Uma técnica in vitro para estudar a interação de células T com bicamadas lipídicas planares suportadas

Pegue uma lâmina de fluxo contendo uma bicamada lipídica suportada, ou SLB.

O SLB é conjugado a ligantes específicos - molécula de adesão intercelular 1 ou anticorpos ICAM-1 e anti-CD3 - marcados com fluoróforos.

Adicione células T e anti-CD107a Fab marcado com fluoróforo - o fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo contra o marcador de degranulação.

O complexo receptor de células T-CD3 ou TCR-CD3 se liga ao anticorpo anti-CD3, desencadeando o TCR.

A sinalização de dentro para fora induzida pelo gatilho ativa as integrinas na superfície, que se ligam ao ICAM-1 imobilizado.

A conjugação induz a reorganização do citoesqueleto - rearranjo de microtúbulos e polimerização de actina que leva ao espalhamento lateral da célula na superfície do SLB.

O espalhamento permite que mais interações ligante-receptor formem um cluster de ativação supramolecular ou SMAC, criando uma sinapse imunológica.

Os grânulos líticos de células T se movem ao longo dos microtúbulos e se fundem com a membrana plasmática, expondo marcadores de degranulação na superfície da célula, que se ligam ao anti-CD107a Fab.

Usando um microscópio de fluorescência, visualize a sinapse imune enriquecida em complexos TCR-CD3, integrinas e marcadores de degranulação.

Comece usando uma pinça tipo tesoura de polipropileno para submergir lamínulas de vidro em solução de piranha ácida recém-preparada por 25 a 30 minutos. No final da lavagem, enxágue as lamínulas sete vezes em um novo volume de água ultrapura para cada lavagem e reserve as lamínulas molhadas para deixar a água restante rolar do vidro limpo.

Quando as lamínulas estiverem secas, alíquota de dois microlitros da mistura final de lipossomas, precisamente, no centro de um canal de lâmina autoadesivo dentro de uma capa de fluxo estéril e, imediatamente, mas com cuidado, alinhe uma lamínula limpa e seca com a lâmina para permitir que a lamínula seja suavemente abaixada no lado adesivo da lâmina e use o anel externo da pinça tipo tesoura de polipropileno para aplicar uma leve pressão ao contato periférico do lamínula com a corrediça, certificando-se de que a lama esteja firmemente presa à corrediça para evitar vazamentos. Em seguida, vire o slide e use um marcador permanente para desenhar quatro pontos ao redor da bicamada no lado externo do conjunto do slide.

Antes da primeira injeção, designe uma porta do canal como porta de entrada e a outra como porta de saída, mantendo essa designação durante todo o experimento. Para evitar a formação de bolhas, insira a extremidade da ponta da pipeta diretamente na porta de entrada até sentir a vedação de borracha do canal deslizante sendo penetrada com a ponta.

Lentamente, encha o canal com 50 microlitros de tampão de ensaio quente. Injete 200 microlitros de cloreto de níquel (II) na solução de bloqueio de caseína na porta de entrada e remova 50 microlitros do tampão da porta de saída. Após uma incubação de 45 minutos, remova o excesso de solução de caseína da porta de saída.

Injete 100 microlitros de uma solução de ICAM-1 e estreptavidina na porta de entrada para uma incubação de 45 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, remova o excesso de solução proteica da porta de saída e lave a bicamada duas vezes com 100 microlitros de tampão de ensaio por lavagem. Em seguida, rotule as bicamadas com 100 microlitros de anticorpo anti-CD3 conjugado com fluoróforo por 45 minutos em temperatura ambiente, seguido de duas lavagens em 100 microlitros de tampão de ensaio por lavagem, conforme demonstrado.

Para obter imagens das interações entre células T e bicamada, coloque a lâmina no estágio aquecido a 37 graus Celsius de um microscópio de Fluorescência de Reflexão Interna Total, ou TIRF, e ajuste o estágio usando as marcas de tinta para centralizar a bicamada na objetiva de 100 potências.

Para imagens de liberação de grânulos, adicione fragmentos Fab de anticorpo anti-CD107a conjugados com fluorescência à suspensão de células T CD4 e ressuspenda as células marcadas em 50 microlitros de tampão de ensaio para injeção na porta de entrada do canal de lâmina. Em seguida, selecione o número apropriado de campos experimentais e registre as imagens de cada campo uma vez a cada minuto durante 30 minutos após a injeção.