Fazendo, testando e usando potássio íon seletivo microeletrodos em fatias de tecido do cérebro de um adulto

O objetivo geral desta técnica é fazer, calibrar e usar microeletrodos monopolares seletivos de íons de potássio. O uso de tais eletrodos permite a avaliação quantitativa da dinâmica da concentração evocada de íons potássio em fatias cerebrais de adultos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em fisiologia, como identificar os mecanismos celulares e moleculares para a homeostase do íon potássio no sistema nervoso central.

A principal vantagem dessa técnica é que, além de ser um método fácil e direto de fabricação, os sensores de microeletrodos representam o padrão ouro para a medição da concentração de íons potássio. Para preparar os capilares de vidro borossilicato para silanização, coloque-os em um tubo cônico de 50 mililitros. Encha o tubo cônico com ácido clorídrico de um molar e incube os capilares de vidro em ácido clorídrico com agitação suave durante a noite por um mínimo de seis horas.

Depois, enxágue brevemente os capilares com etanol a 70% e seque-os completamente a 100 a 120 graus Celsius por seis a oito horas. Armazene os capilares lavados em recipientes com dessecante de sulfato de cálcio anidro por até quatro semanas antes de usá-los novamente. Antes da silanização, puxe os capilares para uma ponta fina usando um extrator de microeletrodos.

Em seguida, coloque os microeletrodos em um recipiente de vidro com fita autoclavável, de modo que os eletrodos sejam elevados por baixo para evitar a quebra da ponta. Em seguida, remova aproximadamente 0,5 mililitros de solução de silanização 5%DDS de seu recipiente usando o método de reposição de nitrogênio. Encha um balão com gás nitrogênio e coloque uma seringa ou tubo e agulha no balão.

Em seguida, insira a agulha no recipiente DDS enquanto aspira o DDS em uma seringa separada por meio de uma agulha mais longa. Em seguida, aplique a solução de silanização gota a gota nas pontas das pipetas e cubra imediatamente o recipiente. Coloque o recipiente contendo os microeletrodos com solução de silanização em um forno de laboratório pré-aquecido a 170 a 180 graus Celsius por 10 a 12 horas ou a 200 a 220 graus Celsius por 30 minutos.

Após a incubação, retire o prato do forno. Coloque o prato em uma bancada em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos para permitir que o copo esfrie. Remova os microeletrodos da placa e coloque-os em um recipiente hermético cheio de dessecante.

Microeletrodos silanizados mantidos livres de umidade podem ser usados por até uma semana após a silanização. Para preparar os eletrodos, prepare uma solução estoque de coquetel de ionóforo de potássio e mantenha-a em um recipiente hermético e opaco em temperatura ambiente. Em seguida, prepare uma solução estoque de cloreto de sódio 300 milimolar tamponado com HEPES a 10 milimolares em pH 7,4.

Fixe o eletrodo em um clamp. Posteriormente, usando um instrumento rombudo, incline a ponta do eletrodo para aproximadamente 10 a 20 micrômetros de largura e, em seguida, preencha o eletrodo com o cloreto de sódio tampolado com HEPES usando uma ponta MicroFil de calibre 28 conectada a uma seringa. Observe que a solução salina atingiu o final da ponta do microeletrodo e certifique-se de que o microeletrodo esteja livre de grandes bolhas que possam interferir no fluxo de corrente.

Usando uma micropipeta, aplique uma pequena gota do ionóforo de potássio perto da ponta do microeletrodo. Se o eletrodo tiver sido devidamente silanizado, a gota será absorvida pela ponta quebrada. Encha o eletrodo até aproximadamente 1 milímetro com o ionóforo de potássio e remova o excesso usando papel de seda.

Para calibrar os microeletrodos, borbulhe todas as soluções tampão de calibração e corte com 95% de oxigênio / 5% de dióxido de carbono por pelo menos 20 minutos antes de iniciar o experimento. Comece a perfundir o banho com ACSF contendo íons potássio 4,5 milimolares a uma taxa de três mililitros por minuto. Coloque o eletrodo seletivo de íons de potássio no suporte do eletrodo preso ao cabeçote do eletrodo no manipulador.

Em seguida, insira a ponta do eletrodo no perfusato do banho. Certifique-se de que o eletrodo de aterramento de prata/cloreto de prata seja banhado na mesma solução e que o fluxo seja constante. Aplique soluções de calibração em etapas e registre as possíveis mudanças em milivolts na ponta do eletrodo.

Aguarde até que o potencial na ponta do eletrodo atinja um valor estável antes de mudar para a próxima solução. Em seguida, meça a mudança de tensão em estado estacionário em resposta à aplicação das soluções de calibração na ponta do eletrodo. Confirme se a inclinação da resposta de tensão do eletrodo é de pelo menos 52 e não superior a 59 milivolts por mudança de dez vezes na concentração de potássio.

Para preparar fatias do hipocampo, faça uma incisão de dois a três centímetros da porção caudal do crânio para cortar o couro cabeludo ao longo da linha média. Enquanto retrai manualmente o couro cabeludo, faça duas incisões horizontais de um centímetro do forame magno ao longo dos lados do crânio. Em seguida, usando uma tesoura fina, faça uma incisão ao longo da linha média, da parte de trás do crânio até o nariz.

Em seguida, insira uma pinça fina perto da linha média e retraia o crânio inciso em duas porções. Extraia o cérebro do camundongo do crânio e use uma lâmina para remover o cerebelo, o córtex pré-frontal e os bulbos olfatórios, que estão localizados respectivamente nas porções caudal e rostral do cérebro. Em seguida, monte o bloco cerebral na bandeja de vibratomo usando Super Cola.

Encha a bandeja do vibratomo com solução de corte gelada. Depois, corte seções de tecido na planície coronal com 300 micrômetros de espessura. Normalmente, quatro a seis fatias coronais do hipocampo podem ser coletadas.

Depois de cada secção ser cortada, transfira imediatamente a fatia para o copo de fixação da fatia aquecido a 32 a 34 graus Celsius. Mantenha as seções a essa temperatura por 20 minutos antes de transferir o béquer com as seções para a temperatura ambiente por pelo menos 20 a 30 minutos antes da gravação. Para medir a dinâmica do íon potássio, coloque suavemente a fatia do cérebro no banho usando uma pipeta Pasteur e segure-a suavemente no lugar com uma harpa de platina com cordas de náilon.

Certifique-se de que as pontas do eletrodo estimulante bipolar estejam aproximadamente paralelas umas às outras e niveladas com a planície da fatia. Ao longo de cinco a sete segundos, insira lentamente os eletrodos no estrato radiato CA3 com aproximadamente 40 a 50 micrômetros de profundidade para estimular as colaterais de Schaffer. Em seguida, insira cuidadosamente o eletrodo seletivo de íons de potássio no estrato radiato CA1 a aproximadamente 50 micrômetros de profundidade, abaixando lentamente o eletrodo por aproximadamente três a quatro segundos.

Permita que o potencial se estabilize no eletrodo antes de aplicar estímulos à fatia, o que geralmente leva de cinco a 10 minutos. Se a fatia apresentar alterações espontâneas excessivas nas concentrações extracelulares de íons potássio, descarte e repita o processo com uma nova fatia. Para medir a liberação evocada de íons de potássio, aplique trens de estimulação elétrica por meio do isolador de estímulo enquanto registra digitalmente as respostas.

Aplique estimulação a 10 hertz e um milissegundo por pulso começando na amplitude do estímulo de 10 microamperes. Aplique amplitudes de estimulação crescentes por um fator de dois até que uma amplitude máxima de resposta de potássio seja detectada. Se nenhuma resposta for observada, mova a posição do eletrodo seletivo de íons de potássio para mais perto do local de estimulação em incrementos de 100 micrômetros.

Para confirmar que as alterações na concentração de íons potássio são mediadas pelo disparo do potencial de ação das colaterais de Shaffer ativadas eletricamente, aplique o banho de TTX 0,5 micromolar em ACSF por 10 minutos e repita o protocolo de estimulação. Nenhuma resposta evocada deve ser observada. Depois de preparar os eletrodos com a solução salina tamponada com HEPES preenchida e o ionóforo de potássio, os eletrodos podem ser testados quanto à sua resposta rápida a mudanças graduais nas concentrações de íons potássio no banho e quanto à resposta linear às mudanças no íon potássio no banho na faixa de calibração de 0,1 a 100 milimolares de maneira prevista pela equação de Nernst.

O potencial de estado estacionário pode ser plotado em relação à concentração de íons potássio do banho para determinar a inclinação da linha, que deve ser de aproximadamente V 58,2 milivolts e não inferior a 52 milivolts por mudança de dez vezes na concentração de íons potássio. A capacidade de resposta dos eletrodos seletivos de potássio foi testada e a resposta a um aumento de 5,5 milimolares no potássio foi observada com constantes de tempo de aumento e decaimento de aproximadamente 85 milissegundos. Uma vez que os eletrodos estimulantes e seletivos de íons de potássio tenham sido colocados no tecido e o registro tenha atingido uma linha de base estável, pulsos de amplitude de corrente crescente podem ser aplicados.

A forma de onda dessa atividade aparece como um rápido aumento de potássio com uma taxa de decaimento exponencial, que é abolida com a aplicação de TTX. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente três a quatro horas se for realizada com cuidado e precisão. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a ponta do eletrodo o menor possível para permitir gravações precisas, mas grande o suficiente para permitir baixo ruído.