Knockdown estável de genes codificando proteínas matrizes extracelulares na linha célula do mioblasto C2C12 usando pequeno-hairpin (sh)RNA

Este protocolo é significativo porque nos permite estudar a função de proteínas, como proteínas de matriz extracelular, que são reguladas em estágios posteriores de formação ou maturação do miotube. Este método pode ser usado para derrubar qualquer gene de interesse em células C2C12 usando shRNAs específicos e as respectivas ferramentas analíticas para fenotipagem. A principal vantagem deste método é que geramos células C2C12 que podem suprimir continuamente nossos genes de interesse, mesmo em miotubes maduros.

O aspecto mais importante deste procedimento é manter as células C2C12 em estado indiferenciado, o que significa uma baixa densidade celular durante a cultura celular rotineira. Um dia antes da transfecção, semente cinco vezes 10 para a quarta célula C2C12 por mililitro em dois mililitros de DMEM completo por poço em uma placa de seis poços para alcançar uma confluência de 40 a 50% após a incubação noturna a 37 graus Celsius e 5%CO2. Na manhã seguinte, combine 100 microliters de cloreto de sódio de 25 mililitros em um tubo de reação de 1,5 mililitro por cultura bem com 25,5 microliters SOLUÇÃO de estoque PEI de uma cultura celular C2C12 indiferenciada para uma incubação de cinco minutos a 37 graus Celsius.