
			<td colspan="5">g 0,437</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-glicose</td>
			<td>180.16</td>
			<td>10</td>
			<td colspan="5">0,360 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Água</td>
			<td colspan="7">QS 200ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. Soluções de calibração de potássio
<ol start="2"><li>Calibração de microeletrodos<ol>
<li>Bolha todas as soluções com 95% O25% CO2 pelo menos 20 minutos antes de começar o experimento. Começar a perfusing o banho com 4,5 mM [K+] ACSF a uma taxa de 3 mL por minuto. Coloque o elétrodo seletivo do K+ no eléctrodo anexado para o eletrodo headstage sobre o manipulador. Este headstage é conectado a um amplificador adequado. Introduza a ponta do eletrodo o perfusato de banho.</li>
		<li>Certifique-se o eléctrodo de terra de Ag/AgCl é banhado na mesma solução e que o fluxo é constante. Aplicar soluções de calibração, de forma gradual e gravar as alterações de potenciais em mV, do outro lado da ponta do eletrodo. Esperar que o potencial na ponta do eletrodo para atingir um valor estável antes de mudar para a próxima solução</li>
		<li>Medir a mudança de tensão de estado estacionário em resposta a aplicação de soluções de calibração, a ponta do eletrodo. Confirmar que o declive da resposta do eletrodo é pelo menos 52 e não maior que 58 mV por registro de mudança em [K+].</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparação de fatias de cérebro Hippocampal aguda
<ol><li>Preparação de soluções de fatia<ol>
<li>Preparar a sacarose 500ml corte solução composta de: sacarose 194 mM, 30 mM de NaCl, 4,5 mM KCl, D-glicose, 1 mM MgCl2de 10 mM, 1,2 mM NaH2PO4e 26 mM NaHCO3, 290-300 mOsm, saturado com 95% O2 e 5% de CO2.</li>
		<li>Prepare-se 1-2 litros de solução de gravação (ACSF) compostos por: 124 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10mm D-glicose, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4e 26 mM NaHCO3; pH 7.3-7.4 (depois da subida), 290-300 mOsm, saturado com 95% O2 e 5% de CO2. Encha um copo contendo uma câmara de titular de fatia do cérebro com solução de gravação e mantém-na 32-34 ° C. Encha a câmara de vibratome com lama gelada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de fatia aguda<ol>
<li>Anestesia profundamente um mouse, colocando-o em uma redoma de vidro pré-carregada com 2-3 mL isoflurano. Verificar se há reflexo pitada de dedo do pé e se não-responsivos, decapitá-lo usando um par de tesouras afiadas ou guilhotina como seu protocolo animal exige rapidamente.</li>
		<li>Faça uma incisão de 2-3 cm, usando tesouras da porção caudal do crânio para cortar o couro cabeludo ao longo da linha mediana. Enquanto manualmente retraindo o couro cabeludo, fazer duas 1cm horizontal incisões do foramen magnum ao longo dos lados do crânio. Em seguida, usando tesouras bem, corte uma incisão do comprimento do crânio, ao longo da linha mediana da parte posterior do crânio ao nariz.</li>
		<li>Usando a pinça bem inserida perto da linha mediana, retraia o incisão no crânio em duas partes. Extrair o cérebro de rato do crânio e usar uma lâmina para remover o cerebelo e os bulbos olfatórios, respectivamente localizadas na porção caudal e rostral do cérebro. Estes podem ser identificados por grandes fissuras, que separação-las do córtex.</li>
		<li>Monte o bloco de cérebro a bandeja vibratome com super cola. Encha a bandeja vibratome com solução de corte fria como o gelo.</li>
		<li>Seções de tecido sobre o plano coronal em 300 µm de espessura de corte. Geralmente podem ser coletadas 6 fatias hippocampal coronais.</li>
		<li>Depois de cada seção é cortada, transferir imediatamente as fatias para a fatia segurando copo aquecido para 32-34° C. Manter as seções nesta temperatura durante 20 minutos antes de retirar o béquer contendo as seções e coloque isto em temperatura ambiente pelo menos 20-30 minutos antes da gravação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. medida da dinâmica evocado eletricamente K+ 
<ol><li>Configurando a preparação de fatia<ol>
<li>Delicadamente, coloque a fatia do cérebro na banheira com uma pipeta Pasteur e suavemente, segure-o no lugar com uma harpa de platina com cordas de nylon.</li>
		<li>Certifique-se as pontas do eletrodo bipolar estimulante são paralelas um ao outro e estão nivelados com o avião da fatia. Lentamente, ao longo de 6-7 segundos, inserir os eletrodos CA3 stratum radiatum aproximadamente 40-50 µm fundo para estimular colaterais de Schaffer. Em secções coronais, CA3 pode ser aproximadamente identificada como parte da lateral adequada para a camada de células grânulo no genu hippocampal, hipocampo com o estrato radiatum caindo ventral e medial à camada de célula piramidal.</li>
		<li>Insira cuidadosamente o K+-elétrodo seletivo em CA1 stratum radiatum aproximadamente 50 µm profunda, diminuindo lentamente o eletrodo durante aproximadamente 3-4 segundos. Permitir que o potencial estabilizar através do eletrodo antes de aplicar estímulos para a fatia: isto geralmente leva de 5 a 10 minutos. Se a fatia exibe espontânea mudanças no extracelular K+ então descartar e repita este processo com uma nova fatia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medida evocados lançamento K+<ol>
<li>Aplica os comboios de estimulação elétrica (8 pulsos) manualmente pressionando o gatilho sobre o estimulador durante a gravação digital de respostas. Aplica a estimulação em 10 Hz e 1 ms largura de pulso, começando na amplitude de estímulo 10 µA.</li>
		<li>Aplique amplitudes de estimulação crescente por um fator de 2 até uma amplitude máxima de resposta K+ é detectada. Se você não vê qualquer resposta, mover a posição do eletrodo K+ mais perto para o local de estimulação em 100 µm em incrementos</li>
		<li>Determine a amplitude do estímulo que produz a meia resposta máxima. Em nossa experiência, isto é entre 40-160 µA, dependendo da qualidade da preparação, idade do animal e a distância entre os eléctrodos de estimulação e elétrodo seletivo do K+ .</li>
		<li>Na mesma fatia, usando uma amplitude do estímulo em um passo mais baixo do que a amplitude que produz a resposta máxima metade (por exemplo, se 80 µA produz uma resposta de metade-máximo, use 40 µA) aplicam-se os comboios de estímulo de aumentar o número de pulsos. Inicialmente, nós usamos os trens de pulsos de 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 e 128.</li>
		<li>Para confirmar que K+ sinais são mediados por fuzilamento de potencial de ação do banho de colaterais de Schaffer estimulado eletricamente, aplique 0,5 µM TTX em ACSF por 10 minutos e repita o protocolo de estimulação. Nenhuma resposta evocada deve ser observada.</li>
		<li>Depois de terminar o experimento de fatia, confirmar o eletrodo tem mantido sua responsivity pela re-calibrar o eletrodo nas soluções de calibração e garantir a resposta não desviou-se por mais de 10% da calibração inicial</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O método que descrevemos aqui nos permitiu avaliar a dinâmica de K+ , em resposta à estimulação elétrica de colaterais de Schaffer em fatias hippocampal agudas de ratos adultos. Nosso método de preparação K+ microeletrodos seletiva de íons é semelhante a procedimentos anteriormente descritos12,13,14,15. No entanto, este método tem vantagens sobre configurações de eletrodo ...

Concentrações de íons potássio estão fortemente regulamentadas no cérebro, e suas flutuações exercem uma poderosa influência sobre o potencial de membrana descanso de todas as células. À luz destas contribuições críticas, um objectivo importante da biologia é determinar os mecanismos celulares e biofísicos que são usados para regular firmemente a concentração de K+ no espaço extracelular em diferentes órgãos do corpo1 , 2. a capacidade de medir concentrações de K+ com precisão, constitui um requisito importante nestes estudos. Apesar de muitos componentes que contribuem para a homeostase do potássio no cérebro em Estados saudáveis e doentes foram identificados3,4,5, ainda mais progresso tem sido abrandado devido à natureza especializada do preparando íon seletivo microeletrodos para medição de potássio. Sensores de microeletrodos representam o padrão de ouro para medir K+ concentrações em vitro, em fatias de tecido e em vivo.
Novos enfoques para K+ de monitoramento estão em desenvolvimento utilizando sensores ópticos, porém estes não detectar uma gama biologicamente relevantes de K+ concentrações ou já não foram totalmente analisados em sistemas biológicos, embora os resultados iniciais Parece promissor,6,7,8. Comparado com sensores ópticos, microeletrodos são fundamentalmente limitados a uma medição de ponto fonte de íons, embora matrizes eletrodo poderiam melhorar a resolução espacial9. Este artigo enfoca os sensores de cano único microeletrodos para monitoração dinâmica K+ .
Neste trabalho, relatamos os procedimentos detalhados em etapas para fazer K+ seletivos microeletrodos, usando um ionóforo de potássio valinomicina-baseado que permite altamente seletivo (dobra4 10 K+ a seletividade Na+ ) K+ movimentação de membranas10. Um polipeptídeo natural, valinomicina atua como um poro permeável K+ e facilita o fluxo de K+ para baixo é um gradiente electroquímico. Também descreveremos como calibrar os eletrodos, como armazenar e usá-los e, finalmente, como implantá-las para medir a dinâmica de concentração K+ em fatias aguda hippocampal cérebro de ratos adultos. O uso de tais eletrodos juntamente com ratos geneticamente modificados que não possuem canais de íon específico propostos para regular extracelular K+ dinâmica deve revelar os mecanismos celulares usados pelo sistema nervoso para controlar a concentração ambiente de K + no meio extracelular.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>DSK</td><td>Microslicer Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Mouse: C57BL/6NTac camundongos endogâmicos</td><td>Taconic</td><td>Stock#B6</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de eletrodos</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl pellet de aterramento</td><td>WPI</td><td>EP2</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP10.3</td><td>Dispositivos Moleculares</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos de precisão feitos</td> sob encomenda <td>CMF28G</td> da ponta do mundo do <td>microfil 28G</td><td></td></tr><tr><td>Haste de tungstênio</td><td>A-M Systems</td><td>716000</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodos de estimulação bipolares</td><td>FHC</td><td>MX21XEW (T01)</td><td></td></tr> <tr><td>Isolador do estímulo Instrumentos</td><td>de precisão do mundo</td><td>A365</td><td></td></tr><tr><td>Grama S88 Stimulator</td><td>Grass Instruments Company</td><td>S88</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidro borossilicato</td><td>Instrumentos de precisão mundial</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>A a D placa</td><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de sinal</td><td>Multiclamp 700A ou 700B</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>CV-7B Cat 1</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Patch computador</td><td>Dell</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio Monobásico</td><td>Sigma</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio</td><td>Sigma</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>valinomicina</td><td>Sigma</td><td>V0627-10mg</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimetil-3-nitrobenzeno</td><td>Sigma</td><td>40870-25ml</td><td></td></tr><tr><td>Borato de potássio tetraquis (4-clorofenil)</td><td>Sigma</td><td>60591-100mg</td><td></td></tr><tr><td>5% dimetildiclorossilano em heptano</td><td>Sigma</td><td>85126-5ml</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>14964</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Sigma</td><td>H1758-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S9378-5kg</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Micromanipulador</td><td>Sutter</td><td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>Lente objetiva</td><td>Olympus</td><td>PlanAPO 10xW</td><td></td></tr></tbody></table>

fazendo, testando e usando potássio íon seletivo microeletrodos em fatias de tecido do cérebro de um adulto

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Íons de potássio contribuem significativamente para o descanso potencial de membrana das células e, portanto, a concentração extracelular de K+ é um regulador crucial da excitabilidade da célula. Alterou a concentrações extracelulares K+ vai afectar a excitabilidade de celular e potenciais de membrana de descanso deslocando o equilíbrio entre Estados fechados, abertos e inativados para canais dependentes de voltagem íon que fundamentam o potencial de ação iniciação e condução. Portanto, é valioso para medir diretamente o extracelular K+ dinâmica na saúde e Estados doentes. Aqui, descrevemos como fazer, calibrar e usar monopolar K+-seletivos microeletrodos. Nós lhes implantado em fatias hippocampal cérebro de um adulto para medir evocada eletricamente dinâmica de concentração de K+ . O uso criterioso de tais eletrodos é uma parte importante do kit de ferramentas necessária para avaliar os mecanismos celulares e biofísicos que controlam a concentração extracelular de K+ no sistema nervoso.

Para a medição selectiva de extracelular K+, preparamos íon-seletivo microeletrodos revestidos com uma camada hidrofóbica através de silanização de pipetas de vidro de borosilicato limpo (figura 1A). Este revestimento permite que o ionóforo K+ contendo valinomicina para descansar na ponta do eletrodo e permitir apenas K+ fluxo através de uma abertura estreita na ponta do eletrodo (figura 1B). Depo...

Íons de potássio contribuem para o descanso potencial de membrana das células e a concentração extracelular de K+ é um regulador crucial da excitabilidade celular. Descrevemos como fazer, calibrar e usar monopolar K+-seletivos microeletrodos. Usar tais eletrodos permite a medição da dinâmica de concentração de K+ eletricamente evocada em fatias hippocampal adultas.

Fazendo, testando e usando potássio íon seletivo microeletrodos em fatias de tecido do cérebro de um adulto

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

O objetivo geral desta técnica é fazer, calibrar e usar microeletrodos monopolares seletivos de íons de potássio. O uso de tais eletrodos permite a avaliação quantitativa da dinâmica da concentração evocada de íons potássio em fatias cerebrais de adultos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em fisiologia, como identificar os mecanismos celulares e moleculares para a homeostase do íon potássio no sistema nervoso central.A principal vantagem dessa técnica é que, além de ser um método fácil e direto de fabricação, os sensores de microeletrodos representam o padrão ouro para a medição da concentração de íons potássio. Para preparar os capilares de vidro borossilicato para silanização, coloque-os em um tubo cônico de 50 mililitros. Encha o tubo cônico com ácido clorídrico de um molar e incube os capilares de vidro em ácido clorídrico com agitação suave durante a noite por um mínimo de seis horas.Depois, enxágue brevemente os capilares com etanol a 70% e seque-os completamente a 100 a 120 graus Celsius por seis a oito horas. Armazene os capilares lavados em recipientes com dessecante de sulfato de cálcio anidro por até quatro semanas antes de usá-los novamente. Antes da

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este é um protocolo para preparar e manter uma preparação fatia neocortical na cultura organotípicas com a finalidade de fazer gravações elétrica de neurônios piramidais.

Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex

Usamos a técnica patch-clamp para medir GABA-activated single-channel correntes (GABAA canais, receptores GABAA) e as correntes sinápticas e tônico que eles geram em neurônios. Ativação dos canais diminui a excitabilidade neuronal na saúde e na...

GABA-activated Correntes canal único e Tonic em fatias de cérebro de rato

Neurônios são os primeiros caracterizada eletrofisiologicamente. Em seguida, o citoplasma do neurônio gravado é aspirado e submetido a transcrição reversa-PCR para detectar a expressão de mRNAs de enzimas neurotransmissor síntese, canais iônicos e receptores.

Perfil de tensão-gated Expressão mRNA canais de potássio em neurônios da substância negra usando uma única célula RT-PCR Técnicas

O vídeo demonstra a dinâmica evocada da concentração de íons potássio na estimulação elétrica de fatias de cérebro coronal do hipocampo de camundongos. Um eletrodo estimulante bipolar é inserido no estrato radiato da região CA3 no hipocampo e um eletrodo seletivo de íons de potássio é colocado no estrato radiato CA1. A estimulação elétrica causa um potencial de ação, resultando na liberação de íons potássio. Finalmente, a falta de resposta evocada do íon potássio na presença de uma molécula...

Medição da Dinâmica da Concentração de Íons Evocados de Potássio em Fatias Coronais do Hipocampo

Este vídeo demonstra como caracterizar o espaço extracelular em uma fatia cerebral usando microeletrodos seletivos de íons e iontoforese para medir e comparar sinais elétricos. Esse processo ajuda a determinar a fração de volume e o grau de torção do espaço.

Caracterização do espaço extracelular em uma fatia cerebral usando microeletrodos íon-seletivos e iontoforese

Nós desenvolvemos um modelo de fatia de cérebro que podem ser utilizados para examinar os mecanismos moleculares envolvidos na lesão cerebral mediada por excitotoxicidade. Esta técnica gera tecido cerebral maduro viável e reduz o número de animais necessários para a experimentação, mantendo o circuito neuronal, interações celulares e compartimentos pós-sinápticos em parte intacta.

Excitotóxico Estimulação do Microslices cérebro como um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de AVC

Neste trabalho mostramos um método para o preparo de fatias agudas de cérebro em temperatura fisiológica, utilizando uma solução fisiológica convencional sem modificações especiais para o corte (como adição de sacarose) e sem perfusão intracárdica do animal antes do preparo do corte.

Slice It Hot: Agudo Adulto Cérebro Cortando na temperatura fisiológica

Registros de patch-clamp e preenchimento simultâneo de biocitina intracelular de neurônios sinapticamente acoplados em fatias cerebrais agudas permitem uma análise correlacionada de suas propriedades estruturais e funcionais. O objetivo deste protocolo é descrever as etapas técnicas essenciais do registro eletrofisiológico a partir de microcircuitos neuronais e sua posterior análise morfológica.

Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings

Demonstramos a fabricação, calibração e propriedades de dois tipos de microeletrodos seletivos de íons (de cano duplo e concêntricos) para medição de concentrações de íons no tecido cerebral. Estes são então usados na preparação da fatia do hipocampo de camundongos para mostrar que a atividade excitatória altera as concentrações extracelulares de potássio e sódio.

Microeletrodos de cano duplo e concêntricos para a medição de Extracelular Ion Signals no tecido cerebral

Este protocolo demonstra a implementação de um otimizado N-metil-D-glucamine (NMDG) método de recuperação protetora de preparação de fatia do cérebro. Uma formulação única mídia é usada para obter confiavelmente fatias de cérebro saudável de animais de qualquer idade e para diversas aplicações experimentais.

Preparação de fatias de cérebro aguda usando um otimizado N-metil-D-método de proteção de recuperação glucamine

Microglia, as residentes células imunes do cérebro, responder rapidamente com alterações morfológicas às modificações do seu ambiente. Este protocolo descreve como usar dois fotões microscopia para estudar a atração dos processos microglial em direção a serotonina ou ATP em fatias aguda do cérebro de ratos.

Imagem de dois fotões de atração Microglial processos para ATP ou de serotonina no cérebro aguda fatias

Aprenda a fabricar, calibrar e usar microeletrodos seletivos de íons de potássio em fatias de hipocampo de camundongo adulto. Este método permite medir dinâmicas de concentração de potássio com alta precisão e confiabilidade.

Fazendo, testando e usando potássio íon seletivo microeletrodos em fatias de tecido do cérebro de um adulto

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