Name: A ligação covalente de BMP-2 em superfícies com uma monocamada auto-montada Abordagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprenda a imobilizar BMP-2 em superfícies através de ligação covalente utilizando monocamadas auto-montadas. Este método preserva a bioatividade da proteína e permite estudar sinalização celular em biologia de fatores de crescimento.

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Agradecemos ao Prof JP Spatz (Departamento de Química Biofísica, da Universidade de Heidelberg e do Departamento de Novos Materiais e Biosystems, do Instituto Max Planck para Sistemas Inteligentes, Stuttgart) por seu apoio gentil. O apoio financeiro do Max-Planck-Gesellschaft ea Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 a EAC-A.) São também reconheceu muito.

1. Síntese de 11-Mercaptoundecanoyl-N-hidroxissuccinimida (NHS-MU) <ol><li> Adicionar gota a gota uma solução de 500 mg de N-hidroxissuccinimida e 30 mg de 4 - (dimetilamino) piridina em 10 ml de acetona (aa) a 1 g de ácido 11-mercaptoundecanóico em 40 ml de diclorometano (aa), à temperatura ambiente (RT). </li><li> Arrefecer a reacção até 0 ° C e adicionar gota a gota 1,1 g de N, N &#39;-diciclohexilcarbodiimida em 10 ml de diclorometano (sob atmosfera de azoto). Manter a reacção a baixa temperatura durante 1 hora e, em seguida, agita-se à TA durante a noite. </li><li> Filtrar o precipitado e secá-lo, sob pressão reduzida. Purifica-se o produto por cromatografia flash com o benzeno de petróleo e acetato de etilo (aa) em uma proporção de 1:1. </li></ol> 2. Preparação de Layers Ouro Homogêneos <ol><li> Lamelas de vidro limpos com toalhetes de precisão e sonicar las durante 5 minutos em uma solução contendo uma mistura de 1:1 de acetato de etilo (pa) e metanol (pa). Rinse substratos com metanol e secar sob fluxo de nitrogênio. </li><li> Colocar os substratos limpos no dispositivo de revestimento por pulverização. Evacuar a câmara. Retirar a camada de óxido de cromo superior da meta de cromo por pulverização catódica para 60 seg. Coloque as amostras debaixo da viga e revesti-los com uma camada de crómio de 10 nm, seguido por revestimento com uma camada de ouro de 40 nm de metal. </li></ol> 3. Imobilização de superfície de BMP-2 <ol><li> Dissolve-MU-NHS em N, N-dimethlyformamide (DMF) a uma concentração final de cerca de 1 mM e incubar substratos de ouro na solução de MU-NHS à TA durante 4 h sob atmosfera de azoto. </li><li> Sonicar superfícies em DMF durante 2 minutos, enxaguar com DMF e MeOH e secar sob fluxo de azoto. </li><li> Prepara-se uma solução estoque de rhBMP-2 em HCl 4 mM estéril com uma concentração de 100 ug / ml (de loja alíquotas a -80 ° C). Para diluições de trabalho (3,5 ug / ml), dilui-se a solução de reserva em PBS / NaCl (PBS contendo 1 M de NaCl) e umdjust para pH 8,5, imediatamente antes de usar. </li><li> Incubar superfícies funcionalizadas MU-NHS na solução de trabalho de rhBMP-2, a 4 ° C durante a noite. Retirar o sobrenadante da incubação. Sonicar superfícies em PBS / NaCl durante 2 min e lavagem 3 x com PBS estéril / NaCl. </li></ol> 4. Superfície Caracterização <ol><li> Para bloquear a adsorção inespecífica do anticorpo, incubar as superfícies com BSA 5% (w / v) em solução de PBS durante 1 hora à temperatura ambiente, seguido por incubação com um anticorpo anti-BMP-2 do anticorpo (a 1:100 em 1% (w / v ) solução de BSA / PBS) durante 1 hora à temperatura ambiente. Lave as superfícies duas vezes com PBS e sonicado por 30 seg. </li><li> Incubar substratos com anticorpo secundário conjugado com HRP (1:1000 em 1% (w v) / solução de BSA / PBS) durante 30 min à temperatura ambiente, em seguida, lavar duas vezes com PBS. </li><li> Use Ampliflu ensaio Vermelho para medir a atividade enzimática HRP a 570 nm com um leitor de placas. </li></ol> 5. Análise da atividade biológica <ol><li> Semente 1 x 10 5 rato mioblastos C2C12 por poço em 6-bem plmados em meio de crescimento, que consiste em um DMEM de glicose elevada contendo piruvato suplementado com 10% FBS, 1% de penicilina / estreptomicina e incubar durante 24 horas a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Starve células em DMEM isento de soro durante 3-5 horas antes da semeadura sobre as superfícies decoradas com imobilizada BMP-2. </li><li> Para efeitos de investigação da indução de sinalização de curto prazo, substituir o meio por 200 ul de DMEM fresco isento de soro e colocar os imobilizadas BMP-2 superfícies superiores das células. A superfície deve ser tratado com pinças de ponta fina para evitar arranhões. </li><li> Remova suavemente superfícies e aspirar o meio com uma pipeta, lavar as células duas vezes com PBS. Continuar a análise das respostas das células. </li><li> Para a análise da actividade biológica de longo prazo, de células de placa sobre as superfícies e cultura los a 37 ° C / 5% de CO 2 em condições de soro baixo (2% de FBS) durante seis dias. </li></ol>

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</ol>

Autores têm nada a revelar.

Neste protocolo, descrevem a preparação de superfícies funcionalizadas com bioactivo rhBMP-2. Esta abordagem compreende dois passos: 1) a formação inicial de uma monocamada auto-montagem (SAM) de um ligante bifuncional sobre a superfície de ouro, 2) de imobilização covalente da proteína de rhBMP-2. Em trabalhos anteriores, que validou a ligação efectiva do ligante bifuncional e o factor de crescimento, e demonstraram que a superfície imobilizada-rhBMP-2 mantém a sua actividade biológica 19. A bioactividade de...

A proteína morfogenética óssea 2 (BMP-2) é um membro do factor de crescimento transformante (TGF-β) familiar e actua como indutor da formação de novo osso, bem como regulador de vários tecidos durante o desenvolvimento embrionário e adulto homeostase 1-3. Cada monómero do biologicamente activo homodimérica proteína BMP-2 contém um motivo &quot;nó de cisteína&quot;, que é altamente conservada em todos os quatro BMPs. Seis dos sete resíduos de cisteína que formam ligações dissulfureto intramoleculares que estabilizam cada monómero, enquanto a sétima cisteína está envolvido na dimerização, formando uma ligação intramolecular entre os dois monómeros de 5,6. Este nó de cisteína altamente conservado define a estrutura tridimensional da proteína BMP-2 e determina as suas propriedades únicas, tais como a resistência ao calor, desnaturantes e ácida de pH 7-9. BMP-2 liga-se a serina / treonina-quinase de receptores transmembranares, induzindo deste modo a transdução de sinal <sup&gt; 10-12. Dependendo do modo de oligomerização do receptor, diferentes vias de sinalização são activados: uma cascata de sinalização Smad-independente leva a indução de fosfatase alcalina através de sinalização de p38, enquanto que uma via dependente de Smad activado pelos resultados da fosforilação do receptor no complexo de Smad translocação nuclear e activação da transcrição de genes-alvo específicos, tais como o inibidor da diferenciação (Id), 12-14. No osso, a BMP-2 induz a diferenciação de células estaminais mesenquimais em osteoblastos, estimulando, assim, a cicatrização e formação de novo de osso. Actualmente, expressa de forma recombinante BMP-2 é aplicada clinicamente para melhorar a cicatrização de sítios fracturados. Uma estratégia comum na engenharia de tecido ósseo é a utilização de factores de crescimento injectáveis, que é menos invasiva em relação aos sistemas de distribuição local. No entanto, estudos in vivo e aplicações clínicas têm demonstrado que a sua meia-vida biológica curta, loc inespecíficazação e rápida de domiciliação de BMP-2 pode levar a vários problemas locais, ectópica e sistêmicas 15. Assim, para obter uma apresentação eficaz, o aprisionamento ou imobilização de BMP-2 no interior de ou sobre materiais é necessário para o seu local de entrega e mantida no local alvo. Entrega sustentada pode ser conseguida com métodos de retenção não covalentes, tais como a retenção física, adsorção ou complexação de iões 16. No entanto, sabe-se que a adsorção não específica de proteínas para as superfícies podem resulta em desnaturação das moléculas de 17. Para a ligação de fatores de crescimento covalente, diferentes tipos de suportes foram desenvolvidos ao longo da última década. A utilização de moléculas de ligação bifuncionais, que se destinam a grupos amino ou carboxilo da proteína, por exemplo, é um tipo de abordagem que não requer, necessariamente, a modificação de proteínas para alcançar a sua imobilização. De facto, enquanto que a modificação de proteínas oferece a vantagem de controlar a orientação da proteína,a introdução dos domínios artificiais, as etiquetas e cadeias peptídicas específicas do local pode alterar a actividade biológica dos factores de crescimento 17. Assim, para contornar a desnaturação devido à interacção com o material de apoio, as superfícies podem ser previamente funcionalizados, por exemplo, com uma monocamada auto-montada (SAM) de uma molécula de ligação, seguido de acoplamento do fator desejado 18. Usámos uma abordagem baseada no SAM para imobilizar covalentemente BMP-2 para uma superfície de direccionamento dos seus resíduos de amina livre e têm mostrado que a proteína imobilizada retém a sua actividade biológica tanto a curto e longo prazo 19. Este protocolo fornece uma maneira simples e eficiente para entregar BMP-2 em células para estudos in vitro sobre os mecanismos que ocorrem na membrana celular e regulam a sinalização intracelular responsável pela sinalização osteogênica.

<table><tbody><tr><td>N-hidroxisuccinimida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>4-(dimetilamino)piridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>522805</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>AplicaçãoChem</td><td>A2282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido 11-mercaptoundecanóico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>674427</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Diclormetano</td><td>Merck</td><td>106050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N,N'-diciclohexilcarbodiimida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D80002</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Benzeno de petróleo</td><td>Merck</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro</td><td>Carl Roth</td><td>M 875</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ethylacetate</td><td>AppliChem</td><td>A3550</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth</td><td>4627</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida</td><td>Carl Roth</td><td>T921</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>R& D Systems</td><td>355-BM</td><td>Sem transportador; expresso em E.coli</td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>HN00.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poli(dimetil siloxano) (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de elastômero de silicone Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-rhBMP-2</td><td>Sigma</td><td>B9553</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-camundongo de cabra IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Ampliflu Red ensaio</td><td>Sigma</td><td>90101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Meio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco (1x), líquido</td><td>Gibco</td><td>41966</td><td>Soro</td></tr><tr><td>Fetal Bovino de Alta Glicose (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>Filtrado estéril, testado em cultura de células</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tripsina 0,05% (1x) com EDTA 4Na</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicina (0,1 M)</td><td>Riedel-de-Ha&euml; n</td><td>33226</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (1%)</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>Tampão de lise (ensaio ALP)19</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl2)(1 mM)</td><td>Carl Roth</td><td>HNO3.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloreto de zinco (ZnCl2) (1 mM)</td><td>Carl Roth</td><td>3533.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p-nitrofenilfosfato (pNPP)</td><td>Sigma</td><td>S0942</td><td>Substrato de fosfatase</td></tr><tr><td>Anti-misina cadeia pesada (MHC)</td><td>Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma, Universidade de Iowa</td><td>MF20</td><td>Anticorpo monoclonal</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 IgG anti-camundongo de cabra</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Equipamento</td></tr><tr><td>Banho Ultrsonic (Sonorex Super RK 102H), Frequência 35 kHz</td><td>BANDELIN electronic GmbH Co. KG</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MED 020 Sistema de revestimento por pulverização catódica</td><td>BAL-TEC AG</td><td></td><td>Condições de revestimento Cr: 120 mA, 1,3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5,0 x 10-2 mbar, 45 seg</td></tr><tr><td>Leitor de placas Tecan Infinite M200</td><td>Tecan</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

a ligação covalente de bmp-2 em superfícies com uma monocamada auto-montada abordagem

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

A proteína morfogenética óssea 2 (BMP-2) é um factor de crescimento incorporados na matriz extracelular do tecido ósseo. BMP-2 atua como gatilho da diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos, estimulando, assim, a cura e formação de osso novo. O uso clínico de humano recombinante BMP-2 (rhBMP-2) em conjunto com andaimes suscitou controvérsias recentes, com base no modo de apresentação e a quantidade a ser entregue. O protocolo aqui apresentado fornece um meio simples e eficaz para entregar a BMP-2 para os estudos in vitro em células. Descrevemos como para formar uma monocamada auto-montada que consiste num ligante heterobifuncional, e mostram o passo de ligação posterior para obter a imobilização covalente de rhBMP-2. Com esta abordagem, é possível conseguir uma apresentação sustentada de BMP-2, enquanto que a manutenção da actividade biológica da proteína. Na verdade, a superfície de imobilização de BMP-2 permite investigações orientadas, impedindo anúncios inespecíficasorption, enquanto reduz a quantidade de factor de crescimento e, mais notavelmente, dificultando a libertação não controlada da superfície. Ambos os eventos de sinalização de curto e longo prazo são desencadeadas por BMP-2 está a ter lugar quando as células são expostas a superfícies que apresentam covalentemente imobilizada a rhBMP-2, tornando esta abordagem adequada para estudos in vitro sobre as respostas celulares a BMP-2 de estimulação.

Em nossa configuração, o ouro foi escolhido como excipiente, uma vez que fornece um sistema biologicamente inespecífica, mas quimicamente ajustável. Além disso, a aplicação de camadas auto-montagem implica muitas vantagens: SAM adsorver espontaneamente através dos seus grupos "cabeça-" sobre metais e monocamadas de formulário com poucos defeitos, enquanto os grupos terminais funcionais pode ser modificado. Assim, eles proporcionam uma plataforma para adaptar as propriedades da interface de um modo ainda altamente adaptá...

Descreve-se um método para realizar a imobilização eficiente de BMP-2 em superfícies. A nossa abordagem é baseada na formação de uma monocamada auto-montada para alcançar a ligação da BMP-2 por meio dos seus resíduos de amina livres covalente. Este método é uma ferramenta útil para o estudo de sinalização na membrana celular.

A ligação covalente de BMP-2 em superfícies com uma monocamada auto-montada Abordagem

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

O objetivo geral deste procedimento é ligar covalentemente duas moléculas de BMP às superfícies sem perder sua bioatividade. Isso é feito primeiro formando uma camada de ouro em um substrato por deposição física de vapor. O segundo passo é criar uma monocamada auto-montada de um ligante NHS tiol bifuncional mu NHSA.Em seguida, RH BMP dois é covalentemente ligado ao vinculante. A etapa final é remover o BMP dois não ligado por sonicação. Em última análise, um ensaio de ligação de anticorpos é usado para mostrar a ligação bem-sucedida do BMP dois nas superfícies e a atividade biológica do BMP dois ligado à superfície é determinada nas células analisando a fosforilação do SMA 1 5 8.Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do fator de crescimento, como se a ligação inicial dos fatores de crescimento aos seus receptores na superfície celular é suficiente para desencadear respostas de sinalização. Demonstrando o procedimento estarão dois membros do meu laboratório, Teresa Paul e Elizabeth Schwab. Para iniciar este procedimento, limpe as lamínulas de vidro com lenços de precisão e sonice-as por cinco minutos em uma mistura de acetato de etila e metanol.Apó

covalent-binding-bmp-2-on-surfaces-using-self-assembled-monolayer

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Aqui nós mostramos como usar Assay Proximidade Ligadura (PLA), com uma combinação de anticorpos para visualizar proteínas morfogenéticas ósseas (BMP) de sinalização em células fixas. Esta técnica permitiu-nos a seguir o acúmulo nuclear de BMP activada endógena efetoras complexos e quantificar os seus níveis ao longo do tempo sob BMP4 estimulação.

Detecção de Sinalização de Efeitos Complexos Downstream de BMP4 Usando In situ PLA, um Ensaio Ligadura Proximidade

&lt; class = 'jove_content '&gt; Um protocolo para acoplar uma grande variedade de moléculas individuais covalentemente em uma ponta AFM é apresentado. Procedimentos e exemplos para determinar a força de adesão e a energia livre dessas moléculas em suportes sólidos e bio-interfaces são fornecidos.

Investigando única molécula de adesão de Força Atômica Spectroscopy

Descrevemos a fabricação e caracterização de sistemas nanobiológicos fazendo interface com substratos nanoestruturados com proteínas imobilizadas e aptâmeros. As etapas experimentais relevantes envolvendo a fabricação litográfica de substratos nanoestruturados, biofuncionalização e caracterização de espectroscopia Raman aprimorada por superfície (SERS) são relatadas. A detecção SERS de proteínas imobilizadas na superfície e a sondagem da ligação proteína-ligante e aptâmero-ligante são...

Superfície reforçada Raman Detection Espectroscopia de Biomoléculas Usando EBL Fabricadas Nanoestruturados Substratos

Apresenta-se um protocolo para funcionalizar vidro com manchas proteicas nanométricas rodeado por uma bicamada lipídica fluida. Estes substratos são compatíveis com microscopia óptica avançado e espera-se para servir como plataforma para estudos de adesão celular e de migração.

Matrizes ligando Nano-fragmentação em uma bicamada lipídica Compatível

Biomateriais dopados com 2 de Proteína morfogenética óssea (BMP2) utilizaram-se como uma nova estratégia terapêutica para curar fraturas não-união óssea. Para superar os efeitos secundários resultantes de uma incontrolável liberação do fator, propomos uma nova estratégia para o site-imobilizar diretamente o fator, criando assim materiais com capacidade osteogênica melhorada.

Imobilização local-dirigido da Proteína morfogenética óssea 2 para superfícies sólidas pela química do clique

Este protocolo descreve a imobilização covalente de proteínas com um heterobifunctional agente de acoplamento silano para superfícies de óxido de silício projetado para a espectroscopia de força força atômica microscopia com base única molécula que é exemplificado a interação de RrgA (adesina pilus-1 ponta de S. pneumoniae) com fibronectina.

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

A fixação covalente de moléculas de sondas às pontas de cantilever da microscopia de força atômica (AFM) é uma técnica essencial para a investigação de suas propriedades físicas. Isso nos permite determinar a força de alongamento, a força de dessorção e o comprimento dos polímeros através da espectroscopia de força de molécula única baseada em AFM com alta reprodutibilidade.

Ligação covalente de moléculas únicas para espectroscopia de força baseada em AFM

Uma sonda de força biomembrana (BFP) é uma técnica in situ dynamic force spectroscopy (DFS). O BFP pode ser usado para medir a constante de mola das interações moleculares em células vivas. Este protocolo apresenta análises constantes de mola para ligações moleculares detectadas pela BFP.

Análise constante da mola molecular por espectroscopia da sonda de força biomembrana

Quando as proteínas precursoras do Fator de Crescimento Transformador são expressas em embriões xenopus laevis, elas escurecem, são cortadas e são secretadas na blastocoele, que começa no final da blastula até o estágio gastrula inicial. Descrevemos um método para aspirar produtos de decote da cavidade blastocoele para análise de imunoblot.

Análise do Fator de Crescimento Transformador ß Produtos de Decote Familiar Secretados Na Blastocoele de Embriões Xenopus laevis

Um modelo in vitro do nicho vascular da medula óssea é estabelecido pela semeadura de células mesenquimais e endoteliais em hidrogéis pré-moldados de PEG 3D. As redes endoteliais, os componentes da MEC e a atividade da FA dos nichos variam dependendo do fator de crescimento utilizado. A plataforma pode ser usada para modelos avançados de câncer.

Estabelecimento simples de um nicho osteogênico vascularizado da medula óssea usando hidrogéis pré-moldados de poli(etilenoglicol) (PEG) em uma microplaca de imagem

Um protocolo para a síntese e caracterização de monocamadas de estrutura metal-orgânica automontadas é fornecido usando cristais de estrutura metal-orgânica (MOF) enxertados com polímero. O procedimento mostra que as partículas MOF enxertadas com polímero podem ser automontadas em uma interface ar-água, resultando em estruturas monocamada bem formadas e independentes, conforme evidenciado por imagens de microscopia eletrônica de varredura.

Síntese e caracterização de monocamadas de estrutura metal-orgânica automontadas usando partículas revestidas com polímero

Aprenda a imobilizar BMP-2 em superfícies através de ligação covalente utilizando monocamadas auto-montadas. Este método preserva a bioatividade da proteína e permite estudar sinalização celular em biologia de fatores de crescimento.

A ligação covalente de BMP-2 em superfícies com uma monocamada auto-montada Abordagem

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