Produção microfluida de liposomos sensíveis à temperatura contendo lisolipóides

O protocolo apresenta os parâmetros otimizados para a preparação de liposomos termosensíveis usando o dispositivo microfluido de microfluidos de micromixer herringbone escalonado. Isso também permite o coencapsulamento de doxorubicina e verde indocianina nos liposomos e a liberação fototérmica de doxorubicina para liberação controlada/desencadeada de drogas.

Microfluido é uma técnica emergente para preparar lipossomos de tamanho de nanopartículas tability e com grande reprodutibilidade e escalabilidade. Este protocolo permite a alta contínua através da produção de lipossomos sensíveis à baixa temperatura para co-carregamento com uma droga quimioterápica como doxorubicina e um corante fluorescente como o verde indocyanina. A preparação celular usa principalmente uma abordagem de cima para baixo, como hidratação de filme lipíde e extrusão.

Continua sendo desafiador preparar lotes grandes e reprodutíveis para aplicações clínicas. Uma grande vantagem dos microfluidos é a capacidade de lidar com pequenos volumes líquidos com alta controlabilidade no espaço e no tempo enquanto opera de forma contínua e automatizada. Demonstrando o procedimento com Calvin Cheung estarão Guanglong Ma e Amalia Ruiz, os pesquisadores de pós-doutorado do meu laboratório.

Para montar as bombas de seringa, use o cabo de rede bomba-para-bomba para conectar a porta de computador da bomba de seringa secundária à porta de rede da bomba de seringa mestre. Use o PC para bombear o cabo de rede para conectar a porta de computador da bomba mestre à porta serial RS-232 do computador. Para montar o dispositivo microfluido de arenque staggard herringbone, use uma porca e ferrule para conectar tubos a cada uma das entradas e tomadas do dispositivo.

Em seguida, use uma segunda porca e ferrule e uma montagem sindical para converter o terminal da tubulação para ambas as entradas para uma luer fêmea. Para configurar o software de controle da bomba, use o botão de configuração da bomba de seringa para atribuir o endereço da bomba de seringa mestre e da bomba de seringa secundária para Ad:01 e Ad:02, respectivamente, e, em seguida, abra o software de controle da bomba no computador. As duas bombas de seringa devem ser detectadas automaticamente seguidas por um som de bipe.

Selecione HSW Norm-Ject 5cc diâmetro é igual a 12,45 para atribuir o diâmetro a 12,45 milímetros. Defina a taxa para 0,25 mililitros por minuto para a bomba um e 0,75 mililitros por minuto para a bomba dois. Defina o volume a qualquer valor acima de cinco mililitros e selecione o modo de infusão para ambas as bombas.

Em seguida, clique em definir para confirmar as configurações. Para preparar uma mistura lipídica LTSL10 ou LTSL10 ICG, use uma seringa de bloqueio de cinco mililitros para retirar um mililitro de mistura lipídica e outra seringa de bloqueio de cinco mililitros para retirar pelo menos três mililitros de solução de sulfato de amônio. Deslize a flange do barril da seringa para o retentor da seringa da bomba para instalar as seringas carregadas nas bombas de seringa na posição vertical e anexar a flange do êmbolo da seringa ao bloco empurrador da bomba e enrolar a outra extremidade da fita de aquecimento e a sonda de temperatura com o termostato em torno da seringa contendo a solução lipídica.

Enrole a extremidade da fita de aquecimento à seringa contendo a solução aquosa, conecte a seringa contendo a mistura lipídica à entrada de etanol e conecte a seringa contendo a solução de sulfato de amônio à entrada aquosa. Ajuste a posição do êmbolo para remover quaisquer bolhas de ar das seringas conforme necessário e conecte e desligue a fita de aquecimento em intervalos de 10 segundos até que a temperatura das seringas atinja cerca de 51 graus. Quando o termostato mostrar uma temperatura apropriada, clique em executar tudo no software de controle da bomba para executar as bombas de seringa e verificar se o fluxo de fluido está livre de bolhas de ar e qualquer vazamento.

Colete as amostras de lipososom em um frasco e pare ou pare a infusão quando a seringa estiver quase vazia. Anneal as soluções lipossóis coletadas em um banho de água de 60 graus Celsius por 1-1/2 horas antes de transferir as soluções para tubos de diálise para diálise contra um litro de sulfato de amônio de 240 milimônios por pelo menos quatro horas a 37 graus Celsius. Em seguida, armazene os lipossomos purificados a quatro graus Celsius.

Para carregamento remoto dos lipossomos por gradiente de pH transmembrano, carregue 25 mililitros de HBS na parte superior de uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho e permita que todos os eluent fluam através da coluna. Coloque um mililitro de lipossomos dialisados na coluna. Quando toda a solução lipídica passar pela coluna, adicione 1,5 mililitros de HBS fresco à coluna.

Quando todo o buffer tiver passado pela coluna, adicione três mililitros de HBS frescos à coluna e colete o eluente. Em seguida, adicione a solução DOX a uma relação molar 1:20 DOX:fosfolipid para um mililitro de solução lipossa de troca de buffer em um frasco Biju e coloque o frasco em um banho de água de 37 graus Celsius por 1-1/2 horas. Após o carregamento, purifique os lipossomos por cromatografia de exclusão de tamanho como apenas demonstrado.

Para o aquecimento a laser induzido liberação do gatilho do conteúdo lipossomo, coloque o banho de água em 37 graus Celsius. Quando a temperatura estiver estabilizada, adicione 200 microliters de lipossomos carregados de DOX em cada poço de uma placa clara de 96 poços e coloque a placa no banho de água com o fundo submerso na água. Em seguida, ajuste a corrente do sistema laser para 2,27 amperes e coloque o sistema laser colidindo cinco centímetros verticalmente acima da superfície da placa de 96 poços.

Ligue o laser e use uma sonda de temperatura de fibra óptica para monitorar a temperatura uma vez por minuto. Em cinco e 10 minutos, aspire 10 microliters de lipossomos carregados do DOX de cada poço da placa clara de 96 poços e adicione 190 microliters de HBS a três poços individuais de uma placa preta de 96 poços. Para avaliar a liberação completa da droga, misture 10 microlitadores dos lipossomos com 170 microliters de HBS e 20 microliters de 1%Triton X-100 solução detergente em três poços individuais da placa preta de 96 poços.

Em seguida, meça a intensidade de fluorescência do DOX em um leitor de placas. A produção microfluida de LTSL4 resulta em uma solução viscosa semelhante a gel ilustrada pelo grande número de bolhas de ar presas, enquanto a preparação do LTSL10 resulta na formação de um líquido não viscoso claro. A medição dinâmica de dispersão de luz do LTSL10 preparada a 51 graus Celsius demonstra o diâmetro médio Z esperado e a dispersão indicando o sucesso do experimento.

Quando o LTSL10 é preparado a 20 graus Celsius, no entanto, lipossomos maiores e mais dispersos são obtidos resultando em um produto subótimo. LTSLs preparados pelo método convencional de hidratação de filme lipídico com extrusão demonstram uma eficiência de encapsulamento DOX de 50-80%Com o ressarcimento, o LTSL10 preparado por microfluidos resulta em um aumento significativo da eficiência de encapsulamento do DOX para uma média de 85% indicando o sucesso do carregamento remoto do DOX e a presença do gradiente transmembrano pH. O perfil de lançamento do DOX do LTSL10 foi determinado como sensível à temperatura.

O LTSL10 tem uma transição de fase relativamente ampla com início a 41,6 graus Celsius que atinge 42,6 graus Celsius. A eficiência do carregamento de ICG depende da concentração inicial de ICG e do tamanho e dispersão das amostras. Além disso, a irradiação DE ICG LTSL10 com um laser infravermelho próximo induz o aquecimento fototérmico desencadeando a liberação do DOX.

Ao tentar este procedimento, é importante garantir um fluxo de fluido estável de tal forma que a mistura de fluido e, portanto, a formação de lipossomos permaneçam reprodutíveis. A ressarização lipososome e a diálise são dois passos importantes para garantir uma formulação liposama estável com alta capacidade de carregamento. Testes in vivo também podem ser realizados para avaliar a bio-distribuição do LTSL10, liberação de medicamentos e atividade anticancerígena.

Nosso protocolo pode ser usado para a produção microfluida bem sucedida de lipossomos termosensíveis sem colesterol para aplicações de entrega de medicamentos.