Name: A ligação covalente de BMP-2 em superfícies com uma monocamada auto-montada Abordagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprenda a imobilizar BMP-2 em superfícies através de ligação covalente utilizando monocamadas auto-montadas. Este método preserva a bioatividade da proteína e permite estudar sinalização celular em biologia de fatores de crescimento.

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Agradecemos ao Prof JP Spatz (Departamento de Química Biofísica, da Universidade de Heidelberg e do Departamento de Novos Materiais e Biosystems, do Instituto Max Planck para Sistemas Inteligentes, Stuttgart) por seu apoio gentil. O apoio financeiro do Max-Planck-Gesellschaft ea Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 a EAC-A.) São também reconheceu muito.

1. Síntese de 11-Mercaptoundecanoyl-N-hidroxissuccinimida (NHS-MU) <ol><li> Adicionar gota a gota uma solução de 500 mg de N-hidroxissuccinimida e 30 mg de 4 - (dimetilamino) piridina em 10 ml de acetona (aa) a 1 g de ácido 11-mercaptoundecanóico em 40 ml de diclorometano (aa), à temperatura ambiente (RT). </li><li> Arrefecer a reacção até 0 ° C e adicionar gota a gota 1,1 g de N, N &#39;-diciclohexilcarbodiimida em 10 ml de diclorometano (sob atmosfera de azoto). Manter a reacção a baixa temperatura durante 1 hora e, em seguida, agita-se à TA durante a noite. </li><li> Filtrar o precipitado e secá-lo, sob pressão reduzida. Purifica-se o produto por cromatografia flash com o benzeno de petróleo e acetato de etilo (aa) em uma proporção de 1:1. </li></ol> 2. Preparação de Layers Ouro Homogêneos <ol><li> Lamelas de vidro limpos com toalhetes de precisão e sonicar las durante 5 minutos em uma solução contendo uma mistura de 1:1 de acetato de etilo (pa) e metanol (pa). Rinse substratos com metanol e secar sob fluxo de nitrogênio. </li><li> Colocar os substratos limpos no dispositivo de revestimento por pulverização. Evacuar a câmara. Retirar a camada de óxido de cromo superior da meta de cromo por pulverização catódica para 60 seg. Coloque as amostras debaixo da viga e revesti-los com uma camada de crómio de 10 nm, seguido por revestimento com uma camada de ouro de 40 nm de metal. </li></ol> 3. Imobilização de superfície de BMP-2 <ol><li> Dissolve-MU-NHS em N, N-dimethlyformamide (DMF) a uma concentração final de cerca de 1 mM e incubar substratos de ouro na solução de MU-NHS à TA durante 4 h sob atmosfera de azoto. </li><li> Sonicar superfícies em DMF durante 2 minutos, enxaguar com DMF e MeOH e secar sob fluxo de azoto. </li><li> Prepara-se uma solução estoque de rhBMP-2 em HCl 4 mM estéril com uma concentração de 100 ug / ml (de loja alíquotas a -80 ° C). Para diluições de trabalho (3,5 ug / ml), dilui-se a solução de reserva em PBS / NaCl (PBS contendo 1 M de NaCl) e umdjust para pH 8,5, imediatamente antes de usar. </li><li> Incubar superfícies funcionalizadas MU-NHS na solução de trabalho de rhBMP-2, a 4 ° C durante a noite. Retirar o sobrenadante da incubação. Sonicar superfícies em PBS / NaCl durante 2 min e lavagem 3 x com PBS estéril / NaCl. </li></ol> 4. Superfície Caracterização <ol><li> Para bloquear a adsorção inespecífica do anticorpo, incubar as superfícies com BSA 5% (w / v) em solução de PBS durante 1 hora à temperatura ambiente, seguido por incubação com um anticorpo anti-BMP-2 do anticorpo (a 1:100 em 1% (w / v ) solução de BSA / PBS) durante 1 hora à temperatura ambiente. Lave as superfícies duas vezes com PBS e sonicado por 30 seg. </li><li> Incubar substratos com anticorpo secundário conjugado com HRP (1:1000 em 1% (w v) / solução de BSA / PBS) durante 30 min à temperatura ambiente, em seguida, lavar duas vezes com PBS. </li><li> Use Ampliflu ensaio Vermelho para medir a atividade enzimática HRP a 570 nm com um leitor de placas. </li></ol> 5. Análise da atividade biológica <ol><li> Semente 1 x 10 5 rato mioblastos C2C12 por poço em 6-bem plmados em meio de crescimento, que consiste em um DMEM de glicose elevada contendo piruvato suplementado com 10% FBS, 1% de penicilina / estreptomicina e incubar durante 24 horas a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Starve células em DMEM isento de soro durante 3-5 horas antes da semeadura sobre as superfícies decoradas com imobilizada BMP-2. </li><li> Para efeitos de investigação da indução de sinalização de curto prazo, substituir o meio por 200 ul de DMEM fresco isento de soro e colocar os imobilizadas BMP-2 superfícies superiores das células. A superfície deve ser tratado com pinças de ponta fina para evitar arranhões. </li><li> Remova suavemente superfícies e aspirar o meio com uma pipeta, lavar as células duas vezes com PBS. Continuar a análise das respostas das células. </li><li> Para a análise da actividade biológica de longo prazo, de células de placa sobre as superfícies e cultura los a 37 ° C / 5% de CO 2 em condições de soro baixo (2% de FBS) durante seis dias. </li></ol>

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</ol>

Autores têm nada a revelar.

Neste protocolo, descrevem a preparação de superfícies funcionalizadas com bioactivo rhBMP-2. Esta abordagem compreende dois passos: 1) a formação inicial de uma monocamada auto-montagem (SAM) de um ligante bifuncional sobre a superfície de ouro, 2) de imobilização covalente da proteína de rhBMP-2. Em trabalhos anteriores, que validou a ligação efectiva do ligante bifuncional e o factor de crescimento, e demonstraram que a superfície imobilizada-rhBMP-2 mantém a sua actividade biológica 19. A bioactividade de...

A proteína morfogenética óssea 2 (BMP-2) é um membro do factor de crescimento transformante (TGF-β) familiar e actua como indutor da formação de novo osso, bem como regulador de vários tecidos durante o desenvolvimento embrionário e adulto homeostase 1-3. Cada monómero do biologicamente activo homodimérica proteína BMP-2 contém um motivo &quot;nó de cisteína&quot;, que é altamente conservada em todos os quatro BMPs. Seis dos sete resíduos de cisteína que formam ligações dissulfureto intramoleculares que estabilizam cada monómero, enquanto a sétima cisteína está envolvido na dimerização, formando uma ligação intramolecular entre os dois monómeros de 5,6. Este nó de cisteína altamente conservado define a estrutura tridimensional da proteína BMP-2 e determina as suas propriedades únicas, tais como a resistência ao calor, desnaturantes e ácida de pH 7-9. BMP-2 liga-se a serina / treonina-quinase de receptores transmembranares, induzindo deste modo a transdução de sinal <sup&gt; 10-12. Dependendo do modo de oligomerização do receptor, diferentes vias de sinalização são activados: uma cascata de sinalização Smad-independente leva a indução de fosfatase alcalina através de sinalização de p38, enquanto que uma via dependente de Smad activado pelos resultados da fosforilação do receptor no complexo de Smad translocação nuclear e activação da transcrição de genes-alvo específicos, tais como o inibidor da diferenciação (Id), 12-14. No osso, a BMP-2 induz a diferenciação de células estaminais mesenquimais em osteoblastos, estimulando, assim, a cicatrização e formação de novo de osso. Actualmente, expressa de forma recombinante BMP-2 é aplicada clinicamente para melhorar a cicatrização de sítios fracturados. Uma estratégia comum na engenharia de tecido ósseo é a utilização de factores de crescimento injectáveis, que é menos invasiva em relação aos sistemas de distribuição local. No entanto, estudos in vivo e aplicações clínicas têm demonstrado que a sua meia-vida biológica curta, loc inespecíficazação e rápida de domiciliação de BMP-2 pode levar a vários problemas locais, ectópica e sistêmicas 15. Assim, para obter uma apresentação eficaz, o aprisionamento ou imobilização de BMP-2 no interior de ou sobre materiais é necessário para o seu local de entrega e mantida no local alvo. Entrega sustentada pode ser conseguida com métodos de retenção não covalentes, tais como a retenção física, adsorção ou complexação de iões 16. No entanto, sabe-se que a adsorção não específica de proteínas para as superfícies podem resulta em desnaturação das moléculas de 17. Para a ligação de fatores de crescimento covalente, diferentes tipos de suportes foram desenvolvidos ao longo da última década. A utilização de moléculas de ligação bifuncionais, que se destinam a grupos amino ou carboxilo da proteína, por exemplo, é um tipo de abordagem que não requer, necessariamente, a modificação de proteínas para alcançar a sua imobilização. De facto, enquanto que a modificação de proteínas oferece a vantagem de controlar a orientação da proteína,a introdução dos domínios artificiais, as etiquetas e cadeias peptídicas específicas do local pode alterar a actividade biológica dos factores de crescimento 17. Assim, para contornar a desnaturação devido à interacção com o material de apoio, as superfícies podem ser previamente funcionalizados, por exemplo, com uma monocamada auto-montada (SAM) de uma molécula de ligação, seguido de acoplamento do fator desejado 18. Usámos uma abordagem baseada no SAM para imobilizar covalentemente BMP-2 para uma superfície de direccionamento dos seus resíduos de amina livre e têm mostrado que a proteína imobilizada retém a sua actividade biológica tanto a curto e longo prazo 19. Este protocolo fornece uma maneira simples e eficiente para entregar BMP-2 em células para estudos in vitro sobre os mecanismos que ocorrem na membrana celular e regulam a sinalização intracelular responsável pela sinalização osteogênica.

<table><tbody><tr><td>N-hidroxisuccinimida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>4-(dimetilamino)piridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>522805</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>AplicaçãoChem</td><td>A2282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido 11-mercaptoundecanóico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>674427</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Diclormetano</td><td>Merck</td><td>106050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N,N'-diciclohexilcarbodiimida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D80002</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Benzeno de petróleo</td><td>Merck</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro</td><td>Carl Roth</td><td>M 875</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ethylacetate</td><td>AppliChem</td><td>A3550</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth</td><td>4627</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida</td><td>Carl Roth</td><td>T921</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>R& D Systems</td><td>355-BM</td><td>Sem transportador; expresso em E.coli</td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>HN00.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poli(dimetil siloxano) (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de elastômero de silicone Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-rhBMP-2</td><td>Sigma</td><td>B9553</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-camundongo de cabra IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Ampliflu Red ensaio</td><td>Sigma</td><td>90101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Meio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco (1x), líquido</td><td>Gibco</td><td>41966</td><td>Soro</td></tr><tr><td>Fetal Bovino de Alta Glicose (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>Filtrado estéril, testado em cultura de células</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tripsina 0,05% (1x) com EDTA 4Na</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicina (0,1 M)</td><td>Riedel-de-Ha&euml; n</td><td>33226</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (1%)</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>Tampão de lise (ensaio ALP)19</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl2)(1 mM)</td><td>Carl Roth</td><td>HNO3.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloreto de zinco (ZnCl2) (1 mM)</td><td>Carl Roth</td><td>3533.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p-nitrofenilfosfato (pNPP)</td><td>Sigma</td><td>S0942</td><td>Substrato de fosfatase</td></tr><tr><td>Anti-misina cadeia pesada (MHC)</td><td>Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma, Universidade de Iowa</td><td>MF20</td><td>Anticorpo monoclonal</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 IgG anti-camundongo de cabra</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Equipamento</td></tr><tr><td>Banho Ultrsonic (Sonorex Super RK 102H), Frequência 35 kHz</td><td>BANDELIN electronic GmbH Co. KG</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MED 020 Sistema de revestimento por pulverização catódica</td><td>BAL-TEC AG</td><td></td><td>Condições de revestimento Cr: 120 mA, 1,3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5,0 x 10-2 mbar, 45 seg</td></tr><tr><td>Leitor de placas Tecan Infinite M200</td><td>Tecan</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

a ligação covalente de bmp-2 em superfícies com uma monocamada auto-montada abordagem

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

A proteína morfogenética óssea 2 (BMP-2) é um factor de crescimento incorporados na matriz extracelular do tecido ósseo. BMP-2 atua como gatilho da diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos, estimulando, assim, a cura e formação de osso novo. O uso clínico de humano recombinante BMP-2 (rhBMP-2) em conjunto com andaimes suscitou controvérsias recentes, com base no modo de apresentação e a quantidade a ser entregue. O protocolo aqui apresentado fornece um meio simples e eficaz para entregar a BMP-2 para os estudos in vitro em células. Descrevemos como para formar uma monocamada auto-montada que consiste num ligante heterobifuncional, e mostram o passo de ligação posterior para obter a imobilização covalente de rhBMP-2. Com esta abordagem, é possível conseguir uma apresentação sustentada de BMP-2, enquanto que a manutenção da actividade biológica da proteína. Na verdade, a superfície de imobilização de BMP-2 permite investigações orientadas, impedindo anúncios inespecíficasorption, enquanto reduz a quantidade de factor de crescimento e, mais notavelmente, dificultando a libertação não controlada da superfície. Ambos os eventos de sinalização de curto e longo prazo são desencadeadas por BMP-2 está a ter lugar quando as células são expostas a superfícies que apresentam covalentemente imobilizada a rhBMP-2, tornando esta abordagem adequada para estudos in vitro sobre as respostas celulares a BMP-2 de estimulação.

Em nossa configuração, o ouro foi escolhido como excipiente, uma vez que fornece um sistema biologicamente inespecífica, mas quimicamente ajustável. Além disso, a aplicação de camadas auto-montagem implica muitas vantagens: SAM adsorver espontaneamente através dos seus grupos "cabeça-" sobre metais e monocamadas de formulário com poucos defeitos, enquanto os grupos terminais funcionais pode ser modificado. Assim, eles proporcionam uma plataforma para adaptar as propriedades da interface de um modo ainda altamente adaptá...

Descreve-se um método para realizar a imobilização eficiente de BMP-2 em superfícies. A nossa abordagem é baseada na formação de uma monocamada auto-montada para alcançar a ligação da BMP-2 por meio dos seus resíduos de amina livres covalente. Este método é uma ferramenta útil para o estudo de sinalização na membrana celular.

A ligação covalente de BMP-2 em superfícies com uma monocamada auto-montada Abordagem

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

O objetivo geral deste procedimento é ligar covalentemente duas moléculas de BMP às superfícies sem perder sua bioatividade. Isso é feito primeiro formando uma camada de ouro em um substrato por deposição física de vapor. O segundo passo é criar uma monocamada auto-montada de um ligante NHS tiol bifuncional mu NHSA.Em seguida, RH BMP dois é covalentemente ligado ao vinculante. A etapa final é remover o BMP dois não ligado por sonicação. Em última análise, um ensaio de ligação de anticorpos é usado para mostrar a ligação bem-sucedida do BMP dois nas superfícies e a atividade biológica do BMP dois ligado à superfície é determinada nas células analisando a fosforilação do SMA 1 5 8.Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do fator de crescimento, como se a ligação inicial dos fatores de crescimento aos seus receptores na superfície celular é suficiente para desencadear respostas de sinalização. Demonstrando o procedimento estarão dois membros do meu laboratório, Teresa Paul e Elizabeth Schwab. Para iniciar este procedimento, limpe as lamínulas de vidro com lenços de precisão e sonice-as por cinco minutos em uma mistura de acetato de etila e metanol.Após a sonicação, enxágue os substratos com metanol e seque-os sob fluxo de nitrogênio. Coloque os substratos limpos em um dispositivo de revestimento por pulverização catódica e evacue a câmara. Remova a camada superior de óxido de cromo do alvo de cromo por pulverização catódica por 60 segundos.Em seguida, cubra o substrato com uma camada de cromo de 10 nanômetros, seguida de revestimento com uma camada de ouro de 40 nanômetros. Quando terminar, remova os substratos dourados da câmara e reserve. Transferir os substratos de ouro para um balão de fundo redondo de dois gargalos e incubá-los num milimolar M-U-N-H-S em DMF à temperatura ambiente durante quatro horas em atmosfera de azoto.Após a incubação, sonicar os substratos em DMF durante dois minutos. Enxágue-os com DMF e metanol e seque-os sob fluxo de nitrogênio. Diluir a solução-mãe RHB MP dois com um cloreto de sódio molar em PBS para obter uma concentração final de 3,5 microgramas por mililitro.Ajuste esta solução de trabalho para pH 8,5 com hidróxido de potássio estéril de 10 milimolares imediatamente antes do uso. Coloque o anel A-P-D-M-S em cima da amostra. Transfira o substrato para uma placa de seis poços para garantir que apenas as superfícies do substrato sejam expostas à solução de incubação.Em seguida, incube os substratos HUNHS funcionalizados com a solução de trabalho RHB MP dois a quatro graus Celsius durante a noite. Depois de remover o sobrenadante de incubação, adicione um cloreto de sódio molar em PBS e sonice os substratos por dois minutos. Quando terminar, lave os substratos três vezes com cloreto de sódio estéril de um molar em PBS para bloquear a absorção inespecífica de anticorpos.Incube os substratos em 5% BSA em PBS por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, incube os substratos com uma solução de anticorpos anti-BMP dois por uma hora em temperatura ambiente quando terminar, lave os substratos duas vezes com PBS e sonice-os por 30 segundos. Em seguida, incube os substratos em uma solução de anticorpo secundário conjugado com HRP por 30 minutos em temperatura ambiente e depois lave-os duas vezes com PBS.Use o ensaio amplamente vermelho de gripe para medir a atividade enzimática HRP a 570 nanômetros com uma semente de leitor de placas uma vez 10 elevado à quinta boca C dois C 12 mioblastos por poço em seis placas de poço em meio de crescimento e incube-os por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Uma vez que as placas tenham sido removidas da incubadora, aspire o meio dos poços e deixe as células famintas em DMEM livre de soro por três a cinco horas antes de semear no BMP funcionalizado duas superfícies de substrato para a investigação da indução de sinalização de curto prazo. Substitua o meio por 200 microlitros de DMEM livre de soro fresco e coloque o BMP imobilizado dois substratos acima das células usando uma pinça de ponta fina após a incubação a 37 graus Celsius e 5% de CO2.Remover os substratos com cuidado e aspirar o meio com uma pipeta. Em seguida, lave as células duas vezes com PBS e prossiga para a análise das respostas celulares usando eletroforese em gel e western blotting para a análise da atividade biológica de longo prazo. Coloque as células nas superfícies conforme descrito anteriormente e cultive-as a 37 graus Celsius e 5% de CO2 em 2% de FBS por seis dias.Após a incubação. Imageie as células por microscopia de fluorescência para verificar RH BMP, duas superfícies de ligação apresentando RH BMP imobilizado, duas foram incubadas com um BMP dois anticorpos específicos e um anticorpo secundário conjugado com HRP. A superfície imobilizada RH BMP dois ou I BMP dois foi detectada antes e após a estimulação celular.Aqui é mostrada a ligação bem-sucedida do RH BMP dois à superfície em uma confirmação reconhecida pelo anti BMP dois IgG. A superfície imobilizada RH BMP dois foi quantificada usando o ensaio métrico amli flu red chole e os dados mostram que após a estimulação celular, a proteína ainda foi detectada na superfície As respostas celulares às superfícies que apresentavam RHB MP dois imobilizadas foram avaliadas e comparadas com o efeito de substratos de ouro não tratados. Aqui, C duas células C 12 foram estimuladas por 30 minutos por RHB MP duas superfícies funcionalizadas que se aproximam do topo.Neste modelo, o BMP two inibe a diferenciação de células em tubos mio multinucleados e induz fenótipos de osteoblastos. A ativação de SMAD 1 5 8, que são repórteres a jusante da via de sinalização BMP dois, é analisada por western blotting, conforme mostrado aqui. A fosforilação de SM é observada após 30 minutos de estimulação por I BMP dois, enquanto nenhuma fosforilação de SMAD 1 58 ocorre em células expostas a amostras de ouro não tratadas.Este resultado indica que o processo de imobilização não altera a atividade de curto prazo do BMP dois e desencadeia etapas iniciais na sinalização smad para determinar se I BM P dois afeta a diferenciação osteogênica de longo prazo. O nível de expressão da fosfatase alcalina foi investigado por um ensaio métrico de coleção. A atividade da fosfatase alcalina das células C duas C 12 foi medida após incubação das células por seis dias em ouro puro e em IBP duas superfícies.A atividade da fosfatase alcalina em lisados de células cultivadas em I BM P duas superfícies mostrou uma absorção significativamente maior em comparação com o controle. Este resultado revela que o IBMP dois induz a expressão de fosfatase alcalina em células C dois C 12 para investigar o efeito do IBP dois. Na miogênese C, duas células C 12 foram plaqueadas diretamente em ouro ou em superfícies funcionalizadas e cultivadas em condições de baixo nível sérico.Após seis dias, a coloração da cadeia pesada da miosina foi realizada conforme mostrado aqui. C duas células C 12 não conseguiram formar miosina cadeia pesada positiva tubos mio na presença de I BM P dois em contraste com as células em substratos de ouro. Após este procedimento, outros métodos, como imobilizar BMP dois em nanopartículas de ouro, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais.Por exemplo, quanto de BMP dois imobilizado é localmente necessário para desencadear respostas de sinalização com eficiência.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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Antifouling monocamadas auto-organizadas em Microeletrodos de Biomoléculas Patterning

Aqui nós mostramos como usar Assay Proximidade Ligadura (PLA), com uma combinação de anticorpos para visualizar proteínas morfogenéticas ósseas (BMP) de sinalização em células fixas. Esta técnica permitiu-nos a seguir o acúmulo nuclear de BMP activada endógena efetoras complexos e quantificar os seus níveis ao longo do tempo sob BMP4 estimulação.

Detecção de Sinalização de Efeitos Complexos Downstream de BMP4 Usando In situ PLA, um Ensaio Ligadura Proximidade

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A ligação covalente de BMP-2 em superfícies com uma monocamada auto-montada Abordagem

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