A ligação covalente de BMP-2 em superfícies com uma monocamada auto-montada Abordagem

O objetivo geral deste procedimento é ligar covalentemente duas moléculas de BMP às superfícies sem perder sua bioatividade. Isso é feito primeiro formando uma camada de ouro em um substrato por deposição física de vapor. O segundo passo é criar uma monocamada auto-montada de um ligante NHS tiol bifuncional mu NHSA.

Em seguida, RH BMP dois é covalentemente ligado ao vinculante. A etapa final é remover o BMP dois não ligado por sonicação. Em última análise, um ensaio de ligação de anticorpos é usado para mostrar a ligação bem-sucedida do BMP dois nas superfícies e a atividade biológica do BMP dois ligado à superfície é determinada nas células analisando a fosforilação do SMA 1 5 8.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do fator de crescimento, como se a ligação inicial dos fatores de crescimento aos seus receptores na superfície celular é suficiente para desencadear respostas de sinalização. Demonstrando o procedimento estarão dois membros do meu laboratório, Teresa Paul e Elizabeth Schwab. Para iniciar este procedimento, limpe as lamínulas de vidro com lenços de precisão e sonice-as por cinco minutos em uma mistura de acetato de etila e metanol.

Após a sonicação, enxágue os substratos com metanol e seque-os sob fluxo de nitrogênio. Coloque os substratos limpos em um dispositivo de revestimento por pulverização catódica e evacue a câmara. Remova a camada superior de óxido de cromo do alvo de cromo por pulverização catódica por 60 segundos.

Em seguida, cubra o substrato com uma camada de cromo de 10 nanômetros, seguida de revestimento com uma camada de ouro de 40 nanômetros. Quando terminar, remova os substratos dourados da câmara e reserve. Transferir os substratos de ouro para um balão de fundo redondo de dois gargalos e incubá-los num milimolar M-U-N-H-S em DMF à temperatura ambiente durante quatro horas em atmosfera de azoto.

Após a incubação, sonicar os substratos em DMF durante dois minutos. Enxágue-os com DMF e metanol e seque-os sob fluxo de nitrogênio. Diluir a solução-mãe RHB MP dois com um cloreto de sódio molar em PBS para obter uma concentração final de 3,5 microgramas por mililitro.

Ajuste esta solução de trabalho para pH 8,5 com hidróxido de potássio estéril de 10 milimolares imediatamente antes do uso. Coloque o anel A-P-D-M-S em cima da amostra. Transfira o substrato para uma placa de seis poços para garantir que apenas as superfícies do substrato sejam expostas à solução de incubação.

Em seguida, incube os substratos HUNHS funcionalizados com a solução de trabalho RHB MP dois a quatro graus Celsius durante a noite. Depois de remover o sobrenadante de incubação, adicione um cloreto de sódio molar em PBS e sonice os substratos por dois minutos. Quando terminar, lave os substratos três vezes com cloreto de sódio estéril de um molar em PBS para bloquear a absorção inespecífica de anticorpos.

Incube os substratos em 5% BSA em PBS por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, incube os substratos com uma solução de anticorpos anti-BMP dois por uma hora em temperatura ambiente quando terminar, lave os substratos duas vezes com PBS e sonice-os por 30 segundos. Em seguida, incube os substratos em uma solução de anticorpo secundário conjugado com HRP por 30 minutos em temperatura ambiente e depois lave-os duas vezes com PBS.

Use o ensaio amplamente vermelho de gripe para medir a atividade enzimática HRP a 570 nanômetros com uma semente de leitor de placas uma vez 10 elevado à quinta boca C dois C 12 mioblastos por poço em seis placas de poço em meio de crescimento e incube-os por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Uma vez que as placas tenham sido removidas da incubadora, aspire o meio dos poços e deixe as células famintas em DMEM livre de soro por três a cinco horas antes de semear no BMP funcionalizado duas superfícies de substrato para a investigação da indução de sinalização de curto prazo. Substitua o meio por 200 microlitros de DMEM livre de soro fresco e coloque o BMP imobilizado dois substratos acima das células usando uma pinça de ponta fina após a incubação a 37 graus Celsius e 5% de CO2.

Remover os substratos com cuidado e aspirar o meio com uma pipeta. Em seguida, lave as células duas vezes com PBS e prossiga para a análise das respostas celulares usando eletroforese em gel e western blotting para a análise da atividade biológica de longo prazo. Coloque as células nas superfícies conforme descrito anteriormente e cultive-as a 37 graus Celsius e 5% de CO2 em 2% de FBS por seis dias.

Após a incubação. Imageie as células por microscopia de fluorescência para verificar RH BMP, duas superfícies de ligação apresentando RH BMP imobilizado, duas foram incubadas com um BMP dois anticorpos específicos e um anticorpo secundário conjugado com HRP. A superfície imobilizada RH BMP dois ou I BMP dois foi detectada antes e após a estimulação celular.

Aqui é mostrada a ligação bem-sucedida do RH BMP dois à superfície em uma confirmação reconhecida pelo anti BMP dois IgG. A superfície imobilizada RH BMP dois foi quantificada usando o ensaio métrico amli flu red chole e os dados mostram que após a estimulação celular, a proteína ainda foi detectada na superfície As respostas celulares às superfícies que apresentavam RHB MP dois imobilizadas foram avaliadas e comparadas com o efeito de substratos de ouro não tratados. Aqui, C duas células C 12 foram estimuladas por 30 minutos por RHB MP duas superfícies funcionalizadas que se aproximam do topo.

Neste modelo, o BMP two inibe a diferenciação de células em tubos mio multinucleados e induz fenótipos de osteoblastos. A ativação de SMAD 1 5 8, que são repórteres a jusante da via de sinalização BMP dois, é analisada por western blotting, conforme mostrado aqui. A fosforilação de SM é observada após 30 minutos de estimulação por I BMP dois, enquanto nenhuma fosforilação de SMAD 1 58 ocorre em células expostas a amostras de ouro não tratadas.

Este resultado indica que o processo de imobilização não altera a atividade de curto prazo do BMP dois e desencadeia etapas iniciais na sinalização smad para determinar se I BM P dois afeta a diferenciação osteogênica de longo prazo. O nível de expressão da fosfatase alcalina foi investigado por um ensaio métrico de coleção. A atividade da fosfatase alcalina das células C duas C 12 foi medida após incubação das células por seis dias em ouro puro e em IBP duas superfícies.

A atividade da fosfatase alcalina em lisados de células cultivadas em I BM P duas superfícies mostrou uma absorção significativamente maior em comparação com o controle. Este resultado revela que o IBMP dois induz a expressão de fosfatase alcalina em células C dois C 12 para investigar o efeito do IBP dois. Na miogênese C, duas células C 12 foram plaqueadas diretamente em ouro ou em superfícies funcionalizadas e cultivadas em condições de baixo nível sérico.

Após seis dias, a coloração da cadeia pesada da miosina foi realizada conforme mostrado aqui. C duas células C 12 não conseguiram formar miosina cadeia pesada positiva tubos mio na presença de I BM P dois em contraste com as células em substratos de ouro. Após este procedimento, outros métodos, como imobilizar BMP dois em nanopartículas de ouro, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais.

Por exemplo, quanto de BMP dois imobilizado é localmente necessário para desencadear respostas de sinalização com eficiência.