Isolamento e análise de comunidades microbianas na rizosfera, solo e raízes em experiências de grama perene

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do microbioma do solo, rizosfera e endosfera radicular, como como a diversidade da comunidade microbiana muda em resposta ao tipo de amostra, tratamento e genótipo da planta. A principal vantagem dessa técnica é que ela é adequada para experimentos de campo que exigem grande número de amostras e replicação. Demonstrando o procedimento estaremos eu e Stephanie Futrell, uma estudante de pós-graduação e técnica de pesquisa do meu laboratório.

Para iniciar o protocolo, rotule uma bandeja de lavagem e um balde com uma nota adesiva com detalhes da amostra da planta. Leve o balde rotulado para a parcela e deixe a bandeja na estação de trabalho estabelecida no campo. Escolha e colete aleatoriamente duas plantas por parcela de diferentes áreas dentro da parcela.

Em seguida, perfure o solo com uma pá a uma profundidade de 30 centímetros para cortar qualquer uma das raízes laterais que prendem a planta no solo. Escave as raízes das plantas aproveitando a pá e coloque a raiz no balde rotulado. Traga a caçamba de volta para a estação de trabalho no campo.

Agite as raízes e use uma pá ou leme de mão para remover o solo das raízes. Use luvas e coloque as raízes perto da estação de processamento. Depois de sacudir as raízes, misture o solo na assadeira e quebre os torrões de solo com um leme manual.

Coloque uma amostra de solo livre de detritos em um saco de armazenamento com zíper rotulado de 17,7 por 19,5 centímetros e coloque-o no gelo. Esterilize a tesoura de poda em etanol 70%. Use a tesoura estéril para extirpar uma variedade de raízes, aproximadamente quatro a seis raízes por planta e cada raiz com cerca de nove a 12 centímetros de comprimento.

Coloque as raízes excisadas em um tubo rotulado de 50 mililitros contendo 35 mililitros de tampão fosfato autoclavado com um surfactante como Silwet L-77. Agite os tubos por dois minutos para liberar a rizosfera da superfície das raízes. Melhore a agitação com um gerador e vórtice.

Com uma pinça esterilizada em etanol a 70%, remova as raízes do tubo, seque-as brevemente em papel toalha e coloque-as em um novo tubo rotulado de 50 mililitros. Coloque o tubo que contém a rizosfera e o que contém as raízes no gelo. Adicione aproximadamente 35 mililitros de 50% de alvejante mais 0,01% Tween 20 aos tubos de 50 mililitros com raízes coletadas no campo.

Vortex ou agite os tubos por 30 a 60 segundos. Despeje o alvejante, adicione 35 mililitros de etanol a 70% e vortex ou agite as raízes por mais 30 a 60 segundos. Após agitar, despeje o etanol 70% e adicione 35 mililitros de água estéril e ultrapura e vórtice ou agite a amostra por um minuto.

Repita a etapa de enxágue com água mais duas vezes para que a raiz receba um total de três enxágues com água estéril e ultrapura. Seque as raízes em toalhas de papel limpas e secas e use uma toalha de papel limpa para cada amostra. Usando uma pinça estéril e uma tesoura de poda, corte as raízes em pedaços de aproximadamente cinco milímetros e coloque as raízes cortadas em um tubo cônico limpo e rotulado de 15 mililitros e, em seguida, armazene as amostras a 80 graus Celsius negativos até que sejam processadas posteriormente.

Agite os tubos de 50 mililitros contendo amostras da rizosfera do campo por 20 a 30 segundos para ressuspender toda a amostra. Usando um filtro de célula de malha estéril de 100 mícrons, filtre a amostra ressuspensa em um novo tubo de 50 mililitros. Em seguida, centrifugue os tubos a 3.000 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente.

Despeje imediatamente e descarte o sobrenadante. Coloque os pellets da rizosfera nos tubos de 50 mililitros no gelo. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de tampão fosfato estéril sem surfactante aos pellets da rizosfera e os vortex para ressuspender a amostra.

Pipete o líquido suspenso em um tubo de microcentrífuga limpo e rotulado de dois mililitros. Gire os tubos a 15.871 vezes g por dois minutos em temperatura ambiente. Despeje imediatamente o sobrenadante e drene os tubos em toalhas de papel limpas.

Armazene os pellets a menos 20 graus Celsius até que sejam processados novamente. Usando uma espátula de metal estéril, encha um tubo limpo e rotulado de dois mililitros com aproximadamente três gramas de solo para extração de DNA e evite pequenos pedaços de raiz e detritos. Enxágue a espátula de metal em etanol a 70% entre cada amostra.

Armazene esta amostra de solo a menos 20 graus Celsius. Em uma panela limpa, esvazie o saco de terra em peneiras empilhadas com a peneira maior em cima da peneira menor e peneire manualmente a terra em ambas as peneiras. Use uma escova para limpar cuidadosamente as peneiras entre as amostras.

Separe de 100 a 125 gramas de solo peneirado em um saco com zíper de 17,7 por 19,5 centímetros para futuras análises físico-químicas e de textura do solo. Coloque os sacos de terra a quatro graus Celsius para armazenamento de curto prazo. Em seguida, despeje nitrogênio líquido em um copo de plástico com espátulas limpas e em um almofariz limpo.

Coloque o tecido congelado no almofariz e triture-o com o pilão até formar um pó fino. Adicione continuamente nitrogênio líquido durante a moagem para manter as amostras congeladas. Use uma espátula para transferir o tecido moído em um tubo limpo e rotulado de dois mililitros e, em seguida, armazene o tecido a 80 graus Celsius negativos.

Limpe a área de trabalho com 70% de etanol e 1% de alvejante doméstico. Remova as amostras de solo do armazenamento de -20 graus Celsius e descongele-as em um balde de gelo. Remova a tampa da esteira de vedação de uma placa de extração de 96 poços e coloque a tampa entre dois lenços de papel para mantê-la limpa enquanto não estiver em uso.

Cubra as 12 colunas da placa com tiras adesivas de PCR de 8 poços para evitar contaminação. Tara um funil de pesagem estéril e pequeno em uma balança e pesa 200 a 250 miligramas de solo. Levante cuidadosamente a fita adesiva, coloque o gargalo do funil de pesagem cheio no poço apropriado e guie suavemente a amostra de solo para o poço apropriado.

Substitua a fita adesiva para cobrir o poço. Repita esse processo para cada poço, usando um novo funil estéril para cada amostra. Recoloque a tampa da esteira de vedação na placa de extração e armazene a placa a menos 20 graus Celsius até que esteja pronta para a extração de DNA.

Remova as amostras da rizosfera do armazenamento de 20 graus Celsius negativos e descongele em um balde de gelo. Prepare a placa de extração de DNA como feito na seção anterior. Coloque um lenço de papel limpo em uma balança e, em seguida, tara uma espátula de metal estéril na balança.

Use a espátula para retirar cuidadosamente um pouco do pellet da rizosfera de um tubo de amostra. Pesar entre 200 e 250 miligramas da amostra da rizosfera. Levante cuidadosamente a fita adesiva para descobrir o primeiro poço da placa de extração.

Incline a espátula cheia no poço e raspe o material da rizosfera no poço apropriado com um palito de dente estéril. Enxágue a espátula de metal em água seguida de etanol a 70% entre as amostras. Por fim, repita esse processo para cada poço da placa até que a placa esteja cheia, deixando um poço vazio como controle de extração.

Neste conjunto de dados representativos, houve diferenças altamente significativas entre os tipos de amostra, e a rizosfera e o solo parecem ser mais semelhantes em composição entre si do que a raiz. Uma análise mais aprofundada mostra que também houve diferenças altamente significativas na composição da comunidade microbiana entre a rizosfera e o solo. A análise da diversidade alfa mostra que as comunidades microbianas na endosfera foram menores do que as comunidades no solo e na rizosfera.

A única diferença significativa na diversidade entre as espécies de gramíneas foi entre as amostras da endosfera de grande caule azul e switchgrass. A análise de abundância relativa destaca a dominância de Proteobacteria seguidas por Actinobacteria em todos os tipos de amostra. O solo e a rizosfera são dominados por Acidobacteria e Chloroflexi, enquanto as raízes apresentaram maior abundância relativa de Bacteriodetes.

A análise PERMANOVA de todos os tipos de amostra elucidou uma diferença altamente significativa na composição da comunidade microbiana devido às espécies de plantas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como executar uma série de etapas para usar no estudo dos microbiomas do solo, endosfera e rizosfera. Gostaríamos de agradecer ao Nebraska EPSCoR e à National Science Foundation EPSCoR Research Infrastructure Program Track 1 pelo financiamento parcial deste vídeo educacional.