Knockdown estável de genes codificando proteínas matrizes extracelulares na linha célula do mioblasto C2C12 usando pequeno-hairpin (sh)RNA

Fornecemos um protocolo para derrubar genes que codificam proteínas de matriz extracelular (ECM) em mioblastos C2C12 usando rNA de pino pequeno (sh). Visando o ADAMTSL2 como exemplo, descrevemos os métodos para a validação da eficiência de knockdown no nível mRNA, proteína e celular durante o mioblasto C2C12 à diferenciação do miotubo.

Este protocolo é significativo porque nos permite estudar a função de proteínas, como proteínas de matriz extracelular, que são reguladas em estágios posteriores de formação ou maturação do miotube. Este método pode ser usado para derrubar qualquer gene de interesse em células C2C12 usando shRNAs específicos e as respectivas ferramentas analíticas para fenotipagem. A principal vantagem deste método é que geramos células C2C12 que podem suprimir continuamente nossos genes de interesse, mesmo em miotubes maduros.

O aspecto mais importante deste procedimento é manter as células C2C12 em estado indiferenciado, o que significa uma baixa densidade celular durante a cultura celular rotineira. Um dia antes da transfecção, semente cinco vezes 10 para a quarta célula C2C12 por mililitro em dois mililitros de DMEM completo por poço em uma placa de seis poços para alcançar uma confluência de 40 a 50% após a incubação noturna a 37 graus Celsius e 5%CO2. Na manhã seguinte, combine 100 microliters de cloreto de sódio de 25 mililitros em um tubo de reação de 1,5 mililitro por cultura bem com 25,5 microliters SOLUÇÃO de estoque PEI de uma cultura celular C2C12 indiferenciada para uma incubação de cinco minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, combine três microgramas de DNA plasmídeo com 100 microlitres de cloreto de sódio de 25 milimilas por cultura bem para uma incubação de cinco minutos a 37 graus Celsius. No final das incubações, combine todo o volume de cada reagente PEI diluído com cada solução plasmida diluída com tubulação suave para uma incubação de 25 minutos a 37 graus Celsius. Durante a incubação, substitua os supernacantes das culturas celulares C2C12 por DMEM sem antibióticos ou soro.

No final da incubação, adicione todo o volume de cada mistura de transfecção a cada poço em gotículas, enquanto movimenta continuamente o prato de cultura celular. Após seis horas na incubadora de cultura celular, substitua o meio em cada poço por DMEM completo. 24 horas após a transfecção, substitua o DMEM completo em cada poço por meio de seleção complementado com cinco microgramas por mililitro de puramicina, e devolva as células à incubadora de cultura celular por 10 a 14 dias ou até que as células C2C12 estáveis sejam observadas.

Em seguida, expanda as células C2C12 resistentes à puromicina em culturas de baixa densidade celular na presença de cinco microgramas por mililitro de puromicina, e criopreserve de seis a dez frascos de células para uso futuro. Para preparar as células C2C12 para diferenciação, sementes 1,5 vezes 10 para o quinto estável células C2C12 resistentes à puramicina em um mililitro de meio de seleção por poço em uma placa de 12 poços, e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até que as culturas sejam 95% confluentes. Para induzir a diferenciação, substitua o meio em cada poço por DMEM sem soro a cada dois dias após a formação do miotube em um microscópio de campo brilhante invertido equipado com uma câmera.

Para a imunostainagem de cadeia pesada de miosinas das células diferenciadas, sementes cinco vezes 10 para a quarta célula C2C12 resistente à puramicina em 500 microliters de DMEM completo por câmara em um slide de câmara de oito poços, e retornar as células para a incubadora de cultura celular. Quando as células atingirem 95% de confluência, substitua o meio de seleção em cada poço por 500 microliters de DMEM sem soro. Nos pontos de tempo experimentais apropriados, enxágüe as células diferenciadoras em cada poço três vezes com 5 mililitros de PBS por lavagem antes de fixar as células com 200 microliters de 4% de paraformaldeído em PBS por poço.

Após 15 minutos, lave as células três vezes com PBS fresco por lavagem, como apenas demonstrado seguido de incubação com 200 microlitres de 5-molar glycine em PBS por poço por cinco minutos. No final da incubação, lave as células três vezes antes de permeabilizar as células com 200 microlitrais de 1%surfactante não iônico em PBS por 10 minutos. Em seguida, bloqueie os locais de ligação de anticorpos inespecíficos com 200 microliters de 5% de albumina de soro bovino em PBS por poço por uma hora seguido de três lavagens na PBS.

Após a última lavagem, rotule as células com 200 microliters de anticorpo de cadeia pesada de miosina por duas horas em temperatura ambiente. Após três lavagens pbs, incubar as células com o anticorpo secundário apropriado por duas horas à temperatura ambiente, protegido da luz. Após três lavagens finais, aspire o PBS e monte as células com uma gota de meio de montagem complementada com DAPI e um deslizamento de tampa.

Em seguida, observe cada câmara em um microscópio de fluorescência usando o conjunto de filtro apropriado. Para avaliar a eficiência de knockdown nas culturas celulares por manchas ocidentais, primeira semente três vezes 10 para a quinta célula C2C12 resistente à puramicina em dois mililitros de DMEM completo por poço em uma placa de seis poços. Após 24 horas, enxágue as culturas com PBS, e inicie a diferenciação das células com dois mililitros de DMEM sem soro, como demonstrado.

Para análise das proteínas secretadas nos pontos de tempo experimentais apropriados, colete um mililitro de meio condicionado sem soro de cada poço em tubos de reação individuais de 1,5 mililitro para centrifugação. Após a centrifugação, transfira um mililitro dos supernantes médios condicionados em novos tubos de reação de 1,5 mililitros, e precipitar as proteínas com 391 microliters de ácido tricloroacético em surfactante não iônico por tubo. Após 30 segundos de vórtice, incubar as misturas no gelo por 10 minutos.

No final da incubação, pelota as proteínas precipitadas por centrifugação, e lave as pelotas de proteína três vezes com acetona gelada fresca e uma centrífuga por lavagem. Após a última lavagem, seque as pelotas por três a quatro minutos em temperatura ambiente antes da ressuspensão em 50 microliters de tampão de amostra SDS-PAGE por tubo. Em seguida, ferva as amostras por cinco minutos a 95 graus Celsius antes da análise da mancha ocidental de acordo com os protocolos padrão.

Para análise de proteína intracelular e ligada à membrana, enxágue a camada celular em cada poço com dois mililitros de PBS por poço, e use um raspador de células para desalojar cuidadosamente as células em volumes de um mililitro de PBS. Transfira as células para tubos individuais de 1,5 mililitros para centrifugação, seguido de três lavagens em um mililitro de PBS por tubo por lavagem via centrifugação. Após a última lavagem, resuspenja as pelotas de células em 200 microliters de tampão de lise suplementados com reagente de coquetel inibidor de protease sem EDTA para uma incubação de 30 minutos no gelo.

No final da incubação, ultrassonize as amostras por 15 segundos no gelo com uma configuração de saída de energia de 10 a uma frequência operacional de 23 kilohertz, e remova os detritos celulares por centrifugação. Transfira os supernantes para novos tubos de reação de 1,5 mililitros e determine as concentrações proteicas de acordo com os protocolos padrão. Combine 100 microgramas de proteína com tampão de amostra 5X SDS-PAGE em um volume total de 60 microliters por amostra, e ferva as amostras por cinco minutos a 95 graus Celsius.

Em seguida, analise as amostras por manchas ocidentais para a presença da proteína alvo desejada. A seleção de células C2C12 resistentes à puramicina pode ser alcançada dentro de 10 a 14 dias de transfecção devido a uma eliminação eficiente das células não resistentes. Normalmente, mais de 80% das células C2C12 se desprendem do prato de cultura celular durante esse período de tempo e são removidas durante a manutenção de células de rotina.

As células C2C12 resistentes à puramicina que expressam o controle ou o shRNA ADAMTSL2 mantêm sua morfologia celular alongada em forma de fuso em baixa densidade celular, bem como sua capacidade de se diferenciar em miotubes. A diferenciação C2C12 após a retirada do soro pode ser monitorada por microscopia de campo brilhante e imunossaturação para a cadeia pesada de minoquet marcador myosin. Os miótubos pesados da cadeia de miosina são observados entre três a cinco dias após o início da diferenciação e são multinucleados, como observado pela presença de mais de um núcleo DAPI positivo dentro dos limites celulares.

Como os dados de expressão genética em condições de proliferação demonstram, a eficiência knockdown da transfecção é de 40 a 60% a análise de manchas ocidentais pode ser realizada para confirmar o sucesso do knockdown em células obtidas, por exemplo, a partir de células C2C12 expressando perfeitamente shRNA que tem como alvo ADAMTSL2 em comparação com o controle de células expressas shRNA. Certifique-se de manter a concentração de puramicina durante o processo de seleção alto o suficiente para eliminar todas as células C2C12 não transfeinadas, ou as células não transfeinadas podem superar as células transfeinadas. Este ensaio nos permite determinar a função de proteínas de matriz extracelular que são expressas posteriormente no desenvolvimento muscular, mesmo que sejam induzidas cinco ou dez dias após a diferenciação de C2C12.

Lembre-se que o reagente de extração de RNA e beta-mercaptoetanol devem ser manuseados em um capô de fumaça e para manusear o ácido tricloroacético de acordo com os protocolos de segurança apropriados. Obrigado por assistir, e boa sorte com sua experiência.